測定するための小型のデュアルエレメントひずみゲージの作製と移植<em&gt;インビボ</em&gt;げっ歯類における消化管収縮。

サマリー

実験動物の胃腸管に沿った平滑筋の収縮をin vivoで測定することは、まだ強力ですが、十分に活用されていない技術です。フレキシブルな二振動子ひずみゲージは市販されておらず、製造が必要です。このプロトコルは、げっ歯類の急性または慢性の移植のための信頼性と安価なひずみゲージの構築について説明しています。

要約

胃腸機能障害は、依然として罹患率と死亡率の主な原因です。実際、健康と疾患における胃腸(GI)の運動性は、過去5年間で1,400件以上の動物実験が発表されており、依然として生産的な研究の分野です。胃、小腸、および結腸の平滑筋活動を定量化するために、数多くの技術が開発されてきました。In vitroおよびex vivo技術は、消化管機能の機構研究のための強力なツールを提供しますが、無傷の生物に固有の統合システムの文脈から外れています。通常、in vivoでの胃の平滑筋収縮の測定には、外科的に配置された圧力センサーの導入、軽度に膨らんだバルーンなどの静圧負荷、または気圧制御されたフィードバックの下で胃を液体で膨張させることと組み合わせた麻酔薬の準備が含まれていました。しかし、これらのアプローチの多くは、結果の解釈と、意識的な実験動物モデルでのin vivo使用への適用性の両方に関して、独自の欠点を提示しています。消化管の漿膜表面に貼り付けられた二振動子ひずみゲージの使用は、多くの実験的利点を提供してきましたが、これは引き続き欠点を上回る可能性があります。これらのゲージは市販されていないため、このビデオプレゼンテーションでは、これらのゲージの現在の設計の製造について、詳細にステップバイステップで説明します。このプロトコルに記載されているひずみゲージは、ラットの胃の運動性を記録するための設計です。この設計は、消化管全体に沿った平滑筋の活動を記録するために変更されており、全体的な製造に微妙な変化のみが必要です。消化管全体からの代表的なデータが含まれているほか、分析方法、データの解釈、および提示についての議論も含まれています。

概要

実験条件の数を横断vivoで胃腸（GI）運動性のレコードが栄養恒常性のために必要な基本的な正常および病態生理学的プロセスを理解するための強力なツールのまま実験的研究。伝統的に、多数の実験的な方法論、臨床診療¹に見られるものと類似性を有するいくつかは、直接GI収縮率^2-5、管腔内圧^6,7、または非吸収性マーカー⁸のGI通過の変化^、9を定量化するために使用されているまたは安定同位^10-12。これらの技術のそれぞれは、文献において以前に対処されてきた固有の利点と欠点を有する。非吸収性マーカーの胃腸回復実験アニマを安楽死を必要としながら、例えば、圧力の変化を定量化するために、バルーン内圧測定の有用性は、バルーン材料の固有のコンプライアンスに起因して疑問視されている単一のデータポイントのlである。最近では、小型化された動脈圧カテーテルの適用および検証は、ラットおよびマウス³に胃の収縮性を監視するための非外科的方法を提供することが報告されている。 orogastrically配置された圧力変換器を効果的に侵襲性外科手術手順を回避することによって胃腸機能上の交絡変数を排除するが、このようなアプローチは、麻酔製剤にのみ適している。さらに、視線誘導の欠如は胃の特定の領域内のトランスデューサの一貫性のある配置を許可していません。このように、このアプリケーションは、視覚化以来、胃または結腸に限定されている比較的硬いトランスデューサ線に結合された、十二指腸または回腸内でオプションではない。

同様に、生体磁気交流biosusceptometry（ACB）技術は、GI収縮解析の⁴のために検証されています。 ACB技術は、非侵襲的にpを提供しますが胃腸の収縮を測定するためのローチ、ACBは、メディアが胃腸管の特定の領域の正確な記録を許可しない、摂取磁気検出の使用という点でも同様の制限に苦しんでいる。この制限は、磁気マーカの外科的移植を介して克服することができる。それにもかかわらず、ACB技術は、動物がデータ収集のために麻酔をすることを必要とする。

Ultrasonomicrometryは、小さなサイズ、空間、及び圧電結晶送信機/受信機の時間的利点を利用するために^13,14を研究^するいくつかのGIで採用されている。胃平滑筋収縮の波が高周波イベントではなく、約3分の速度で起こる - 、5サイクル/分。したがって、ソノマイクロメトリの時間的な利点は、コストを正当化する必要はないかもしれません。直線運動を正確にソノマイクロメトリーで測定しながらさらに、制限は正確な胃腸データに関する提示されている結晶¹⁴の数が不足して注入することに起因する解釈。

低音や同僚^2,15のオリジナルデザインに基づいて、この可視化されたプロトコルは、より完全に、ステップバイステップの製造およびミニチュアの実験的なアプリケーション、全体のGIに沿って平滑筋の収縮を記録するための高感度と柔軟性を持っている二要素ひずみゲージを文書化道。完成したひずみゲージの感度およびサイズ​​は要素をカプセル化シリコーンシートの際に最も依存しているので、歪みゲージ要素の寸法は、任意のげっ歯類の適用に適している。これらのひずみゲージは、容易にそれによって平滑筋収縮を定量化するための単一の技術を提供すること、麻酔し、自由に行動する実験動物モデルにおける急性および慢性の適用のために適合されている。

プロトコル

すべての手順は、健康ガイドラインの国立研究所に続き、医学のペンシルベニア州立大学でハーシー施設内動物管理使用委員会によって承認された。ラットを、共通のビバリウムの慣行を使用して飼育した。注：このプロトコルは、Wistar系雄性ラット≥8週齢、当初は175計量使用しています - 200グラム。

ひずみゲージの製作のために1。手続き

1. ほとんどの工具および部品は、元のまたは後続の会社から入手可能のままであり、 表1にまとめる。
2. 準備と2つの要素のひずみゲージの接着
   1. クリーンデュモン＃5ピンセットで慎重にひずみゲージ要素（EA-06-031-350）を処理します。要素の不必要な動きを制限するために、接着面が汚れや過剰な接着性のリスクなし作業面に要素を固定するために上に向けて紙の小さな、きれいな、自己接着部分を使用してください。
   2. ボンド2つの歪みゲージ要素は、バック·ツー·バック、デュアル要素を形成する。イソプロピルアルコールで各要素フィルムの裏面をきれいにし、蒸発による乾燥を許可（ガーゼによる乾燥を頻繁に除去するのが困難である繊維の汚染物質が導入されて）。実体顕微鏡ガイダンス（1 - 3×）の下で、クリーン、アーティストブラシ（10-0ラクダの毛）を使用して、1素子の裏面にエポキシ - フェノール系接着剤の薄膜を適用し、すぐに接触する第二の要素の対向後ろに置くとホイルグリッド（ 図1A）を合わせます。
   3. 完全にエポキシ樹脂を硬化させるために、60℃のオーブンでO / N - 50結合した要素を配置します。
      注：グリッドの位置ずれが発生することがあり、過剰なエポキシが要素と圧力に浸透する可能性があるので貼り合わせの要素をクランプしないでください。二液型エポキシを混合した後にのみ、6週間の使用可能な冷蔵期を有する。ボンドとは、一度の要素の十分な供給を硬化させ、後で使用するために、清潔で埃のない環境に保管してください。
3. サイジングと配線二要素ひずみゲージ
   1. ＃11メスまたは単一エッジカミソリで3×3ミリメートルの最終的なサイズに結合した二重の要素をトリミング。遅延は、安全要素（ 図1A）を処理するための領域を有するために、この時点で二重の要素の最上部をトリミングする。
   2. 各要素は、結合可能な3線から製作四導線を必要とし、テフロン（P / N 336-FTE）絶縁電線。 3つの構成のワイヤに三導体線の一つ30cmの編組ストランドを分解します。
   3. 4線式ケーブルを作成するために、3つの導体線の第二の長さ30cm内に含まれるような色の線で得られた単ワイヤの1をペアリング。次の手順では、これらのマッチングカラーワイヤは、最終的なひずみゲージ（ 図1B）のための共通配線を形成するために末端に結合されます。
   4. サーマルワイヤーストリッパーと各ワイヤの両端からテフロン絶縁体の約1ミリメートルを削除します。活性化されたロジンゾルを使用してワイヤがはんだ付け鉛筆で終わるフラックスおよび低温はんだ（融点183℃）、スズをダリング。
   5. 次の段階のために、microsoldering先端が素子（ 図1C）のフィルム層への熱損傷を防止する複数の別個のはんだ接合を形成するために必要とされる。小さいmicrosolderingチップを製造するために、銅線は、標準こて先の長さを超えていることを確認して、一度標準はんだ付け先端の周りに銅線（〜0.25ミリメートルの直径）の小片をラップ。
   6. フラックスクリーン10-0ブラシと半田1つのリード線と半田パッド（ 図1D）のペア共通リードの一つと結合したデュアルエレメントの一方の側にちょうど半田パッド。残留フラックスは、樹脂を溶媒に浸しきれいなブラシで後で除去することができる。
   7. 残りの共通のリード線は、元の共通リードと反対側のパッドにハンダ付けされていることを確認、反対側に処理を繰り返します。
4. テストND epoxyingデュアルエレメントひずみゲージ
   1. はんだゴールドソケットコネクタ（E363 / 0）リード線の自由端に。この時点で、二要素アセンブリの完全性をテストするために記録アンプ（後述）に歪みゲージを接続する。
   2. 良質電圧抵抗計で抵抗を測定します。要素には、約350Ωの抵抗を登録します。新鮮なはんだと、この時点でResolder不十分な接続。
   3. はんだ接続やデュアルエレメントアセンブリは満足のいくものとみなされている場合、残りの素子膜を切り落とす。
   4. 二液型のシリコーンゴム、エポキシ樹脂（P / N E211）の薄層要素半田パッド上にはんだ接合部を絶縁する。 30分適用前に（ 図1E） -最良の結果を得るために、部分的に20樹脂を硬化させる。
5. シリコーン中二要素ひずみゲージをカプセル化する
   1. 15ミリメートル²およびcに厚さ0.5mmのシリコンシート（P / N 20-20）の3枚をカット蒸留水でシリコーン傾く。カプセル化シリコン（ 図1F）を変形させることなく、最終的なデュアルエレメントアセンブリに対応するために、U字状にシリコンシートの一枚をカット。
   2. コー​​ト透明なシリコーン接着剤でノッチフリーのシリコーンシートの内面。
   3. その後ゆっくりと外側中心から、余分なシリコンを押すだけでなく、空気の泡、ノッチ内のデュアルエレメント·アセンブリーと整列外側のシートをサンドイッチ。慎重に均一な厚さと全く変形が発生しないことを確実にするために24時間のための金属棒材の二つのブロックの間に封入アセンブリをクランプする。
   4. 過剰シリコーンは組み立ておよび硬化の境界に沿って残るようにします。シートシリコーンを（; 図1Gのx 8ミリメートル、一般的に6ミリメートル）所望の最終寸法にトリミングされている場合、この過剰は削除されます。
6. 電線コネクタおよびキャリブレーションの完了
   1. はんだ接合部の強化個別の端子配線上の金のソケットコネクタの3ミリメートル（1/8インチ）収縮チューブ、プラスチック、電極台座（MS363、 図1H）以内に整列してつながる。実験（ 図1I）の間に断線を防止するために、チューブを収縮さ0.125と0.25インチ径の電極台座とワイヤを固定します。
   2. ひずみゲージの信号は高利得ブリッジアンプ（P / N AMP-01-SG）を介して処理されます。電極台座に合わせて - （SL / 6 363）嵌合プラグ付きケーブルを使用して、アンプにひずみゲージを接続します。ねじ付きキャップは、実験中に中断されない信号を維持するために追加のセキュリティを提供します。
   3. メーカーの指示に従って、専用のひずみゲージにアンプの橋、バランスとゲイン設定を調整します。ワイヤは、剛性クランプに水平に出る歪みゲージの先端を貼付し、もともとPascaudらによって説明されているように反対側の端に1グラム静荷重を配置することにより、キャリブレーション^{2、16、17。}

ひずみゲージの急性移植のための外科的処置2。

1. 動物実験の準備：
   1. 食べ物は外科的移植（水は自由に摂取してもよい）前夜実験動物を奪う。
   2. 深く動物を麻酔。チオブタバルビタール（100から150ミリグラム/ kgを、ラット腹腔内）は、端末のために好ましい歪みゲージ注入と実験によるラット¹⁰の持続的な麻酔効果と胃の反射の最小限の変更（ すなわち 、非生存）。足のピンチ反射の不存在についての試験は、麻酔の深さを決定する。
   3. 、手術器具の滅菌切開部位を剃り、獣医眼軟膏を適用し、すべての外科の領域を消毒含むIACUCガイドラインを実験計画によって決定し、承認された無菌手術のためにラットを準備します。注：。ひずみゲージは長期使用のために適合されている場合は、滅菌唯一のエチレンオキシド（ガス）滅菌と歪みゲージ。熱や化学的な滅菌技術の使用は、歪みゲージを破損する恐れがあります。
2. ターミナル実験のための気管内挿管：
   1. 長時間、端末のために、実験は気道を開いた状態に維持するために気管チューブをラットを挿管。胸骨切痕に下顎骨の下縁から首の腹側に2cmの正中切開 - 1を加えます。
   2. 気管を露出するために正中線で鈍的切開を使用して、基本的なストラップの筋肉を分離してください。基本となる食道から気管を分離し、合字を形成するために、気管と食道の間に3-0 ethilon縫合糸のループを配置します。
   3. 甲状腺のすぐ遠位気管の軟骨のリングの二つの間の膜に小さなincisonを行うことで、前方に気管を開きます。気管にポリエチレンチューブ（P / NのPE-270）、長さ5mmの（そして、一方の端部に面取り）の小片を挿入する結紮と所定の位置に固定します。
   4. 所定の位置にバックストラップの筋肉を入れて3-0 ethilonで覆っている皮膚を縫合。
3. 胃腸の表面にひずみゲージ計測機器：
   1. 手術前に＃14のテーパ点3/8サークル針を用いて5 4-0のcmの長さ、以下、無菌の絹縫合 - 4ひずみゲージの四隅を通します。絹縫合糸は、高レベルの柔軟性を提供し、歪みゲージ素子を封シリコーンを損傷しにくい。
      注：絹糸は、非生存手術用および上皮バリアを介した細菌の吸い上げが危険でない内部アプリケーションのために許容可能である。生存手術を必要とする用途では、プロレン縫合糸は、絹縫合糸の編組布の繊維に固有の感染のリスクを低減するために必要である。
   2. 正中線に沿って腹部の皮膚を切開することによって開腹を行います。セクションに沿って腹直筋系出血を防ぐために、接続する白線（無血管）。そして、基本的な腹部の内臓を深く傷つける避けるために、壁側腹膜に非常に表面的な正中切開を行います。
   3. 生理食塩水浸した綿先端アプリケーターを用いて胃を体外に出す。慎重に腹部切開の尾終わりに生理食塩水に浸したガーゼパッドの上に置くことによって、位置の胃に保管してください。
   4. 円形の平滑筋線維と平行してカプセル化されたひずみゲージのグリッドを合わせます。以前にねじ切り縫合糸（ステップ2.3.1）を使用して、＃14テーパーポイント3/8サークル針を使用して胃体の腹漿膜面にゲージの角を添付してください。組織の損傷および潜在的な出血を最小限にするために、カッティングエッジの針を使用しない、胃の表面上の任意の表面的な血管を穿孔しない。
   5. 眼底/コーパス境界付近の胃の大弯に沿ってゲージの縫合パターンを開始し、続行次の小弯に向けて眼底/コーパス境界に沿って。ひずみゲージの基礎となる漿膜はどちらも弛みや過度に最良の結果を得るために延伸してはならない。
   6. 慎重に生理食塩水に浸した綿先端アプリケーターを使用して、その解剖学的位置に胃を返す。
   7. 急性モデルでは、歪みゲージが腹部切開の閉鎖前に、正中切開の尾終わりにつながる体外に出す。動物または端子配線コネクタの操作中にストレインリリーフを提供するために、動物（ 例えば 、後足）にフリー電線を固定します。 3-0ナイロン縫合糸とは別に腹直筋や腹部の皮膚を閉じます。慢性モデルでは、ラットの背側に沿って皮下に導線を固定し、頭蓋骨¹⁸の上方にそれらを体外に出す。
   8. 外科用器具の後、頭部を支え、上半身を昇格させる定位フレームに動物を配置します。後者の工程は、再を減らすのに役立ちます記録中spirationアーティファクト。直腸温度を監視し、フィードバック制御加熱パッドを使用して、37±1℃で維持する。
   9. チオブタバルビタール麻酔を利用し、端末の実験の最後に、動物を安楽死についてアメリカ獣医師会（AVMA）のガイドラインと一致した方法で安楽死させなければなりません。
4. 胃運動の記録：
   1. 任意の市販のDCブリッジアンプで歪みゲージ信号を増幅する。
   2. 任意の市販のデータ収集システムのチャートレコーダ機能を使って、コンピュータ上のDC出力信号を記録する。
      NOTE：アンプ出力のハードコピーは、ポリグラフチャートレコーダーを介して生成することができる。

脳幹刺激後の胃収縮の3代表測定

1. 脳幹と第四脳室の暴露
   1. 外科用器具、およびplacem後、首の付け根に向かって後頭骨から2cm正中皮膚切開 - 定位フレームにおけるチオブタバルビタール麻酔動物のENTは、1.5を作る。
   2. 正中線に沿って、基礎となる首の筋肉の左右の筋腹に参加する結合組織を分離する（表在から深いの筋肉が挙する耳の長母頭蓋部分、挙筋耳用長母尾部及び広頸筋頭蓋部分である）。
   3. 正中線が明確に定義されて露出されたら後頭骨から挙する耳の長母を切り離します。
   4. 慎重に、基礎となる硬膜から広頸筋筋を切り離す鈍的切開を使用して頭蓋骨の尾領域を露出させる。
   5. 慎重に後頭顆に左右対称に延びた大後頭孔に沿って硬膜を切り離すために、新しい25 G針を使用してください。
   6. 第四脳室の上にある軟膜とクモ膜髄膜を除去し、脳幹を露出するために＃5デュモン鉗子を使用してください。
2. 管理第四脳室の甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンまた​​は静脈内ニトロプルシドナトリウム
   1. 秤量し、50μMTRHの最終濃度に達するように滅菌生理食塩水で甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）に溶解する。
   2. 150μMのSNPの最終濃度に達するように滅菌生理食塩水でニトロプルシドナトリウム（SNP）を計量し、溶解する。
   3. 10μlの注射器を使用して、胃の収縮の記録を容易にするために、脳幹第四脳室の背側表面に（最終投与量は100ピコモルに等しい）TRH2μlの管理。
   4. 滅菌シリンジおよび27Gの針を用いて、胃の弛緩の記録を容易にするために、尾静脈を介してSNPの150モル/ kgを投与する。

結果

チオブタバルビタール、麻酔をかけたラットからの代表的データを図2に示す。上のトレースは、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンの脳幹内投与（TRH、100ピコモル）、既知の運動性増強ペプチド^3、19時にラットから胃体収縮を表しています。これは、前の相性胃平滑筋活性の増加をベースライン収縮を示している。注：胃の収縮におけるこれらのピークの分析はオームズビーとベース²⁰が考案したオリジナルの式に従う

運動性指数=（N _{1×1）+（N 2×2）+（N 3×4）+（N 4×8）}

この計算式に基づいて、Nは、特定ミリグラムの範囲内のピークの合計数に等しい。 50、60 - - 100mgの、110から200ミリグラム、より大きな信号したがって、0 mgの信号は無胃運動性の指標であることを仮定し、ピーク·ツー·ピーク正弦波信号のグループ化は、25として計算することができるそれぞれN ₄を介して、N _...

ディスカッション

ここに提示された手順は、各施設は、生物学的用途のために敏感な小型の歪みゲージを製造することができ、これらに限定されないが、小実験動物における胃腸の運動。これらのひずみゲージの商業生産が停止しているので、胃腸の機能を調査する研究室は、利用可能な実験的なアプリケーションの全範囲を許可することはできません、他の技術に限定されている。このレポートでは、以前に記載された技術¹⁵の更新され、より詳細な説明を提供しています。テキストとそれに付随するビデオは、具体的には私たちが製造プロセスの開発や習得中に認識の一般的な落とし穴の解決策に取り組む。

各ステップは、記載されているように、成功した製造に関する技術を提示する。きれいにし、安全にすべての接続をハンダ付けするだけでなく、solderinから過剰な熱を持つ要素への損傷を避けるには十分注意Gプロセスの成功への最も頻繁な課題である。細いゲージワイヤは、適切に収縮チューブまたはシリコーンエポキシ樹脂で補強されておらず、ゲージを穏やかに曲げられたときに信号が存在しないことになる場合に破断する傾向がある。プラスチック製端子台内の金色...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ひずみゲージ素子	Micro-Measurements(ビシェイ社製品グループ)	EA-06-031-350	線形パターン、箔、応力解析用ひずみゲージ(2個必要) www.vishaypg.com/micro-measurements/ or http://www.vishaypg.com/docs/11070/031ce.pdf
エポキシフェノール接着剤	M-bond 610	ひずみゲージ素子	の接着用汎用接着剤http://www.vishaypg.com/docs/11024/wirecable.pdf
3 導体絶縁電線	336-FTE	ファインゲージ、フレキシブル汎用電線	http://www.vishaypg.com/docs/11024/wirecable.pdf
フラックスおよびロジン溶剤キット	FAR-2 M-Flux AR キット	液体はんだフラックス	http://www.vishaypg.com/docs/11023/soldacce.pdf
はんだ	361A-20R-25	ひずみゲージ用途に最適化および推奨	http://www.vishaypg.com/docs/11023/soldacce.pdf
>金ソケットコネクタ	PlasticsOne	E363/0	電極台座用ソケット接点 http://www.plastics1.com/PCR/Catalog/Item.php?item=407
電極台	MS363	ワイヤ接点用安全なプラットフォーム	http://www.plastics1.com/PCR/Catalog/Item.php?item=499
6線式ケーブル	363プラグ ビニールSL/6	電極台座と端子端の錫メッキはんだラグに一致するプラグアダプター付きプレハブビニールコーティングケーブル(カスタマイズされた長さ)
			ゲージ/ワイヤーはんだ接合部用ポッティング媒体 http://www.eis-inc.com
HOTweezers	明星株式会社	4型B	ワイヤー絶縁ストリッパー http://www.impexron.us
はんだ付けステーション	ウェラー(アペックスツールグループ)	WES 51	高品質のはんだ付け装置 http://www.apexhandtools.com/weller/index.cfm
http://www.eis-inc.com または http://www.amazon.com
	トレルボルグシーリングソリューション ノースボロライフサイエンス	Pharmelast 20-20	Encapsulating strain gage elements 10 B Forbes Road Northborough, MA 01532 (800) 634-2000
Amplifier	Experimetria Ltd	AMP-01-SG	http://experimetria.com/Biological_amplifiers.php

座 シリコーンゴム鋳造コンパウンドEIS電気製品 エラントロンE211 シリコンシートを通じて利用可能