の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

サマリー

ラテックス凝集試験は、 肺炎連鎖球菌の血清型のための、簡単、迅速かつ安価な方法であり、また広く診断微生物学に適用されている。この原稿は、ラテックス凝集試薬、品質管理手順の内製および肺炎球菌血清型に対するこの技術の応用を説明しています。

要約

ラテックス凝集試薬は、微生物の診断、同定、血清型決定に広く使用されています。Streptococcus pneumoniae(肺炎球菌)は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因です。現在のワクチンは肺炎球菌嚢を標的としており、90種類以上の莢膜血清型があります。したがって、肺炎球菌分離株の血清型検査は、ワクチン接種プログラムの影響を評価し、疫学的な目的のために重要です。世界保健機関(WHO)は、血清型肺炎球菌の「ゴールドスタンダード」であるQuelung試験の代替方法として、ラテックス凝集を推奨しています。ラテックス凝集は、比較的簡単で、迅速で安価な方法です。そのため、リソースの乏しい環境や、大量のワークロードを抱えるラボに適しています。ラテックス凝集試薬は、ラテックス粒子に受動的に結合する市販の抗体を利用して、社内で調製できます。この原稿では、ラテックス凝集試薬の製造方法と品質管理方法について説明し、時間と費用対効果の高い逐次試験アプローチについて詳しく説明します。

この生産方法と品質管理方法は、他のテスト目的にも適しているかもしれません。

概要

肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）は、特に資源の乏しい設定^1,2で、世界的に5歳未満の子供における罹患率および死亡率の主要な原因である。肺炎、敗血症など生命を脅かす状況にローカライズされた感染症から肺炎球菌疾患の範囲とは^、1,2髄膜炎。

肺炎球菌の90以上の血清型は、それらの莢膜多糖³の差に基づいて同定されている。現在のワクチンは、莢膜多糖を標的とし、侵襲性疾患^の原因となる主要な⁴種の血清型からの保護を提供する。肺炎球菌血清型を分離することは台車や病気に対するワクチン接種の影響を評価するだけでなく、より広範な疫学的情報^5,6を提供するために重要である。肺炎球菌血清型の現在の「ゴールドスタンダード」方法は膨化試験であるが、それは時間がかかり、perfoするためにいくつかのスキルが必要ですRM ^7。ラテックス凝集は、世界保健機関⁷が推奨する代替血清型別法である。ラテックス凝集は、実行することが迅速かつ簡単であり、世界中で多くの研究室^8-11に採用されている。重要なのは、ラテックス凝集法は、肺炎球菌血清型^10,12-14ための膨化試験に匹敵する精度を示している。全体として、このメソッドは、リソースの乏しい設定だけでなく、ハイスループットラボに最適です。

ラテックス凝集試薬（「ラテックス試薬は'）ラテックス粒子¹⁵に対する抗体の結合によって作成される。陽性反応では、これらの標識された粒子は、特定の抗原の存在下で凝集。市販のラテックス試薬は、血清型の制限された範囲で使用できます。ラテックス試薬はまた、市販の抗血清^10を用いて社内で製造することができる。抗血清（「プール」）の混合物だけでなく、肺炎球菌sに特異的な抗血清さらにグループ内での血清型を定義するためのerogroups（ 例えば、グループ19）、個別の血 ​​清型（ 例えば、血清型5）、および特定の抗原に対する（ '要因'、 例えば 、血清型19Aを認識要因19cは^）16用意されています。

この原稿は、ラテックス粒子に市販の抗血清の受動的な添付ファイルを用いたラテックス試薬の製造における主要なステップの概要を説明します。品質管理（QC）本方法の態様が記載されており、肺炎球菌血清型のためのラテックス試薬を使用するためのプロトコルが含まれている。

プロトコル

社内ラテックス試薬の調製

1. グリシン緩衝食塩水（GBS）の調製
   1. 1.5グラムのグリシン、11.7グラムの塩化ナトリウムおよび200mlのガラス製ビーカーに100mlの蒸留水を加える。
   2. マグネチックスターラーを用いて溶解するために混合する。
   3. メスシリンダー500mlに混合を移し、200ミリリットルの合計を作るために蒸留水を加える。
   4. 、200ミリリットルのビーカーに戻って解決策を移し、pHをチェックし、5M水酸化ナトリウムで8.2に調整してください。注：水酸化ナトリウムは腐食性で、個人用保護具を着用してください。
   5. フィルターは250ミリリットルpreautoclavedスクリューキャップ付きガラス瓶に、0.22μMのフィルターと複数の60ミリリットルの注射器を用いて溶液を滅菌する。
   6. RTで保管してください。
2. 0.2％ウシ血清アルブミンGBSの調製
   1. 200mlのガラスビーカーにウシ血清アルブミン（BSA）粉末を0.2g、およびGBS 100ミリリットルを加え、マグネチックスターラーを用いて溶解するために混合する。
   2. フィルター250ミリリットルpreautoclavedスクリューキャップ付きガラス瓶に、いくつかの60ミリリットルの注射器を使用して、0.22μMのフィルターを通して溶液を滅菌する。
   3. 4℃で保存。
3. ラテックス試薬調製
   1. 2ミリリットルの丸底マイクロチューブにラベルを付けます。
      注：丸底チューブは、抗体の付着に影響を与える可能性が粒子の沈降を最小限に抑えるために使用される。
   2. 滅菌チップをマイクロチューブにGBSの975μlを添加してP1000ピペットを用いて、その後ラテックス試薬（ すなわち、プール、グループ、タイプまたは因子）を調製されるための適切な肺炎球菌血清を25μl加える。混合する5回転倒。
   3. 滅菌生理食塩水1,080μlにラテックス粒子の120μLを添加することにより、ポリスチレンラテックス粒子1:10に希釈する。
      注：これは、より大きな体積で製造することができるが、ラテックス試薬が生成されるたびに新たに作製する必要がある。
   4. 1に（ステップ1.3.3で調製した）午前1時10分ラテックス懸濁液1,000μl加え、000μlの1時40抗血清懸濁液（ステップ1.3.2で調製した）。混合する5回転倒。
   5. ゆっくりと回転ホイール上で37℃でインキュベートする（ 例えば38.5センチ、直径の車輪4 rpm）で2時間。
   6. 1100×gで15分間遠心します。上澄みを捨て、優しく滅菌生理食塩水2mlにペレットを再懸濁します。
   7. 1100×gで15分間遠心します。上澄みを捨て、GBSの1ミリリットルを追加して、静かにペレットを再懸濁します。
   8. ラベル5ミリリットルにラテックス懸濁液をピペットにキャップをスクリュー管。 GBSの別の1ミリリットルを追加します。
   9. 0.2％BSA（w / v）の液（pH 8.2）（ステップ1.2で調製した）を含有するGBSの2ミリリットルを追加します。防腐剤としてアジ化ナトリウム（w / v）の10％の40を添加する。
      注：アジ化ナトリウムは吸入すると有害であり、皮膚や眼への刺激性である。これは、吸入暴露の危険性を最小にするように、それは、むしろ粉末形態より調製された10％溶液を購入することが望ましい。手袋などの保護具（この試薬を取り扱う際のdスプラッシュゴーグル）を着用する必要があります。詳細については、製品安全データシートを参照してください。
   10. 4℃で保存ラテックス試薬。
4. 陰性対照ラテックス試薬の調製
   1. 2ミリリットルの丸底マイクロチューブにラベルを付けます。
      注：丸底チューブは、抗体の付着に影響を与える可能性が粒子の沈降を最小限に抑えるために使用される。
   2. 滅菌チップをマイクロチューブにGBSの975μlを添加してP1000ピペットを用いて、その後25μlの正常ウサギ抗血清を追加します。混合する5回転倒。
   3. 段階的に上記の1.3.10に1.3.3のように実行します

ラテックス試薬2。品質管理（QC）

1. RTにラテックス試薬を持参してください。使用直前に、穏やかにチューブを数回反転させてラテックス試薬を混合する。
2. ガラス顕微鏡スライド上に15μlのピペッティングして自己凝集のための試薬を確認し、ステップ4.7と以下の4.8のように進んでください。 Aいいえがあってはならないラテックス粒子のgglutination。試薬は、白とスムーズに表示されます。
3. 低継代肺炎球菌分離株のパネルに対する試薬をテストします。分離株のパネルは「ターゲット」血清型の分離株（試薬の具体的な血清型がテストされている）と '非標的」血清型（通常は交差させない他の血清型の分離株が含まれている必要があり、手順3でのように調製したばかりの増殖させた培養物を使用してください）試薬と反応する。 QCを受けて、各ラテックス試薬のための各標的および非標的血清型のうちの少なくとも1つの単離を含めます。特定の血清型の唯一の標的または非標的血清型、テストつの異なる分離株が存在する場合。
   注：テストパネルは侵襲性疾患および/または型培養コレクションにまれであるそのうちのいくつかは、各血清型のいくつかの分離株を含むべきである。彼らはしばしば血清型に対してより厳しいあるので、いくつかのキャリッジ単離物に含めることが好ましいことがある（データは示していない）、それによってさらに容量oをテストする試薬fと試薬が分離株の侵襲性とキャリッジの両方を血清型のできる可能性があることを保証します。
4. 標的および非標的の肺炎球菌によるラテックス試薬のテストを続行しますが、手順3と4以下に記載した方法に従って分離します。
5. 少なくとも年に一度、その後は品質管理、製造時の試薬および。
   注：試薬はQCに合格しなかった場合、バッチは破棄され、新たな準備がなされなければならない。リピートQCに障害が発生した場合では、試薬はOrtika ら 、2013 ⁸および以下の説明で説明されている代替方法を使用して製造することをお勧めします。

血清型用肺炎球菌培養の調製

1. 無菌ループを使用すると、肺炎球菌の単一コロニーを選択 一次接種物は、プレート表面の約3分の1を覆うように固体の非選択性血液寒天上にこれを分離し、連勝。単一のコロニーのためのストリーク。
   注：脱線維素ウマやヒツジ血液から調製されたプレートが適している。しかし、ヒトの血液またはクエン酸処理動物の血液を用いて調製した血液プレートはありません。
2. 5％CO ₂の雰囲気中で37℃でプレートO / Nインキュベートする_。
3. 純度のプレート上での成長を観察し、血清型別のために十分な成長があることを評価する。
   注：肺炎球菌分離株の純粋培養は、血清型別に必要とされている。プレート表面の約3分の1をカバーする当社の経験、コンフルエント、またはコンフルエントに近い成長では通常、血清型別を完了するのに十分である。肺炎球菌培養物が自己分解しやすいかもしれたように、血清型別のために準備文化がサブカルチャーの24時間以内にテストする必要があります。血清型が始まる前に、15以上の20分に、インキュベーターから培養プレートを服用しないでください。

ラテックス凝集血清型を実施4。

1. 冷蔵庫からすべてのラテックス試薬を除去し、それらを約室温に温めるimately 30分。使用直前に、静かに試薬を混合するためにチューブを反転。
2. 顕微鏡スライドにラベルを付けます。
3. 顕微鏡スライド上の陰性対照ラテックス試薬15μlのを置きます。
4. ループが約半分になるように滅菌した使い捨て1μlのループを使用すると、肺炎球菌文化のスイープを取る。
5. 静かに陰性対照ラテックス試薬の滴に近いスライドの表面上に接種物を汚す。接種物をガラススライド上に表示されるはずです。
6. 迅速かつ徹底的にループを使用して、陰性対照ラテックス試薬に接種材料を混ぜる。ドロップがその最初のサイズよりさらに広がっていないことを確認してください。
7. 両端にそれを持って、スライドをピックアップ。前後に1分間のスライドをロック。ゆっくりと移動する液体を保持し、液滴の大きさが増加しないように注意してください。
   注：別の方法として、プレートロッカーを使用しています。
8. によって、すなわち （巨視的凝集のために守って裸眼）、黒背景に対してサスペンションのクリア。
9. ネガティブコントロールラテックス試薬は凝集を示さないか、クリアは上記のステップ4.1から4.8に陰性対照ラテックス試薬用のテストラテックス試薬の交換、文化のテストを続行した場合。新鮮なループは、毎回使用する必要があります。プールで始まるラテックス試薬のテストを続行します。
10. 陽性の検査が得られるまで連続して 'プール'ラテックス試薬のそれぞれをテストします。
    注：プールのテストの順序は、例えば、最初のスライド上の3つの可能性が最も高いのプールをテストすることにより（特定の血清型のローカル発生率を反映するために'ラウンド'で行うことができる肯定的な反応が得られない場合、テスト）などが陽性反応が得られるまで、第二スライド上の残りのプールの最も可能性の高い次の3。これは、必要な時間と試薬を最小にする、最も一般的な血清型が最初にテストされることを保証する。
11. 抗血清の製造元のキーを使用すると、陽性プールで表現されている個別の抗血清を決定します。
12. 上記の手順4.1から4.8のように、「グループ」または「タイプ」を決定するために、個別に陽性プールに含まれているグループやタイプのそれぞれをテストします。
13. 抗血清の製造元のキーを参照することによって、その結果を決定します。 'タイプ'が（ 例えば、血清型5）と判定された場合、それ以上の試験は必要とされず、この結果が記録されている。
14. 'グループ'が（ 例えば、グループ19）と判定された場合、試験される因子を決定するために、製造者のキーを参照する。個人の要因」のラテックス試薬とテストを続行し、最終的な血清型（ 例えば、血清型19B）を決定する。

結果

ラテックス粒子に結合型特異的抗体は、肺炎球菌のカプセルに結合し、抗体標識された粒子の凝集が¹⁵に移行する。 図1（a）は、目に見える凝集や背景のクリアすることを特徴とする陽性反応を示す場合に正のラテックス反応が起こるサスペンション。陰性反応は、滑らかで、白色の残りのラテックス凝集試薬懸濁液（図1B）によって特徴付けられる。陽性反応は1分の時間間隔（約20秒、通常の検出可能）の終了前に観察されるべきであるように、試薬が最適化されています。私たちは、1分間の時間間隔の後の​​反応を読むことをお勧めしません。ごくまれに、反応は（データは示していない）背景懸濁液をクリアすることによって伴わないドロップのエッジの周りの弱い凝集を表示したり、背景なしのクリアと「糸」が表示されます。これらは、最もなどである LY否定的な反応。このような場合、私たちは再試験および/ ​​または別の血 ​​清型別法（例えば膨張反応^17）を使用してさらに調査することをお勧めします。

図1の正および負のラテックス凝集反応。陽性反応（A）または負の反応（B）を示すラテックス凝集試薬と混合肺炎球菌単離物の調製。背景の消去に伴う凝集が.There陰性対照ラテックス試薬または陰性試験反応（B）において目に見える凝集しない陽性反応（A）に見られる。写真^8は、許可を得て使用。「ターゲット= "_ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

ラテックス凝集は、肺炎球菌血清型のため、簡単な、迅速かつ安価な方法である。市販の肺炎球菌ラテックス凝集試薬が利用可能であるが、それらは現在、すべての既知の肺炎球菌血清型^10,12を区別しません。しかし、ラテックス凝集試薬は、容易に特定の肺炎球菌莢膜抗原に対して惹起購入した抗血清を用いて社内で製造することができる。ここに記載の方法において、抗体は、受動ラテックス凝集試薬のセットを作るためにラテックス粒子に結合している。

肺炎球菌の多糖カプセルは^18,19を分離する上でラテックス粒子に結合した特異的抗体が抗原に接続すると、正のラテックス反応が起こる。抗体に付着したラテックス粒子は、特定の抗体 - 抗原反応は拡大せずに可視化することを可能にする。

ラテックス凝集法は、ハイスループット実験室のANに適した方法である資源の乏しい設定のためにもdは。ラテックス凝集法の主な利点には特殊な装置がテストを実行するために必要とされないことであり、試薬が4°C ⁸で保存した場合、少なくとも2年間の貯蔵寿命を有し、それは、安価で簡単かつ迅速であることを実行する。ラテックス凝集法による肺炎球菌分離株の血清型は、約10分を要し、最大4つのラテックス試薬は、1つのスライド上で並行して試験することができる。血清型の有病率は、関連する疫学的状況のために知られている場合にはさらに、テストは膨化試験¹⁷と同様に、最も一般的な血清型を含むプールが始まるのラウンドで行うことができる。このアプローチは、血清型を決定するために必要なテストの数を最小限に抑える。この方法はまた、異なるオペレータ間の高度に再現可能である（データは示さず）。ラテックス凝集型別の欠点は、試薬を製造するには、約4時間を考慮して、時間を消費することである。複数レアージュもののNTSは容易に並列的に製造することができる。さらに、いくつかの抗原は、いくつかの抗血清との交差反応で、その結果、異なる肺炎球菌血清型間で共通している（ 例えば 、血清型29、42とグループ35）。しかしながら、これらの交差反応（通常はより問題交差反応性抗体を除去するために前吸収される）は、市販の抗血清と追加の反応テーブルを使用する場合によく特徴づけされているが、存在する血清型を区別するために、製造業者によって提供される。抗体は、ラテックス粒子上に適切に位置合わせされていない場合、ラテックス試薬はまた、クロス反応し得る;これらは、QCの障害として検出される。われわれの経験では、厳格なQCは、市販の抗血清を製造するために使用される場合にも、この方法の成功の中心である。 QCは、試薬ごとに約15分かかりますし、適切な品質管理のセット上記のように隔離するに依存しています。

ここで説明する方法は、陽性反応ウェルw iを与える試薬になる試験期間薄い。われわれの経験では、偽陽性（データは示されていない）、実際にはまれである。時折偽陰性反応が観察される。通常、これらは、特定の抗血清の既知の問題（ 例えば、血清群6分離株はプールB抗血清と反応しない場合があります）、または分離株によるカプセル発現のダウンレギュレーションに関連している。偽陽性または陰性反応が「盲端」結果につながる多くの場合のように、製造業者によって提供される血清型algrorithmを使用することも重要である。反応は解釈が困難であるときに、これらのケースでは、そして、私たちはそのような膨張反応などの代替の方法で繰り返しテストおよび/またはテストすることをお勧めします。

いくつかのトラブルシューティングが時折満足なラテックス試薬を行う必要がある。ここで説明する方法では、抗体は、受動的吸着^15,19を介してラテックス粒子に結合しているので、重要な変数はどれだけかを判断使用される抗体の濃度は、ラテックス粒子の表面を覆い、抗体の活性部位^15,20のその後の位置合わせされている。不十分なまたは過剰な抗体をラテックス粒子に結合している場合にはその結果、抗体-抗原反応は最適ではなくなり、不満足な試薬は^15,20,21を製造することができる。抗体価は、抗血清の異なるロット間で変化したように、希釈液の標準セットは、ウェル^8を実行する試薬を生成しない場合があります。有用な出発点は、1:40希釈の抗血清を使用し、これが成功しない場合、さらなる抗血清を希釈することである。私たちの経験では、これは通常は問題^を解決します^8。症例数が少ないでは試薬は、標的分離株を用いて検査したときにサスペンションのクリアを伴わない弱い凝集を示してもよい。抗血清を希釈し、これらの場合に、試薬の質を改善しないが、良好な試薬は通常、遠心分離を省略することによって製造することができ、洗浄が^{8,22ステップ} 。

抗体被覆ラテックス粒子は、多くの異なる微生物^15,20の検出、同定または血清型のための診断微生物学で一般的に使用される。このように、ここで説明する方法は、適切な抗血清を入手し、適切なQC手順が採用されて提供され、他の目的のためのラテックス試薬を調製するために適切であり得る。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリスチレン、800 nm	Sigma	65984-10 ml-F	必要に応じて他の容量
正常なウサギ血清	抗体オーストラリア	NRS-1ml	または必要に応じて他の容量、使用前にRTに持参
肺炎球菌(Neufeld)抗血清	SSI Diagnostica	さまざまな	使用前にRTに持参してください http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Sterile Bovine Albumin	シグマ	A-4503	使用前にrRTに持参
アジ化ナトリウム10%(v / v)溶液	VWRインターナショナル	ROAC3902/100ml	注意:吸入すると危険です;皮膚と目への刺激性
エッペンドルフ セーフロックチューブ、2 ml	エッペンドルフ	0030 120.094	丸底
ナトリウム	メルク	10241.AP
校正済み使い捨て接種ループ 1 & マイクロ;l	Copan	CD175SO1
ガラス顕微鏡スライド 76 mm x 26 mm	Thermo Fisher Scientific	LBS 2950RC
5 M NaOH	BDH	10252	注意:腐食性が高い
Glycine	Merck	10119.05
馬の血液寒天培地(HBA)プレート	Thermo Fisher Scientific	PP2001	使用前にRTに持参してください http://www.thermofisher.com.au
回転ホイール	ワイブル・エンジニアリング・デベロップメント・コーポレーション
ポリスチレン平底スクリューキャップチューブ、5ml	テクノプラス	S5016SU
針なし60mlシリンジ	テルモ	SS-60L
ミレックス-GPシリンジフィルターユニット、0.22 以上m	Merck Millipore	SLGP033RS
Neufeld antisera	Statens Serum Institut		型決定の鍵 http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
肺炎球菌因子血清の鍵	Statens Serum Institut	18058	グループ内の血清型の決定には、 http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
>*ほとんどの材料

またはに基づく微粒子してください してください塩化 血清で代替ソースが利用可能です