テスト視機能のための簡単​​な行動アッセイアフリカツメガエル

Summary

アフリカツメガエルのオタマジャクシは黒/白のタンクの白側水泳を好むツメガエル 。この現象は、それらの視覚によって案内される。この動作に基づいて、我々はオタマジャクシの視覚機能をテストするための簡単​​な分析を提示する。

Abstract

カエルのオタマジャクシにおける視覚機能の測定は、 アフリカツメガエル 、生きた動物で失明のためのスクリーニングが可能となる。視運動性応答は試験した全ての脊椎動物で観察されている視覚ベース、反射的な動作です。従ってテールフリップ応答が微妙応答を記録するための訓練を受けた技術者を必要とする別の尺度として使用したオタマジャクシの目が小さい。私たちは、オタマジャクシは黒と白の両サイドにタンク内に置かれたとき、タンクの白い側に泳ぐことを好むという事実に基づいて、代替行動アッセイを開発した。ここで紹介するアッセイは、容易に測定された応答を作成し、安価な、簡単な代替手段です。セットアップは、ほとんどのアフリカツメガエルの研究室で容易に利用可能、三脚、ウェブカメラと、ネストされたテスト用のタンクで構成されています。この記事では、前と視神経を切断した後、オタマジャクシの挙動を示すのムービーが含まれています。片目の機能をテストするために、我々はまた、REPREを含むそれぞれの目には連続した日に、網膜軸索切断を受けているオタマジャクシのsentative結果。今後の研究では、一度に多くのオタマジャクシのビジョンをテストするためにこのアッセイの自動化されたバージョンを開発することもできます。

Introduction

アフリカツメガエルは、眼の形成を研究するためのモデル生物として用いられてきた。目はビジュアル開発と機能に影響を与える遺伝子または経路をテストするための一週間も経たないうちに満期まで成長し、急速に開発しています。視覚機能をテストするには、視運動と微細運動応答は、それぞれ^1,2、ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのオタマジャクシで使用されている。 アフリカツメガエルのオタマジャクシの目はゼブラフィッシュよりも比較的小さいので、このアッセイは、 アフリカツメガエルの微妙なテールフリップと眼球運動の挙動を検出するために、特殊な装置を使用し、訓練された人材を必要とします。 アフリカツメガエルにおけるより堅牢な動作がここに記述されている^3、白背景、とのタンクで泳ぐための好みです。半分黒/ハーフ白タンクにオタマジャクシを配置するときに、事前に変成オタマジャクシはすぐにタンクの白側に泳ぐ。我々は以前、多能性細胞由来かどうかを判断するためにこのアッセイを使用目は⁴機能的であった。ここでは、変態前のアフリカツメガエルのオタマジャクシの視覚機能をテストするために使用され得るこのアッセイの詳細なバージョンを、報告する。

それだけで、ほとんどのアフリカツメガエルの研究室で発見搭載したデジタルビデオカメラ、....

Protocol

動物ケア

アフリカツメガエルは、本研究で用いたオタマジャクシがアップステート医科大学動物実験委員会および実験動物の管理と使用に関する指針によって承認された手順に従って上昇し、治療、成長させたツメガエル 。

1前の行動セットアップ：オタマジャクシ

1. 市販のソースから受精アフリカツメガエル胚を入手するか、以前に記載したように^、6 in vitroで 、卵母細胞を受精。
2. 20のKCl;; 20のCaCl _2、50mMのHEPES 0.1X MMR [10×Marcの修正リンゲル（MMR）は、溶液の在庫（10 mMのMgCl _2を含む60ミリメートルペトリ皿に18˚Cで神経板期胚への胞胚を置く。 1 MのNaCl、50μg/ mlのゲンタマイシン抗生物質]）、pH7.5に調整し、オートクレーブにかけ、室温で保存した。毎日0.1X MMRを変更し、デッド胚を削除します。
3. 胚はNieuwkoopとフェーバー段階に到達したら〜27から30 ^7、目を切り替える抗生物質なしの0.1X MMRへのE胚腸細菌の増殖を可能とする。
4. 彼らは供給ステージ（ステージ45）に到達するまで、オタマジャクシを育て、0.1X MMRで....

Results

以前の報告は、我々はオタマジャクシのどちらかの目の視覚機能をテストするために、このアッセイを変更した、変態前のアフリカツメガエルのオタマジャクシは、白/黒のタンクの白側に泳ぐと、このアッセイと呼ばれることを好むことを背景色嗜好のアッセイ^3を示している週間足らず。このようにして、彼らの目は、組織学的検査のために収集することができる。

私たちは、応答が視覚的手がかりに起因しているかをここに表示されます。 動画1は、左右のパネル内のオタマジャクシは、同じ動物である。左の両方の視神経を切断した後、手術前、右、動物に動物である。私たちは、何も黒い面から動物を撃退するか、白側にそれらを誘致するために追加されていないことを示すために水を旋回。映画では、動物の組ごとに視神経の状態を示している底部コーナーでオタマジャクシの概略図を提供する。 動画1、ノーマル、U内N-操作オタマジャクシブラインドオタマジャクシがタンクの周りにあてもなく泳ぎながら試験水槽に30秒未満で背景色に反応する。ムービーの.......

Discussion

ここでは簡単に最小​​限の訓練を受けた研究室の担当者が週の下で実行することができる簡単な視覚誘導行動分析を報告する。他のアッセイは、動物の行動に特化した設備や専門知識を必要としますが、このアッセイは、視覚的な機能を決定するために簡単なテストを可能にする。別の行動分析、ビジュアル回避アッセイは、蓋がアフリカツメガエル ¹⁰内視知覚に貢献する方法を決定するために開発されました。このアッセイは、安定した背景に対して移動に応じた施策の空間的調整とコントラスト感度、したがって、ここで報告されたシンプルなアッセイより専門的なビジョンに基づく行動を測定することができます。自動化された行動システムはタンク⁸の一方の側に費やす時間の量を測定することが報告されている。暗いまたは明るい環境⁹で過ごす時間ゼブラフィッシュの量を測定するために使用されている市販のソフトウェア（ 例えば ANY-迷路ソフトウェア）もある。 Assay我々は高価な機器やソフトウェアのこれらの種類を購入する必要はありません、ここで報告しているが、代わりに視覚機能を測定するために、日常の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
カバーeNasco	SB19271M	付き1/2ガロンフレックスタンク	:5-3 / 8 "x 7" x 3-3 / 4 "
黒の電気テープ
ティッシュペーパー
大型接種ターンテーブル	VWR	50809-022	サイズ:直径114.3 x H 76.2 mm (4 1/2  x  3")
Durasorb underpad	VWR	82004-836	サイズ: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24")
Kimwipe	Krackeler Scientific, Inc.	1945-34155-CS
標準三脚		各種
iSightカメラまたはウェブカメラ	Apple	M8817LL/A	大きなオタマジャクシには良いが、小さなものは見づらい
ポータブルコンピュータ	Apple/PC	各種	13インチMacBook、2GHzのIntel Core 2 Duo、MacOSX Lion 10.7.5
MiniDV、ハンディカムカムカメラ	、SONY	DCR-HC42	を使用しました6芯および4芯のα FireWire 400
ハンディカムステーション	SONY	DCRA-C121
26 G針(5/8 "長さ)	VWR	BD305115
デュモン#5鉗子	ファインサイエンスツール	11295-10
使い捨てに
硫酸ゲンタマイシン [50 mg/ml]	Fisher Scientific	17-528Z	RT
Sylgard 184 シリコーンエラストマー	Fisher Scientific	NC9644388
Instant ocean	Doctors Foster and Smith	CD-116528	ストック溶液 = 100 g/L RTで保存
リン酸ナトリウム二塩基性	Sigma Aldrich	S0876	ストック溶液 = 0.4 M RTで保存
in vitro受精胚	eNasco	LM00490MX	100胚/ユニット