拘束されていない全身プレチスモグラフィを使用したマウスにおける呼吸機能の測定

サマリー

呼吸生理学の評価は、伝統的に、動物の拘束や鎮静を必要とする技術、に頼っています。非拘束全身プレチスモグラフィは、しかし、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供する。また、この技術は長期的な研究を可能にしたマウスの繰り返し呼吸評価を可能にする。

要約

呼吸機能障害は、世界での罹患率および死亡率の主要な原因の一つであり、死亡率は上昇し続けている。げっ歯類モデルにおいて肺機能の定量的評価は、今後の治療法の開発における重要なツールである。一般的に侵襲容積脈波と強制振動を含む呼吸機能を評価するための技術を使用していました。これらの技術は貴重な情報を提供するが、データ収集に起因麻酔および/または動物の侵襲的な計測のための必要性にアーチファクトおよび実験的変動性を伴うことができる。これとは対照的に、拘束されていない全身プレチスモグラフィー（UWBP）は呼吸パラメータを分析することで、正確な、非侵襲的、定量的な方法を提供しています。この技術は、従来のプレチスモグラフィー技術に共通で麻酔し、拘束の使用を回避する。このビデオでは、機器のセットアップ、キャリブレーションおよび肺機能の記録を含むUWBP手順を紹介します。それ収集したデータを分析するだけでなく、動物の動きに起因する実験的な外れ値や工芸品を特定する方法を説明します。この技術を用いて得られた呼吸パラメータは一回換気量、分容積、吸気デューティサイクル、吸気流量及び呼気時間を吸気時間の比率を含む。 UWBPは専門的なスキルに依存しており、実行するのに安価ではありません。潜在的なユーザーにとって最も魅力的なキーUWBPの特徴、そして、同じ動物で肺機能の反復測定を実行する機能である。

概要

肺機能障害は、世界で罹患率および死亡率の主要な原因の1つである。条件は咳、胸の痛みや呼吸困難の代名詞不十分な酸素交換、ことを特徴としている。世界的な死亡率^1〜10％のための呼吸器疾患を占めている。世界保健機関によると、死亡率に起因永続的な喫煙、汚染および職業的刺激物に上昇するように設定されている。 UWBP強く^2を分析し、従来の生化学的および組織学的を補完する肺の生理機能を研究するための有用な付加である。肺の評価のために使用される他の手順はUWBPと同じ利点を提供しない。侵襲プレチスモは、動物が^3,4麻酔されるので、結果として呼吸測定は、必ずしも自然な状態を反映していない必要があり、一般的に使用される技術である。さらに、機械的な換気および化学的な課題のための必要条件は、将来の測定値^3,4を排除する。呼吸データを収集する別の方法は、UWBP ⁵と比較して、呼吸パラメータの細かい変化に敏感で強制振動によるものである。強制振動は、しかし、侵襲的技術であり、データ収集^5-7の動物の終端を必要とする。

UWBPは、特殊なチャンバー内に動物を配置することを含む。吸気の間、呼気が暖められると水蒸気圧の上昇、肺内の加湿ガス⁸の熱膨張を引き起こす。この効果は、プレチスモグラフ室⁸内の圧力の上昇を作成する風量の純変化を引き起こす。反対は、動物からの呼吸波形を生成する呼気中に発生します。波形解析は、その後、呼吸トレースから測定するために使用される：呼吸数（呼吸/分）、全呼吸サイクル時間（秒）、吸息/呼気時間チタン（Ti / Teを、秒）により、各一回換気量（Pに圧力の変化_T）。 図1は、呼吸器トレースからそれぞれの測定値の原点を示しています。これらの測定は、計算が簡単で、複数の呼吸パラメータは、これらの測定値から導出することができる。これらのパラメータは次のとおりです。一回換気量（空気の体積が通常の吸気と呼気との間を移動）、分量（毎分、肺から吸入されるガスの体積）、吸気デューティ·サイクル（総呼吸サイクルの持続時間に吸気時間のパーセンテージ）と吸気流量（所定の時間内に吸入された空気の量）。

UWBPは、動物モデルにおける呼吸生理学の正確な、非侵襲的、定量的な分析を提供し、呼吸器疾患および肺機能^6,9の進行を測定するために使用することができる。他の容積脈波法に反して、UWBPは、麻酔、拘束や工芸品と実験変動^6,9を生成する侵襲的な操作の使用を回避する。麻酔は、呼吸を抑制することができる心拍数を変化させ^、10を制御するために挑戦することができる。拘束は、コルチコステロンおよびエピネフリンリリース^11,13経由による追加的なストレスに呼吸の増加を誘導する。 UWBPの重要な特徴は、長期的な研究には、影響を受けやすいこと、生理的な評価を繰り返される。 UWBP強く、肺生理学の長手方向の評価のために推奨され、将来の呼吸の薬剤の査定のための貴重なスキルを提供しています。

ブレオマイシン、オボアルブミン、および低酸素症は、いくつかの研究において、呼吸課題を誘導するために利用されているとUWBPが正常に正確な肺の生理学的な評価^7,9,13-16を測定している。記載されたプロトコルは、標準的な成人の実験マウス用に設計されている。しかし、UWBPは、ラット、モルモット、および非ヒト霊長類^17-20などの他の動物に適応されている。 UWBPは、肺機能不全の評価に限定されるものではなく、肺の成熟³の評価のために使用されてきた。UWBPの汎用性、シンプルさと再現性が動物で肺機能を評価するための優れた手法を確立した。さまざまなソフトウェアが（資機材の表を参照）、この手順に従うことが要求されます。経験豊かな科学者は、1時間以内に、マウスでは、このプロトコルを実行することができるであろう。

プロトコル

注：以下の実験手順は、モナッシュ大学の動物倫理委員会によって承認され、科学的目的のための動物の管理と使用（2006）の実践のためのオーストラリアの規範に従って行われる。代表的な結果を生成するために使用される成体雌C57BL / 6マウスをモナッシュ動物Servicesから入手した。マウスを、12時間の明暗サイクルで、特定病原体を含まない、温度および湿度制御された部屋で飼育した。これらのマウスは、餌と水を自由に摂取させた。

1。初期セットアップ

1. USBケーブルを介して記録するためのデータ収集マシンにラップトップ/デスクトップを接続します。
2. BNCケーブルを経由してデータ収集機の「入力1」に「出力1」からブリッジ·アンプを接続します。
3. オクタルブリッジアンプの「チャンネル1」への圧力変換器を挿入します。上のデータ収集機を回して、解析ソフトウェアを開きます。ソフトウェアは自動べき自動的（資機材の表を参照）機器のセットアップを検出する。
4. ソフトウェアのセットアップツール·バーに見つかったオープンチャンネル設定。変更チャンネル数は1に記録されている。
5. 室内圧力とブリッジアンプを校正する水柱装置を測定するための気圧計を設定します。水柱装置は、プラスチックチューブによって接続された2つの5ミリリットル血清シリンジピペットを含む。
6. 水で列を記入し、水位が定規とバランスしていることを確認。プラスチックチューブの一枚は、各ピペットの上部に接続します。 図2は、セットアップ水柱を示しています。

2橋アンプキャリブレーション

注：水柱への空気の注入は、1cmのH ₂ O撓みを作 ​​成するために必要とされるブリッジ増幅器を較正する。これは条件の単一のセットの下で発生し、ユーザの装置に依存しているでしょう。明確にするための手順は、Dこの研究室では、キャリブレーションを実行する方法emonstrate。

1. 300μlに1mlシリンジを撤回。水柱の右側のチューブの端に活栓にシリンジを取り付けます。注：ストップコックをシリンジと水柱に開放されていることを確認し、室内の空気を閉じた。水位は、この時点でバランスされていない場合は、室内の空気と水の塔に開いていること、これが水を再調整しますので、ストップコックを回します。水柱の左側のチューブは、シリンジの急落によって誘発される圧力の変化を測定するために圧力変換器に接続されるべきである。
2. 圧力トランスデューサ（変換器のトップリング）上のコネクタに左側に水柱からチューブを取り付けます。
3. ソフトウェアの右側にメイン画面で1チャンネルと「ブリッジ·アンプ」を（資機材の表を参照）を選択するために、次の発見スクロールダウンメニューを選択します。
4. 入力する5 mVの、20Hzのローパス、への設定が「反転」ボックスをチェックし、「ゼロ」をクリックします。 〜0mVにトレースを設定するために「ゼロ」をクリックしてください。見やすく1：4にウィンドウサイズを小さくしてください。
5. すべてがセットアップすると、3秒のためにそれを残して、1ミリリットルの注射器を押し下げる。圧力が変更されているので、これはソフトウェア上で突然のスパイクが表示されます。 300μlを押されると、圧力を1cmによって水柱の中の水を移動します。この既知の値は、ブリッジ·アンプを校正するのに役立ちます。
   NOTE：起因300μlの押下にチャンバ内の圧力の増加は、後の計算に使用されるP _K値に相当する。
6. ブリッジアンプウィン​​ドウの左下隅に見られる「入力装置」を選択します。
7. 前そうでなければ「ゼロ地域」として知られているスパイクの「バックグラウンド·トレース」を強調表示します。
   1. 次の「ポイント1」の横にある矢印をクリックして、このは、BACが生成されます-0.002 MV-0.002 mVの（値が正確に0mVになることはありません）の範囲内でkground信号。
   2. バックグラウンド信号ウィンドウに隣接したウィンドウで入力し、「0」。
8. シリンジが押下されたときから「グラフの増加圧力領域」を強調表示します。次のポイント2にある矢印をクリックし、値は0.9〜1.2 mV程度の範囲であるべきである。
   1. タイプ「1」の横に「増加圧力」ウィンドウにウィンドウ内。ステップ2.7および2.8上で視覚的に明確にするためのオクタルブリッジアンプの損傷を示している可能性があり、指定した範囲外で見つかった3。値の図に対応しています。
9. ウィンドウの右上隅で発見'単位を定義」を選択し、「CMH ₂ O」に進みます。このオプションが利用できない場合は、手動で入力することができる。 [OK]をクリックします。
10. （2.1参照）「ブリッジアンプ」メニューに戻ります。 1 mVのを選択し、「ゼロ」にアンプを設定;。これは、キャリブレーションを完了し、水柱を安全に取り外すことができます。

3録音肺機能

1. マウス（g）を秤量する。注：前の生理的評価に1週間容積脈波室環境にマウスをご紹介します。これは順化を支援し、後日、この手順を実行する際のストレスを軽減します。 UWBPのセットアップを示す全体概略については、 図4を参照してください。
2. 直腸体温計で体温を測定します。挿入前ワセリンで温度計に注油。温度読み取りを記録し、80％（v / v）のエタノールで潤滑油をきれい。そのような新生児の仔マウスのような非常に小さい動物を使用する場合は、平均体温値が代わりに赤外線温度計を用いて測定することができる。
3. プレチスモ室の1穴の端に温度/相対湿度プローブを配置します。温度、湿度、barometrを記録内でマウスを配置する前に、容積脈波室内のIC圧力。
4. 容積脈波チャンバ内にマウスを置き、わずかに開いた端部を覆う。これは、マウスが順応することができます。チャンバを閉じます。
5. 一つの穴を持つプレチスモ室側に挿入された温度/湿度プローブを用いて、今2穴の反対側にある変換器と注射器を挿入します。
6. 約15〜45秒間、ソフトウェアプログラムおよび記録を押し「スタート」。動物が動いていないデータのレコード5-10秒。運動は、動物の基礎呼吸生理を変化させ、悪い結果をもたらす。呼吸は、プログラム上の直線経路で発振する必要があります。これらは、使用可能なデータです。注：排尿または排便のプレチスモグラフィーチャンバー内の温度および湿度の上昇につながる可能性がある。これは分析中に結果を不明瞭にします。排尿や排便の際には、すぐに録画を停止およびPLをきれいに80％（v / v）エタノールでethysmographyチャンバ。データは拒否されるべき次善の結果、視覚的に表現するために、図6を参照してください。
7. 45秒間記録した後、プレス機のソフトウェア上の「停止」（資機材の表を参照）のプログラム。容積脈波室からマウスを取り出し、すぐに室内の温度と湿度を記録します。これは動物にストレスを可能として、継続的に45以上の秒間記録しません。
8. 80％（v / v）のエタノールでスプレーチャンバと拭いて、そのケージにマウスを返します。
9. チャンバーを乾燥し、次のマウスへ進む前に、ベースライン温度と湿度に戻れるように。繰り返します、その後の動物のための3.1〜3.9を繰り返します。注：複数の動物が研究されている場合は、それぞれの新しい動物の前に近くのベースライン値、チャンバの温度と湿度の戻りがチャンバに入れていることを確認します。

4。プレチスモグラフ分析

いいえテ：そのような一回換気量（V _T）および分時換気量等の呼吸パラメータを計算するために以下の変数を測定する必要がある：呼吸数（呼吸/分）、全呼吸サイクル時間（秒）、吸息/呼気時間チタン（Ti / Teとによりそれぞれ一回換気量（P _T）。秒）、圧力の変化は、1トレースから測定可能な変数を示している図 。次の手順は、これらの変数を測定するために（資機材の表を参照）ソフトウェアを使用しています。分析する際に、盗聴や移動を含む微量の領域を避ける。再現性のある結果を得るためには、良好な呼吸トレースの少なくとも5秒が必要です。異なる呼吸トレースの例については図5および図6を参照してください。

1. 、フルスクリーンに画面を開き1、ビューを設定します。1と、使用可能なデータの5秒を選択します。この代表的なスナップショットが図5に示されている。
2. プロの一番上に見つかったミニデータパッドウィンドウを開きますDATAPADタブでグラム。チャンネル1を選択し、右側の列の左側の欄の「周期測定」と「平均的なサイの高さ」を選択します。
   1. 「オプション」を選択して、1秒（msec）の最小ピーク検出のためのスケールを設定します。これは、すべてのピーク値の検出を可能にし、小さな振動を生成小動物を使用する場合に非常に重要になるであろう。
   2. 「OK」をクリックします。これは_（P、T）の測定」各一回換気量による圧力たわみ」を紹介します。
3. ミニデータパッドには「イベント数」に続いて、選択 'サイクルの測定」と「OK」をクリックしてください。これは「周波数」（f）の測定を紹介します。
   1. 周波数は呼吸/分に変換する必要がある。これは、60秒して値を掛け、（min）を記録する全体的な時間で答えを割ることによって行われます。
4. ミニデータパッドで、['CYCLE測定期間 'が続く'をクリック '' [OK]をクリックします。これは「総呼吸サイクル時間」（T _TOT、秒）の測定を紹介します。
5. 次のステップは、ピーク吸気と呼気時間値を生成するために、マクロ命令を作成するために使用される。カーソルが直接ピーク/トラフの最大を超えていることを確認し、9シーケンシャル山と谷にコメントを追加します。 図5に示すように振動のピークから始めます。
6. 続いて、選択ウィンドウ：データパッド、右側の欄の左側の列、「期間」で「選択情報」をクリックし、「OK」をクリックして表示されるウィンドウで列1。
7. マクロプログラムの先頭に記述され選択してから、録音を開始。今selectコマンド：「ファイルのスタート」、「行く」、「検索」と「検索」をクリックします。
8. コマンドを選択します。「検索」とのコメントを検索 '。提供さ 'を含む'ボックスにコメントボックスの入力したのと同じフレーズを入力します。 」を選択前のポイントに 'タブを選択し、「検索」。
9. コマンドを選択します。「データパッドに追加 '。次に、マクロを選択：マクロコマンドを繰り返しを開始します。表示される繰り返し回数ウィンドウは9に設定してください。
10. コマンドを選択します。「次を検索」。コマンドを選択します。「データパッドに追加 '。最後に、マクロコマンドと終了を繰り返しを選択します。
    1. 今マクロを選択して録音を停止。動物番号の後にマクロを保存し、名前を付けます。注：各動物のためのマクロを設定するには、マクロは、長手方向の研究のために使用することができますし、時間を節約できます。
11. マクロは、現在、各コメントの間にインスピレーション（のT _i）および有効期限（T _eは ）時間を取得するために実行することができます。データは、データパッドのチャンネル1の下に表示されます。有効期限とインスピレーションが連続発生し、データは、この順序で表示されます。
    1. データは手動で吸気と呼気の値に分割する必要がある。平均T _iおよびT _{電子メールを}取得するために各パラメータの4つのデータ値を平均する。
12. プライマリ値が導出されると一回換気量（V _T、ml）を計算することができる。一回換気量を得るためにDrorbaughとフェン⁸の式が使用されます。
    V _T（ミリリットル_{）=（P T} / P _{K）×（V K）×（（T CORE（P B} - P _{C））/（T CORE（P B} - P _C） - _{T、C（P B -} P _{CORE）））}
    
    どこ
    V _T：換気量
    P _kは ：1ミリリットルの各注入による圧力の振れ（2.5ステップを参照してください）
    T _コア ：各動物の中核温度
    P _C：茶における室温度X相対湿度での水の蒸気圧mber
    T _C：動物室の温度
    P _コア ：体温で圧力（体温で水蒸気圧×1.0）
    P _tは各一回換気量による圧力たわみ
    V _K：キャリブレーションのための容量注入
    P _Bは ：気圧の圧力
    
13. 一回換気量が計算されると、以下のパラメータも決定することができる。
    • 分容量（ml /分）= V _T XF
    • 分容量（ml /分/ kg）=（V _T XF）/本体重量（kg）
    • V _T（ミリリットル/キログラム）= V _T（ミリリットル）/本体重量（kg）
    • 吸気デューティ·サイクル（％）= T _I / T _TOT
    • 吸気流量（ミリリットル/秒）= V _T / _{T iは}
    • 吸気時間と呼気時間の時間の比率= T _I / T _E
    • 全サイクル時間（秒EC）=インスピレーション時間（秒）+有効期限（秒）

結果

この手順が正しく実行されたときに、一貫性のある振動トレースデータ分析ソフトウェアで作成される。手順は、リストされた呼吸パラメータを決定するために、簡単な計算の計算を使用してセットアップした後、数分以内に呼吸器のトレースを提供します。 図5対照（健常）マウスから、適切な呼吸トレースを表します。動物は活発に動いていないときに適切な振動データが生成される。

UWBPコントロールおよび肺線維症コホート間の肺機能の非常に有用で信頼性の高い評価である。7は制御グラフと比較して14日目でのブレオマイシン誘発性肺線維症のマウスの肺機能を実証する図 、 図7は、視覚的な違いを示していますブレオマイシン投与⁷と一致している。前述したように、手順は、私たちは、呼吸parameteの変化を観察することを可能に繰り返すことができるこれら二つのグループの間の時間をかけて、RS。

得られた結果は、平...

ディスカッション

ここで説明する技術は、非拘束および無麻酔のマウスの呼吸パラメータの評価のための非侵襲的方法である。このプロトコルの長所は、最小限の人工物で縦方向に肺機能を測定するために、そのシンプルさと精度が含まれています。いくつかの制限と手続きについて記載すべき重要なステップは、しかし、があります。第一に、そして最も重要なのは、マウスが5秒以上室内に落ち着いている必要があります。追加されたストレスは、マウスの呼吸パターンを破壊し、したがって多様な結果（ 図6a）を提供します。この欠点は、可能性のままであり、時間に予想されるであろう。しかし、そのホームケージにマウスを交換し、それを簡単にこれを修正します定住する​​ための時間を可能にします。それは、動物は、適切な/使用可能なデータの5秒を得るために、チャンバ環境内で快適に感じることが重要です。さらなる配慮がチャンバ環境に関して必要とされる。環境で、u呼吸力学にnrelated、大きく結果に影響を与えることができます。評価が増加する期間、チャンバ上昇する湿度および温度、ならびに著しく換気に影響を与え、利用可能な酸素を減少させることができる。換気のタイミングは、湿度と温度槽...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
LabChart 7 ソフトウェア (Macintosh 用)	ADINSTRUMENTS	MLU60/7	プロトコルステップ 4
PowerLab 8/30 (model ML870)		ADINSTRUMENTS PL3508
Octal Bridge Amp (model ML228)	ADINSTRUMENTS	FE228
Black BNC to BNC cable (1 m)	ADINSTRUMENTS	MLAC01
Macintosh OS	Apple Inc.		Mac OS X 10.4 以降
Surgipack 直腸指温計	Vega Technologies	MT-918
Grass 容積圧力トランスデューサ PT5A	Grass Instruments Co.	型番PT5A、製造番号L302P4
1 mlシリンジ	ベクトン・ディキンソン(BD)	309628
5 mlセロジカルシリンジピペット	Greiner Bio One	606160	プラスチックチューブを介して接続
天秤/スケール	VWR International, Pty Ltd	SHIMAUW220D	0.1グラム分解能の任意の計量天秤
HM40 湿度温度計	ヴァイサラ	HM40A1AB
気圧計	バロメーター ワールド	1586
ラボ用チューブ	ダウ コーニング	508-101	水柱をシリンジと圧力トランスデューサーに接続するために使用されます
円筒形 パースペックス チャンバー	Dynalab Corp.		カスタムメイドの円筒形チャンバーで、内部寸法は50 mm(w) x 1,500 mm(l)です。各面に2つの蓋があり、寸法は80mm(l)x 80mm(w)です。各蓋の蓋の表面には、深さ50mmの60mm幅の円形の穴が開いています。これにより、チャンバーを蓋に収めることができます。チャンバーが収まる蓋の各穴の周りにゴム製のリングが取り付けられています。シリンジと圧力変換器の取り付け用は、開口部の直径が5mmです。湿度プローブの取り付け用は、開口部の直径が25mmです。
80%エタノール(4リットル)	VWRインターナショナル、Pty Ltd	BDH1162-4LP