テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイ<em&gt;アフリカツメガエル</em

サマリー

アフリカツメガエルのオタマジャクシは黒/白のタンクの白側水泳を好むツメガエル 。この現象は、それらの視覚によって案内される。この動作に基づいて、我々はオタマジャクシの視覚機能をテストするための簡単​​な分析を提示する。

要約

カエルのオタマジャクシにおける視覚機能の測定は、 アフリカツメガエル 、生きた動物で失明のためのスクリーニングが可能となる。視運動性応答は試験した全ての脊椎動物で観察されている視覚ベース、反射的な動作です。従ってテールフリップ応答が微妙応答を記録するための訓練を受けた技術者を必要とする別の尺度として使用したオタマジャクシの目が小さい。私たちは、オタマジャクシは黒と白の両サイドにタンク内に置かれたとき、タンクの白い側に泳ぐことを好むという事実に基づいて、代替行動アッセイを開発した。ここで紹介するアッセイは、容易に測定された応答を作成し、安価な、簡単な代替手段です。セットアップは、ほとんどのアフリカツメガエルの研究室で容易に利用可能、三脚、ウェブカメラと、ネストされたテスト用のタンクで構成されています。この記事では、前と視神経を切断した後、オタマジャクシの挙動を示すのムービーが含まれています。片目の機能をテストするために、我々はまた、REPREを含むそれぞれの目には連続した日に、網膜軸索切断を受けているオタマジャクシのsentative結果。今後の研究では、一度に多くのオタマジャクシのビジョンをテストするためにこのアッセイの自動化されたバージョンを開発することもできます。

概要

アフリカツメガエルは、眼の形成を研究するためのモデル生物として用いられてきた。目はビジュアル開発と機能に影響を与える遺伝子または経路をテストするための一週間も経たないうちに満期まで成長し、急速に開発しています。視覚機能をテストするには、視運動と微細運動応答は、それぞれ^1,2、ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのオタマジャクシで使用されている。 アフリカツメガエルのオタマジャクシの目はゼブラフィッシュよりも比較的小さいので、このアッセイは、 アフリカツメガエルの微妙なテールフリップと眼球運動の挙動を検出するために、特殊な装置を使用し、訓練された人材を必要とします。 アフリカツメガエルにおけるより堅牢な動作がここに記述されている^3、白背景、とのタンクで泳ぐための好みです。半分黒/ハーフ白タンクにオタマジャクシを配置するときに、事前に変成オタマジャクシはすぐにタンクの白側に泳ぐ。我々は以前、多能性細胞由来かどうかを判断するためにこのアッセイを使用目は⁴機能的であった。ここでは、変態前のアフリカツメガエルのオタマジャクシの視覚機能をテストするために使用され得るこのアッセイの詳細なバージョンを、報告する。

それだけで、ほとんどのアフリカツメガエルの研究室で発見搭載したデジタルビデオカメラ、デジタルカメラのソフトウェアや標準的な装置を必要とするので、このアッセイは、微細運動応答アッセイよりも簡単である。また、記録された応答は、集計結果に特別なトレーニングを必要としません。当社の代表的な結果は、二重の網膜軸索切断を受けたオタマジャクシの同じグループは、タンクの周りにランダムに泳ぐことを示している。また、片方の眼は、視覚的応答を試験することができる方法を示す、代表的なオタマジャクシから行動アッセイの結果が含まれている。アッセイの間に取得された数値が挿入され、分析することができるようにワークシートが含まれている。このワークシートは、試験したオタマジャクシは、視覚的応答を有するか否かを決定するために使用することができる。

プロトコル

動物ケア

アフリカツメガエルは、本研究で用いたオタマジャクシがアップステート医科大学動物実験委員会および実験動物の管理と使用に関する指針によって承認された手順に従って上昇し、治療、成長させたツメガエル 。

1前の行動セットアップ：オタマジャクシ

1. 市販のソースから受精アフリカツメガエル胚を入手するか、以前に記載したように^、6 in vitroで 、卵母細胞を受精。
2. 20のKCl;; 20のCaCl _2、50mMのHEPES 0.1X MMR [10×Marcの修正リンゲル（MMR）は、溶液の在庫（10 mMのMgCl _2を含む60ミリメートルペトリ皿に18˚Cで神経板期胚への胞胚を置く。 1 MのNaCl、50μg/ mlのゲンタマイシン抗生物質]）、pH7.5に調整し、オートクレーブにかけ、室温で保存した。毎日0.1X MMRを変更し、デッド胚を削除します。
3. 胚はNieuwkoopとフェーバー段階に到達したら〜27から30 ^7、目を切り替える抗生物質なしの0.1X MMRへのE胚腸細菌の増殖を可能とする。
4. 彼らは供給ステージ（ステージ45）に到達するまで、オタマジャクシを育て、0.1X MMRで満たさ100ミリメートルペトリ皿に移動します。介入の日に0.1X MMRを変える、一週間、一日おきに、彼らにイラクサ粉末上清フィード。
5. 100ミリメートルペトリ皿中の1週間後、カエルの水で満たされた半ガロンのタンクに動物を移動し、[0.5グラム/ Lの瞬間、海と2 mMリン酸ナトリウム二塩基性（のNa ₂ HPO _4：141.96 MW）のpH 6.8]。ステップ2.4​​のように、彼らを養うが、水が濁っている場合には、水を週に2〜3回だけを変更してください。ライトは6時にオンにして、12時間のlight/12明暗サイクルで動物を維持する。
6. 試験前に、少なくとも12時間、O / N、実験台のアンダーパッドのような白い表面の試験対象と半ガロンタンクを配置します。
7. ステージ45から50の試験オタマジャクシは以下の手順3で説明。

2前行動セットアップ：技術設備T

1. 行動分析のための実験室の面積を取っておく。これは、標準的な蛍光灯の静かな、低トラフィックエリアである必要があります。
2. 動物のためのテストタンクを準備します。
   ネストされた、半ガロン試験槽は2つの部分から構成されています。水やオタマジャクシを開催する内槽;および視覚刺激と外槽。
   1. 内槽の場合は、シャーピー、一番下から5cmと外側の角に小さなマークを作る。これは水ライン（ 図1A、緑の点線）である。
   2. また、内槽のために、シルガードエラストマーのような不活性化合物と（コーナーと中央）タンク内のdivetsを埋める。注：これらは記入されていない場合は、オタマジャクシは、これらの分野に残るでしょう
   3. 外槽の場合は、1黒い絶縁テープでタンクと白のティッシュペーパー図1Bとの残りの半分の外のちょうど半分をカバーしています。
3. 上のタンクを配置ターンテーブルを接種する。
4. セットアップウェブカメラ/三脚には、テスト用のタンクの上になるように。 図1Cに示すように、検査部位の視覚化を可能にするようにカメラを調整する。
5. ^5をインストールしたQuickTime PlayerソフトウェアでコンピュータにWebカメラを接続してください。カメラの電源を入れます。 QuickTime Playerのでは、ファイルの下に、「新しい動画撮影を。」を選択行動分析のセットアップがすぐにコンピュータ上で表示されます。
6. オタマジャクシ動作に影響を与える可能性があり、外部の合図を低減、ならびに、水の表面での反射光を低減するためにセットアップ全体にわたって軽量綿布ドレープ。
7. 35〜50のCD / m ²で布措置に基づく輝度いることを確認してください。

3。行動アッセイ

1. カエルの水でステップ1.2.1で行われた5cmのウォーターマーク、内側テスト給油して下さい。
2. 小さなネットを使用して、ゆっくりと内部テストタンクに動物を移動します。
3. オープンQコンピュータと、ガイドとして外槽の使用についてuickTimeソフトウェアは、カメラのテストエリアを視覚化し、記録することができることを確認してください。
4. カメラで紙や記録の一部に、動物の名前、日付と時刻を書き込みます。
5. 右図2に、タンクの黒い面と外槽に試験水槽を配置します。
6. タンクを配置した直後に動画撮影を開始し、2分間のタイマーをセットします。
7. タイマービープ音は、内部試験水槽を削除すると、外槽を180°回転させ、外槽の内側にインナー試験水槽を配置します。タイマーを開始する。注：黒側は、現在、他の側に配置する必要があります。
8. 10の試験の合計ステップ3.7、8回繰り返します。各試行をオフにチェックし、ガイドとして、図2を使用してください。
9. 2別の日に行動分析を繰り返します。

4。網膜軸索切断

1. 彼らが応答しなくなるまで0.02％トリカイン動物を配置＃3ピンセットで尾のピンチに。
2. 0.1X MMR中の1％アガロースを融解し、次いで60ミリメートルのペトリ皿に入れる。いったん冷却し、アガロース中に小さな長方形のディボットを作り、動物が部分的に液体に沈められるように、少し0.02％トリカインでディボットにオタマジャクシを追加します。
3. ピアース25 G針で目の背部の後ろに45度の角度で肌、反対側の鉗子に対して動物をブレースながら。
4. 視神経の隣にある静脈をチョキチョキしないように注意しながら、慎重に、＃5ピンセットで穴に達する視神経を切り取ると邪魔にそれを反転。重度の出血が原因で誤って動脈を切り取るに存在する場合には、すぐに安楽死させるために、2％トリカイン動物を配置します。注意：トリカイン液2％がヒトにしびれを引き起こす可能性があります。このソリューションは、手袋をして取り扱ってください。
5. 動物を回復するために、手術後、0.7X MMRで100ミリメートルペトリ皿と20分間50μg/ mlのゲンタマイシン動物を配置します。 NEXT、カエルの水で回収タンクにオタマジャクシを移す。てみよう動物の残りのO / N
6. 翌朝、（3.1から3.9ステップ）上記のような視覚機能をテストします。

5。結果の分析

1. 試験が終了した後、オタマジャクシは、タンクの黒い面に留まる時間を測定する。
   1. 手動で時刻を表示し、頻繁に一時停止を可能にするソフトウェアを使用して動画を表示する。映像の表示時間を見てください。内槽が正常に外槽の内側に入れ子にし、カメラのビューで二乗されたときである2分間の裁判の開始を書き留めます。
   2. 動物が上の泳いでいる水槽のどちら側を定義するためにオタマジャクシの目の位置を使用してください。両眼が黒/白のラインを越えた場合にのみ、他にタンクの片側からクロスオーバー定義します。
2. 動物は、黒側に費やすことを（秒単位）の各区間の始まりと終わりを書き留めます。一時停止して再正確さを保証するためにビデオを巻き。各試行内の秒の合計。
3. 付属の行動のためのワークシートに入力これらの番号を。に費や​​した合計秒 - ワークシートには、動物が（120 [秒で合計時間で合計120秒のトライアル·アンド·ディバイドから、タンクの黒い面に費やす時間を差し引くことにより、白側に費やした時間の割合を計算します黒側）/ 120秒]。全10試行以上のワークシートの平均は、この比率。
4. 日の間試験は（P≤0.05）が有意であるかどうかを判断するためにスチューデントのt検定、対の、両側分布を使用してください。

結果

以前の報告は、我々はオタマジャクシのどちらかの目の視覚機能をテストするために、このアッセイを変更した、変態前のアフリカツメガエルのオタマジャクシは、白/黒のタンクの白側に泳ぐと、このアッセイと呼ばれることを好むことを背景色嗜好のアッセイ^3を示している週間足らず。このようにして、彼らの目は、組織学的検査のために収集することができる。

私たちは、応答が視覚的手がかりに起因しているかをここに表示されます。 動画1は、左右のパネル内のオタマジャクシは、同じ動物である。左の両方の視神経を切断した後、手術前、右、動物に動物である。私たちは、何も黒い面から動物を撃退するか、白側にそれらを誘致するために追加されていないことを示すために水を旋回。映画では、動物の組ごとに視神経の状態を示している底部コーナーでオタマジャクシの概略図を提供する。 動画1、ノーマル、U内N-操作オタマジャクシブラインドオタマジャクシがタンクの周りにあてもなく泳ぎながら試験水槽に30秒未満で背景色に反応する。ムービーの...

ディスカッション

ここでは簡単に最小​​限の訓練を受けた研究室の担当者が週の下で実行することができる簡単な視覚誘導行動分析を報告する。他のアッセイは、動物の行動に特化した設備や専門知識を必要としますが、このアッセイは、視覚的な機能を決定するために簡単なテストを可能にする。別の行動分析、ビジュアル回避アッセイは、蓋がアフリカツメガエル ¹⁰内視知覚に貢献する方法を決定するために開発されました。このアッセイは、安定した背景に対して移動に応じた施策の空間的調整とコントラスト感度、したがって、ここで報告されたシンプルなアッセイより専門的なビジョンに基づく行動を測定することができます。自動化された行動システムはタンク⁸の一方の側に費やす時間の量を測定することが報告されている。暗いまたは明るい環境⁹で過ごす時間ゼブラフィッシュの量を測定するために使用されている市販のソフトウェア（ 例えば ANY-迷路ソフトウェア）もある。 Assay我々は高価な機器やソフトウェアのこれらの種類を購入する必要はありません、ここで報告しているが、代わりに視覚機能を測定するために、日常の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カバーeNasco	SB19271M	付き1/2ガロンフレックスタンク	:5-3 / 8 "x 7" x 3-3 / 4 "
黒の電気テープ
ティッシュペーパー
大型接種ターンテーブル	VWR	50809-022	サイズ:直径114.3 x H 76.2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb underpad	VWR	82004-836	サイズ: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
標準三脚		各種
iSightカメラまたはウェブカメラ	Apple	M8817LL/A	大きなオタマジャクシには良いが、小さなものは見づらい
ポータブルコンピュータ	Apple/PC	各種	13インチMacBook、2GHzのIntel Core 2 Duo、MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV、ハンディカムカムカメラ	、SONY	DCR-HC42	を使用しました6芯および4芯のα FireWire 400
ハンディカムステーション	SONY	DCRA-C121
26 G針(5/8 "長さ)	VWR	BD305115
デュモン#5鉗子	ファインサイエンスツール	11295-10
使い捨てに
硫酸ゲンタマイシン [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	RT
Sylgard 184 シリコーンエラストマー	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster and Smith	CD-116528	ストック溶液 = 100 g/L RTで保存
リン酸ナトリウム二塩基性	Sigma Aldrich	S0876	ストック溶液 = 0.4 M RTで保存
in vitro受精胚	eNasco	LM00490MX	100胚/ユニット