リプログラマブルマウスモデルからのiPS細胞の中間体の精製を媒介細胞表面マーカー

サマリー

マウス胚性線維芽細胞は、転写因子Oct-4、Sox-2、Klf-4、c-Mycの強制発現により、低効率で人工多能性幹細胞に再プログラムすることができます。リプログラミング反応のまれな中間体は、細胞表面メーカーであるThy-1.2、Ssea-1、およびEpcamに対する抗体による標識により単離されたFACSです。

要約

成熟した細胞は、多能性の状態に再プログラムすることができます。これらのいわゆる人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、体のあらゆる細胞種を生み出すことができ、その結果、再生医療への応用に大きな可能性を秘めています。従来、iPS細胞は、転写因子Oct-4、Klf-4、Sox-2、およびc-Myc(OKSM)をウイルスに導入することで作製されます。しかし、リプログラミングは非効率的なプロセスであり、細胞の0.1〜1%のみが多能性状態に戻るため、リプログラミングメカニズムの研究は困難です。リプログラミングプロセスの研究を可能にした実証済みの方法論は、反応のまれな中間体を難治性のバルク集団から分離することです。マウス胚性線維芽細胞(MEF)の場合、私たちや他の研究者は、リプログラミング細胞がこれらの細胞の分離に使用できる細胞表面マーカーの発現プロファイルに明確な一連の変化を経験することを示しました。OKSM発現の初期段階では、リプログラミングに成功した細胞は、線維芽細胞同一性マーカーThy-1.2を失い、多能性関連マーカーSsea-1をアップレギュレートします。Ssea-1陽性細胞のサブセットの多能性状態への最終的な移行は、リプログラミングの後期段階でのEpcamの発現によって特徴付けられます。ここでは、MEFの培養物からリプログラミング中間体を単離するために使用される方法論について詳しく説明します。実験の再現性を高めるために、Rosa26遺伝子座の制御下で転写トランスアクチベーター(m2rtTA)を発現し、ドキシサイクリン応答性プロモーターの制御下でOKSMを発現するように操作された再プログラム可能なマウス系統を使用します。これらのマウスから単離された細胞は同遺伝子であり、ドキシサイクリンの添加によりOKSMを均一に発現します。本稿では、リプログラマブルマウスの作製、MEFの作製、その後の蛍光活性化細胞選別法(FACS)によるiPS細胞へのリプログラミング中の中間体の単離について詳細に説明します。

概要

胚性幹（ES）細胞は、胚盤胞期胚¹の内部細胞塊から誘導される。適切な培養条件の下で、彼らは自己再生および多能性のまま。 2006年に山中らは、成熟した細胞は、転写の強制発現によって、いわゆる人工多能性幹（iPS）細胞に因子再プログラムすることができることを実証したOct-4の、KLF-4、SOX-2、c-Mycの^{（OKSM）2。} iPS細胞は、ES細胞と同様に、身体の全ての細胞型を生じさせることができる、しかし、それらはES細胞³の生成を取り巻く倫理的制約を含まない。さらに、iPS細胞は、パーソナライズされた再生医療の約束を運び^、4,5ーをスクリーニングする疾患モデルのようなアプリケーションのために、そしてインビトロ薬剤に多大な可能性を秘めています。この可能性を満たすための技術を再プログラムするためには、核初期化の基本的なメカニズムは完全に理解される必要がある。しかし、努力は再プログラミングパットを解剖するhway細胞のごく少数（0.1〜1％）を再プログラムするという事実によって妨げられてきた。首尾よく再プログラミング線維芽細胞は、再プログラミング、内因性コア多能性ネットワーク^11〜14の活性化の最終段階における上皮の移行^6-10に、間葉系と、を含むイベントの明確な一連を受けることが報告されている。私たちは、他^{12,13,15-17は}最近^、難治性バルク集団から希少な中間体の分離を可能にする細胞表面マーカーのセットを同定した。リプログラミングのマウス胚線維芽細胞（MEFが）2週間にわたる再プログラミング過程の間に¹⁵のThy-1.2、SSEA1および（とりわけ）EpCAMの発現の変化を受ける。早期のMEFのサブセットを再プログラミング中の線維芽細胞の同一マーカー（のThy-1.2）の発現をダウンレギュレートした後、多能性関連マーカーSSEA-1 ^を発現する¹²始める。再プログラミングSSEA1陽性細胞の最終段階の間、reactivそのようなOct-4の^10-13,15などの内因性多能性遺伝子を食べました。この最後の遷移は、検出可能なEpCAMの発現は（ 図1参照）以降の段階PECAM ¹⁵による細胞表面上にマークされている。最近、オマリーらは、再プログラミング中間体の同定のためのThy-1.2およびSSEA-1の代替または相補としてCD44およびICAM1の使用を報告した。私たちは、以前に、FACSは、これらの細胞表面マーカー^15,18に基づいて0日目、3日目、6日目、9日目と12日目のリプログラミング培養からの再プログラミングの中間体だけでなく、から樹立されたiPS細胞株を抽出した。後述の再プログラミング·システムおよび条件については、私たちは、集団が均質で、静かであるが、特定された中間集団における不均一性のある程度があることを単一細胞レベルで示されている。これは、これらの集団内の細胞のサブセットのみがそれぞれの次の駅に進行することができることに留意すべきである再プログラミングプロセスの葛と広く^15,19以前に特徴付けられた異なる効率でiPS細胞コロニーを生じさせること。また、これらの集団の再プログラミング効率は再メッキおよび培養条件にも同様異なります。実験の再現性を向上させるために、私たちは、Rosa26遺伝子座およびドキシサイクリン応答性プロモーター^20,21の制御下のポリシストロニックOKSMカセットの制御下で転写トランス（m2rtTA）を発現するように操作された再プログラム可能なマウス系統を使用しています。このマウスモデルを使用すること、すなわち 、ウイルス挿入物の組み込み部位の数と位置のセル変動性細胞と異種の出発集団をiPS細胞の生成の伝統的なウイルス法の望ましくない副作用を回避する。ジャクソン研究所のホモ接合創始動物として利用可能な2つのトランスジェニックマウス系統（OKSM、m2rtTA）は、reprograを確立するために交配されなければならないmmableマウスモデル（ 図2参照）。本稿では、MEFのを導出iPS細胞を生成し、そしてFACSによって変換プロセスのさまざまな段階での再プログラミングの中間体を単離する方法を詳細に説明する。

プロトコル

1 [機器の設定/試薬の調製/ジェノ

1. iPS細胞培地の調製^：5台の白血病抑制因子を75mlで500ミリリットルノックアウトDMEM培地サプリメントウシ胎児血清（FBS）を5mlのL-グルタミン5mlの非必須アミノ酸、500μlのβ-メルカプトエタノール、5×10（ LIF）。この原稿の文脈で使用される試薬の製品や購入については、物質一覧をご参照ください。
2. MEF培地を準備し、50ミリリットルのFBS、5ミリリットルのL-グルタミン、5ミリリットル非必須アミノ酸と5ミリリットルピルビン酸ナトリウム、500μlのβ-メルカプトエタノールを500ミリリットルDMEM培地サプリメント。
3. 凍結培地の準備：10ミリリットルのために、1mlのDMSOとFBSの9ミリリットルを兼ね備えています。
4. 右の使用の前に少なくとも10分間吸引をRTでインキュベート、ゼラチンコーティングされた料理はT75フラスコに3〜5ミリリットルの0.1％ブタゼラチン溶液を添加調製します。
5. FACSの標識培地を準備します。10ミリリットルのために、FBSの0.1ミリリットルを含むPBSの9.9ミリリットルを兼ね備えています。
6. 実行するRosa26遺伝子m2rtTA遺伝子座について遺伝子型決定PCR：製造業者の説明書に従って、DNAポリメラーゼとの反応を実行します。 oIMR8052：5 'GCG AAG AGT TTG TCC、TCA、ACC 3'、oIMR8545：5'AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT 3 '、oIMR8546：5' GGA GCG修正された3.5 mmで、以下の3のプライマーのMgCl ₂ -concentrationを使用してくださいGGA、GAA ATG GAT ATG 3 '。サイクリング条件：3分94℃; （30秒94℃、1分間65°C、1分間72℃）の35サイクル; 2分間72°C; 12℃で保持します。予想製品サイズ：野生型対立遺伝子650 bpおよび変異対立遺伝子340塩基対。
7. コラーゲンStemCa / OKSMの座について遺伝子型決定、PCRを実行します。指示に従って、DNAポリメラーゼの反応を実行します。使用のMgCl ₂を2.5mM、以下の3プライマーの-concentration更新日：COL / FRT-B：5 'CCCTCCATGTGTGACCAAGG 3'、COL / frtA1：5 'GCACAGCATTGCGGACATGC 3'、COL / frtC1：5 'GCAGAAGCGCGGCCGTCTGG 3 '。サイクリング条件：1分間95℃（30秒、45秒、70℃、94℃）の2サイクル、30サイクル（30秒、45秒、68℃で94℃）の6サイクル（20秒94℃、60℃、1分間）の; 5分間72°C; 12℃で保持します。予想製品サイズ：野生型対立遺伝子のための331 bpおよび変異対立遺伝子のための551 bpの。
8. 4℃で3分間400×gですべての遠心操作を行ってください。

マウス胚線維芽細胞の2世代

1. m2rtTA株の反対の性別のメンバーとOKSM株の動物間の時限交配を行います。母親をカリングし、子宮角を除去することにより、胎生13.5で収穫の胚。子宮角を除去する前に、微生物汚染を回避するために、80％エタノール溶液で腹部スプレー。
2. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBを10 mlを含む10cmの組織培養皿に子宮角を転送するS）。 （ 図3A、Bを参照）1胚を含む断片に子宮角をカットする滅菌外科グレードのハサミを使用してください。
3. 慎重に子宮エンベロープと各胚を取り巻く胚体外膜を除去するために解剖顕微鏡（理想的には、組織培養フード内に配置された）、滅菌ピンセットを使用してください。 10mlのPBSで独立した10cmディッシュに各胚を転送します。
4. 胚の頭、手足、尻尾やピンセットで内臓（心臓、肝臓、腸など ） を除去することによって進みます（ 図3Cを参照）。 1.5mlチューブに胚の頭部を転送し、必要に応じて、それが遺伝子型決定のために使用することができるので、ダウンフリーズ。
5. 空の10センチメートルプレートに胚の胴体を移し、2分間胚をミンチする2外科のブレードを使用しています。ミンチ胚の上にトリプシン/ EDTA溶液200μlを加え、室温で3〜5分間インキュベートする。さらに2分間のミンチを続け、中にMEF培地の2ミリリットルを追加トリプシンを活性化し、次いで15 mlのチューブに移す。
6. さらに機械的に穏やかにピペッティングすることによって組織を解離千μlのピペットを使用してください。ゼラチンコート10cmディッシュに移し、MEF培地の追加の10ミリリットルを追加します。注：両方の正常酸素および低酸素インキュベーターは培養に使用することができ、詳細については説明を参照してください。
7. 24〜48時間後、プレートを密にしたMEFで覆われている必要があります。
8. あるいは、細胞は、その後さらに増殖またはダウン凍結することができる。細胞の凍結のために、培養培地を除去し、3ミリリットルのトリプシン/ EDTA溶液を用いてメディアやオーバーレイの痕跡を除去するために10ミリリットルのPBSで皿をすすぐ。 37℃で3〜5分間インキュベートする1​​5mlの遠心分離チューブにMEFメディア転送を5ml加えることによってトリプシン消化を不活性化する。スピンダウンし、メディアの凍結3mlにペレットを再懸濁します。 3クライオバイアルに移し、細胞凍結容器内にダウンして凍結する。

MEFは3。リプログラミング

ove_content ">注記：4℃で5分間、200×gでの遠心分離により細胞をペレット化し、再プログラミングのために正常酸素組織培養インキュベーターを使用することが低酸素条件下でのMEFを導出し、展開することが有益であることができる（5％酸素、詳細については説明を参照してください。 ）。

1. 迅速水浴（37℃）で低継代クライオバイアル（P0-P1、2-3ミオ細胞）を解凍し、予め温めておいたMEF培地10mlのチューブに内容物を移す。ペレット細胞は、12ミリリットルの新鮮MEF培地中で再懸濁は、ゼラチンコートT75培養容器に移すと、細胞は先に進む前に24〜48時間で回復することができます。注：MEFにも直接導出して用いることができる。
2. 培養培地を除去した後、トリプシン/ EDTA溶液（37℃で3〜5分間、3ml）で重ねることによってPBSとcellularizeでのMEFを洗う。 MEF培地を5mlを添加することによりトリプシンをクエンチし、さらに10 mlピペットで穏やかに混合することによって細胞を解離する。血球計数器を用いて細胞数を決定します。
3. reprogra用mming実験、6.7×10 ³細胞/ cm ²の密度でゼラチンコートT75フラスコ上にシードのMEF（〜フラスコあたり0.5澪細胞）2μg/ mlのドキシサイクリンを含むIPSC媒体中。各時点での約2澪書き換え中間体を得るために、播種の勧告について、表1を参照してください。注：再プログラミングがドキシサイクリン（2μg/ ml）をを添加して開始されるメディアを補足し
4. 最初の6日間、新鮮なドキシサイクリンを補足IPSCメディア（T75フラスコあたりのメディアの12ミリリットル）で一日おきにメディアを交換。高い細胞数がある場合は、この点を超えると、日常的にメディアを更新する。メディアの変更のみ隔日に行うことができれば培養液量を倍増。
5. 必要な時間点で収穫書き換え中間体：のために（3 mlでPBS適切な体積（T75フラスコのため10ml）でリンスし、トリプシン-EDTA溶液でオーバーレイし、培地を除去することにより（提案日3、6、9、12） T75フラスコ）。培養する37°Cで3〜5分間、穏やかにピペッティングに続いIPSC培地を5ml加えることによりクエンチした。
6. 血球計数器で細胞懸濁液を数える（上記参照）、遠心分離によってペレット、トリプシンの痕跡を除去するために10mlのPBSで上清再懸濁細胞を吸引除去する。再び細胞をペレット吸引上清および再プログラミング中間体を単離するためにステップ4.1に進みます。注：再プログラミングを受けている細胞は、凍結保存され、後の段階で、FACS分離のために解凍することができます。
7. 完全に再プログラムされたiPS文化を確立するために、さらに4-7日間のdoxフリーIPSC培地中で細胞を増殖させる。注：正常に再プログラムする文化が一日12によるコロニーが多数含まれています（ 図4を参照）。この間、まだOKSM発現を必要と異常なiPS細胞が消えます。
8. 代わりに、残りの完全に再プログラムされたiPS文化を伝播するために：最初は、15×10 ³細胞/ cm ²の密度で照射されたMEFをシードアップT75コーティングされたゼラチンの上にIPSCメディア12mlに1日以上前の実験と6時間後にフラスコ。
9. 次に、培地を除去し、PBS 10mlでT75フラスコをすすぎ、トリプシン-EDTA溶液3mlでオーバーレイし、37℃で3〜5分間インキュベートすることによりcellularize iPS細胞培養物。 、穏やかに混合しIPSCメディアの5ミリリットルを添加することにより、トリプシンをクエンチ15ミリリットルコニカルチューブに移し、スピンダウンした後、10ミリリットルのiPS培地に再懸濁。
10. 照射したMEF（T75フラスコ）にこの細胞懸濁液を500μlを移し、培養物は4〜5日間成長させる。注：樹立されたiPS培養物は、凍結保存または実験のために使用することができる。クローン細胞株は、解剖顕微鏡の下で²²の個別IPSCコロニーをピッキングすることによって導出することができる。
11. MEFは2.8で説明したようにクライオコンフルエントIPSC文化を保持します。

4。抗体標識

1. で、第3節で調製した再プログラミング培養物の再懸濁細胞ペレット、抗体を補充し、FACSラベリングメディア（1抗Thy-1.2パシフィックブルー：400、抗SSEA-1ビオチン1：400および抗EpCAM FITC 1：400）。 500万細胞あたりを補足標識ミックスを200μlを使用し、氷上でインキュベートする。
2. 10分後、穏やかに細胞を再懸濁し、氷上でさらに10分間インキュベートし、チューブをタップします。チューブあたりの冷PBS 10ミリリットルを加え、スピンダウン。
3. 500万細胞あたり：各チューブについて（200 1）1μlのストレプトアビジンPeCy7補充したラベルメディア200μlの準備に染色する。細胞がペレット化したら、慎重にストレプトアビジンPeCy7補充したラベリングメディアの適切な容量の上清と再懸濁を吸引。
4. 、再懸濁、氷上でさらに10分間インキュベート、チューブあたりの冷PBSを10mlを追加し、スピンダウンし、上清を吸引除去しをタップ、10分間氷上で細胞を保管してください。
5. 約1×10 ⁷細胞/ mlのヨウ化プロピジウム（PI）（2μg/ ml）を補充した、標識培地中で再懸濁し、細胞ペレット。 70μmのストレーナーにサスペンションを通過させることによって、細胞塊を除去します。適切なFACSチューブに細胞を移し、氷上に保管してください。
6. 個別の抗体（抗Thy-1.2、抗SSEA-1および抗EpCAM）付きの独立したサンプルを準備します。注：これらの分析に使用される三つのチャネルにおける色補正を行うために必要とされる。さらに、非標識細胞ソーティングのための電圧およびゲートを設定するために必要とされる。理想的には、iPS細胞は、補償のために使用されます。、照射MEF上に維持さ0.5〜1×10 ⁶ iPS細胞のストックを、液体窒素中で凍結バイアルに保存されます。 MEFはの存在は汝-1.2チャンネルの信号を得ることが不可欠である。
7. MEFは（セクション3）について記載したようにiPS細胞のクライ​​オバイアルを解凍する。遠心分離後、標識バッファー800μlのこのサンプルの200μl中に再懸濁細胞を、標識されていないコントロールとして確保されている。
8. 補償コントロールとして残りの細胞を使用してください。 3 15ミリリットルチューブ間のセルを分割し、抗体を追加次のように：パシフィックブルー補償制御を：抗Thy-1.2パシフィックブルー抗体の0.5μlを添加する。 FITC補償管：抗EpCAM-FITC抗体の0.5μlを添加する。 PE-Cy7の補償制御：抗SSEA-1-ビオチン抗体0.5μlの。
9. 、氷上で10分間細胞 - 抗体のサンプルをキープタップして混合し、氷上で10分間インキュベートする。
10. 10ミリリットルの冷PBSで洗浄サンプルは、未結合の抗体を除去し、細胞をスピンダウンし、上清を吸引する。 FACSラベリングメディア200μlの再懸濁細胞ペレット。
11. 抗SSEA-1-ビオチン標識された試料については、ストレプトアビジンPeCy7コンジュゲート（200μlの細胞あたり1μl）を追加します。一次抗体（SSEA-1-ビオチン）について記載したラベル細胞。
12. 70μmのストレーナーに標識されていないコントロールを含むすべてのサンプルをパスし、PI（2μg/ mlの）を追加します。 FACSチューブに細胞を移し、必要になるまで氷上に保つ。

中間体の5 FACS単離

注：細胞を405nm、488 nmおよび560 nmの励起レーザーおよび100μmのノズルを蛍光活性化セルソーターを使用して並べ替えられています。

1. 細胞集団が適切に可視化されるように、前方および側方散乱のための電圧を設定する。破片を排除するために、図5Aに示されるように、セルの周囲にゲートを描画します。注：セルソーターの電圧の正しいセットアップが複雑で、経験豊富なFACSオペレータを必要とすることができます。
2. FSC面積に対する利用前方散乱（FSC）高さは、骨材（ 図5B）を除外します。
3. PI陰性の生細胞（ 図5C）上におけるゲートへのFSCに対するPIチャネルを可視化。
4. PB、FITC / GFP、PE-Cy7での蛍光のチャネルの電圧を調整するために非標識細胞を使用してください。理想的には、それぞれのチャネルの下端に細胞集団を配置。
5. リプログラミングカルトサブ画分に図6A、Bに示すように、非標識コントロール細胞とゲートを設定します3日目、6にURESと9集団：SSEA-1〜/のThy-1.2 +細胞; SSEA-1〜/汝-1.2-細胞;そして再プログラミングは、SSEA-1 + /のThy-1.2〜細胞を仲介。
6. さらにFITCブロットに対するPE-Cy7のを使用して9日目SSEA-1 + /のThy-1.2〜分数を分割。 SSeが-A1 + /のEpCAM +細胞およびSSEA-1 + / Epcam-細胞の周りにゲートを描きます。 図6C、Dに示すように、非標識コントロール細胞とゲートを設定します。
7. iPS細胞培地（1-2）で洗浄したプレフィル適切な採血管希望亜集団をソートする前に（9/12日の文化やiPS細胞6 /日3日目/日、のMEFのための代表的なFACSプロファイルについては、図7を参照）。
8. FACSソーティングプロトコールを製造しているに応じて実行します。
9. FACS分離した後、分子プロファイリング（RNA /タンパク質抽出、クロマチン免疫沈降法は、DNA methylome解析など）にセルを送信してください。あるいは、さまざまな細胞画分を培養することができる。

結果

E13.5マウス胚の解剖、解離、およびめっき後、10cmディッシュは、約1〜2日でコンフルエントに達すると予想される。培養物が適切に細胞化されていない組織のいくつかの接着性部分を含むように、この段階では、それは正常です。これらは、継代後に消えます。

ドキシサイクリン誘導時には、再プログラミングMEFを明確な形態​​学的変化を受ける。 6日目の周囲には、初期のコロニーのようなパッチは、（ 図4C）を出現し始める必要があります。これらには、（ 図4D、E参照 ）、さらに文化の上にサイズが成長していきます。優れた再プログラミング実験は当初、5×10 ⁵細胞（ 図4E）を播種したT75あたり> 500コロニーを生じるはずである。樹立されたiPS培養は、特徴的なドーム形のコロニーを有し、主に分化した細胞（ 図4F）を欠いている必要があります。のiPS cultuの時折、追加の継代解像度は、未分化/部分的に再プログラムされた細胞を除去するために必要な場合があります。細胞のコンフルエントなフラスコを照射したMEFのフィーダー層上に1:10の比率で分割することができる。

上述したように、再プログラミングの間の形態学的および分子的変化のThy-1.2は、SSEA-1、および最終的にEPCAM（ 図7A-Fを参照）のためのFACSプロファイルの変化によって反映される。 MEFはは汝-1.2用に主に正であり、他のマーカーについて陰性ながら、以前に^12,15に報告されたように、3日目の培養物はすでに顕著に違って見える。細胞の大部分は、下方制御するために始めているのThy-1.2の発現およびこれらのThy-1.2陰性細胞の非常に小さなサブセットは、SSEA-1、この時点での中間の実際の再プログラミングのためにポジティブになっている。 SSEA-1 + /のThy-1.2〜の割合が通常viabl 1〜10％の間の範囲内にあるように目から3文化を抽出することができるリプログラミングの中間体の数は非常に予測できません電子セル。日6,9 SSEA-1 +細胞の増加した割合を上、通常、ウェル10％を超えて、検出することができる。 12日目の周りにSSEA-1陽性細胞のサブセットはまた、EpCAMのための陽性標識することを検出することができる。可変であり、通常、すべての生細胞のわずか2〜4％の範囲であるSSEA-1.2 + /のEpCAM +細胞のパーセンテージとして12日目の培養物は、3日目の培養物と同様に、中間体の精製におけるボトルネックを表す。 表1に示した再プログラミング中間体の予想される数は、粗い近似として機能します。設立善意のiPS細胞培養は、SSEA-1およびEpCAMを強陽性となります。

再プログラミング経路の間に、図1の表面マーカーの変更：線維芽細胞識別マーカーのThy-1.2のダウンレギュレーションは、のアップレギュレーションが続いているSSEA-1。多能性状態に向かってSSEA-1陽性細胞のサブセットの遷移は、12日目の周りのEpCAMの買収によって示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2の再プログラム可能なマウスモデルの概略図が：。m2rtTA発現は遍在的に活性なRosa26遺伝子座の制御下にあるドキシサイクリンの存在下で（DOX）はm2rtTAタンパク質はコラーゲン1a1は少なくともテトラサイクリン依存性プロモーター（tetOP）に結合する（COL1A1） 4因子カセットの発現をもたらす遺伝子座。二シストロン性カセットは、内部リボソーム侵入部位（IRES）によって連結されている。 10月-4 / KLF-4およびSox-2 / c-Mycのためのオープンリーディングフレームは麩ですそれぞれ、自己切断F2AとE2A配列によってsedの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3胚解剖：（A）転送子宮角1胚を含む断片に切断10mlのPBSおよび（B）を充填した10cmディッシュに。 （C）胚体外組織から胚を解放し、頭、手足、尻尾や内臓を取り除く鉗子を使用しては。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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再プログラミング中の図4。形態学的変化。コロニーのようなパッチは日目以降6から培養中で明らかとなる。善意の性IPSCは、ドーム型の形状、形態によって特徴づけられる。 （A）0日目/ MEFを、（B）3日目、（C）6日目、（D）9日目、（E）、12日目、（F）iPS細胞培養物。スケールバー：200μmのこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5の基本的なFACSのセットアップ。（A）は前方散乱エリアブロット対側方散乱で破片を除外します。 （B）前方散乱ハイブロットに対する前方散乱エリアを持つ単一の細胞集団にゲーティングすることによって非破片から凝集体を除外します。 （C）は、ブロット前方散乱エリアに対するPIチャンネルとPIの低いイベントにゲーティングすることによって、単一の細胞集団から死細胞を除外します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6ゲー。（A、B）のThy-1.2 + / SSEA-1〜細胞のThy-1.2〜/ SSEA-1〜細胞とのThy-1.2〜/ SSEA-1 +のためのゲートを設定し、非標識対照細胞を使用した細胞。 （C）のEpCAM陽性および陰性細胞のEpCAMのためにゲートを設定するには、非標識対照細胞を使用してください。 + /のThy-1.2〜細胞を分離することができるSSEA-1（D）正と負のEpCAM集団へのEpCAMへ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

再プログラミングプロセスのさまざまな段階におけるSSEA-1 FACSブロットに対する図7のThy-1.2（A）0日目/ MEFを、（B）3日目、（C）6日目、（D）9日目、（E）日12、（F）iPS細胞培養物。

表1推奨播種密度、フラスコ番号とOKSMとm2rtTAための胚ヘテロ接合のP1のMEFのための期待される成果。 時間をクリックして下さいこの図の拡大版を表示するには、ERE。

デイ	0日目に播種したT75フラスコの数	FACS後のSSEA1 +細胞の総数	FACS後のSSEA1 + / EPCAM +細胞の総数
3	8	200万
6	4	200万
9	4	200万
12	10	千万	200万

ディスカッション

成功したiPS細胞へのMEFを再プログラムし、多量に再プログラミング中間体を精製するためには、全体の効率に影響を与える要因を認識することが不可欠である。特にFBSのバッチが有害な影響を持つことができたiPSメディアを補充するために使用される。一般肯定的な経験では胚性幹（ES）細胞修飾FBSが、安価な代替を特定するかもしれない、さまざまなベンダーからの血清のバッチテストを行った。

初期化効率への影響は、MEFを^15,20の遺伝子型であるもう一つの要因。 OKSMとm2rtTA座の両方のマウスのヘテロ接合（HET）から派生したMEFますがすることは、より高いリプログラミング効率の一方または両方の遺伝子座の結果でhomozygousityを再プログラムです。実際、OKSMとm2rtTA交配の子孫から得られたMEFは、次の順序（OKSM / m2rtTA）におけるリプログラミング効率の向上を示しています。HET / HET <ホモ/ヘタ表1に示した数字はHET / HET動物のためであることに注意してください）。まれに男性のホモ/ホモ動物が識別された、複数のm2rtTA雌と交配ハーレムを設定することができます。これらの交雑からのすべての子孫は、それぞれ、OKSM / m2rtTA座について/ホモHETされます。また、同腹の急速なジェノタイピングは、繁殖のために若いマウス（生後6-15週）を使用する場合、より大きな仔が得られるようにお勧めします。

また、再プログラミングのための低継代のMEFを使用すると^、23を強調している。 MEFには、正常酸素組織培養インキュベーターで導出し、増殖させた場合には、私たちを強く実験者のMEFの導出および拡張のための低酸素インキュベーター（5％酸素）にアクセスできる場合にのみ、しかし、通路2にこれらの細胞を使用することをお勧めします、 3という高い継代数はまだ良い結果^23が得られます。

ケースで実験者は再プログラミングに関連する問題が発生した、概説したように、最も可能性の高い説明は、doxの添加、誤ったマウスの遺伝子型またはiPS細胞の生成のために助長されていませんFBSの使用時の高い継代数である。しかし、まれに私たちはMEFをさえ理想的な条件の下で再プログラムすることができませんでしたことを観察した。これらのケースではm2rtTAのオープンリーディングフレーム内の自発的なデノボ削除は根本的な理由であると同定された。

この方法は成功裏に磁気細胞分離（MACS）を介して、SSEA-1 +中間体を抽出するようにした。 MACSを使用して明確な時間という利点があるが、SSEA-1 +細胞集団 '純度は、細胞がもたらす可能性があり宛ての実験のタイプに応じて80〜90％ではなく、95％以上に低減される問題。したがって、このオプションは、純度および/またはSSEA-1 + / +のEpCAMおよびSSEA-1 + / Epcam-細胞への分画、それらを高めるために、FACS続いSSEA-1 +細胞を濃縮するためにMacを使用することです。

概説したプロトコルおよびマウスモデルによって生成されたiPS細胞が多能性であると効果的キメラ動物^15,20の全ての組織に寄与することが示されているが">、完全に四倍体相補性を介してこれらのiPS細胞からなる胚を産生する能力の低下があった^24を示した。いるDlk-DIO3遺伝子クラスターにおける異常なメチル化パターンは、根底にある原因²⁴として同定されているが、再プログラミング中のメディアへの50μg/ mlの濃度のアスコルビン酸の添加は、四倍体相補コンピiPS細胞^24を生成する。代替再プログラム可能なマウスモデルは、異なる化学量論での初期化因子であっても、アスコルビン酸処理²⁵が存在しない場合に四倍有能なiPS細胞を作り出すことができる発現するように操作ますのでご注意ください。しかし、私たちの手で、この株書き換えでかなり低い周波数からの細胞を比較本明細書中で使用されるマウスモードへlである。

この原稿に記載された方法論は、人口の耐火バルクから再プログラミング中間体の分離を可能にし、 たとえば解剖とプロファイリングのための未分画の人口を使用するので、以前の制限を削除し、再プログラミング過程を理解するための貴重なツール（と見なされるべきである難治性細胞からの高い信号ノイズ）。本明細書に記載の抗体の組合せは、しかし、それは付加的な細胞表面マーカーは、より高い純度の中間体を得ることができるようになり、将来的に発見される可能性があり、高純度でのマウス細胞からの中間体の単離を可能にする。 SSEA-1の発現は、ヒトの人工多能性幹細胞の特徴ではなく、そのようなこのプロトコルなどのヒト由来の細胞を再プログラミングで使用することはできませんのでご注意ください。結論として、一度説明した方法を用いて単離し、再プログラミングの中間体は、発現プロフィリンを含む分子分析のために使用することができるgでクロマチン免疫沈降、methylome分析、およびタンパク質アッセイ。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗マウスCD90.2(Thy1.2)パシフィックブルー	eバイオサイエンス	〒48-0902-82
対ヒト/マウス SSEA-1 ビオチン	eバイオサイエンス	〒13-8813
ストレプトアビジンPE-Cy 7	eバイオサイエンス	25-4317-82
アンチマウスCD326(エプカム)フィット	eバイオサイエンス	48-5791-82
ピルビン酸ナトリウム	ライフテクノロジーズ	11360-070
MEM非必須アミノ酸(NEAA)	ライフテクノロジーズ	11140-050
胚性幹細胞適格ウシ胎児血清(FBS)	ライフテクノロジーズ
10439024トリプシン-EDTA(0.25%)	ライフテクノロジーズ	25200-056
GlutaMAX	Life Technologies	35050-070
β-メルカプトエタノール	ライフテクノロジーズ	2185-023
DMSO(ジメチルスルホキシド)	シグマ・アルドリッチ	D8418
ペニシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジーズ	15140
ヨウ化プロピジウム溶液(PI)	シグマ・アルドリッチ	P4864-10ML
豚の皮からのゼラチン	シグマ・アルドリッチ	G1890
ドキシサイクリンヒクレート	シグマ・アルドリッチ	33429-100MG-R
白血病抑制因子(LIF)	ミリポア	ESG1107
DMEM高グルコース	ライフテクノロジーズ	11960-044
DPBS(ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)	ライフテクノロジーズ	14190-144
ノックアウトDMEM	ライフテクノロジーズ	〒10829-018
照射されたMEFs	ライフテクノロジーズ	S1520-100
75cm2 組織培養フラスコ	コーニング/BDバイオサイエンス
430641 15 ml遠心分離管	コーニング/BDバイオサイエンス
430791 50 ml 遠心分離チューブ	コーニング/BDバイオサイエンス
使い捨て手術用ブレード	クリフォードハラム	SM0501
極低温バイアル	コーニング/BDバイオサイエンス
70 & マイクロ;m セルストレーナー	BDバイオサイエンス	352340
Taq DNAポリメラーゼ	ライフテクノロジーズ	〒10342-020