方法論記事

モデル星細胞腫発症機序体外とインビボ皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

DOI：

10.3791/51763

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2014年8月12日

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 2Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine, 3Division of Neuropathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina School of Medicine, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina School of Medicine, 5Biological and Biomedical Sciences Program, University of North Carolina School of Medicine, 6Department of Radiation Oncology, Emory University School of Medicine, 7Department of Neurology, Neurosciences Center, University of North Carolina School of Medicine

この記事について

サマリー

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表現型の野生型アストロサイトと神経幹細胞は、floxed、条件付き発癌性対立遺伝子で操作され、ウイルスCre媒介組換えを介して形質転換されたマウスから採取され、同系で免疫能力のある同腹仔の脳に形質転換細胞を同所性注射することにより、in vitroおよびin vivoで星状細胞腫の病因をモデル化するために使用することができます。

要約

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現在の星状細胞腫モデルは、疾患の病因における特定の脳細胞タイプにおける発癌性変異の役割と、前臨床医薬品開発のためのそれらの有用性を定義する能力に限界があります。これらのアプリケーションのためのより優れたモデルシステムを設計するために、floxed発がん性対立遺伝子のさまざまな組み合わせを持つ条件付き遺伝子操作マウス(GEM)の表現型野生型皮質アストロサイトと神経幹細胞(NSC)を採取し、培養で成長させました。遺伝子組換えは、アデノウイルスCre媒介組換えを用いてin vitroで誘導され、変異したがん遺伝子の発現と腫瘍抑制遺伝子の欠失をもたらしました。これらの突然変異の表現型への影響は、in vitroで増殖、形質転換、および薬物反応を測定することによって定義されました。免疫能の高い同系同系動物の脳に形質転換細胞を定位的に注入する同所性同種移植モデルが開発され、in vivoでの腫瘍形成に対する発がん性変異と細胞型の役割を定義しました。ほとんどの確立されたヒト膠芽腫細胞株異種移植片とは異なり、形質転換GEM由来皮質アストロサイトを免疫能力のある同腹仔の脳に注入すると、最も攻撃的なサブタイプである膠芽腫を含む星状細胞腫が生じ、正常な脳実質へのびまん性浸潤を含むヒト星状細胞腫の組織病理学的特徴を再現しました。ルシフェラーゼを発現するように操作された形質転換アストロサイトからの同所性同種移植片の生物発光イメージングは、in vivo腫瘍の経時的な成長を監視するために利用されました。したがって、条件付き発がん性対立遺伝子を持つGEMから採取されたアストロサイトとNSCを用いたアストロサイト腫モデルは、アストロサイトーマの病因の遺伝学および細胞生物学をin vitroおよびin vivoで研究するための統合システムを提供し、これらの重篤な疾患の前臨床医薬品開発に役立つ可能性があります。

概要

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星細胞腫は最も一般的な原発性脳腫瘍と神経膠芽（GBM）は、グレードIV星状細胞腫は、12〜15ヶ月1,2の生存期間の中央値で、最も一般的で積極的なサブタイプである。びまん性星状細胞腫の浸潤、特にGBMは、アジュバント療法の有効性を制限し、必然的に、治療後の再発3につながり、完全な外科的切除を妨げる。デノボ（一次）GBMまたは必然的に（二次）GBM 4に進む低学年星細胞腫とのどちらか最初に存在する患者。 GBMはゲノム不均質であり、3つのコアのシグナル伝達経路を支配する遺伝子における相互に排他的と共起する突然変異により特徴付けられる：G 1 / S（Rbの）細胞周期チェックポイント、受容体チロシンキナーゼ（RTK）、およびTP53は 5-7の経路。 GBMは、GBMのサブタイプがインフルであることを示唆し、脳の異なる細胞型に似ている異なる発現プロファイルを有する4つのゲノムのサブタイプから構成され原点6,8,9、そのセルによって積んだ。より良い星状細胞腫モデルは星状細胞腫の病因の間に特定の細胞型における変異の特定の組み合わせの役割を定義するために必要とされる。より効率的な前臨床薬剤開発のためのこれらのモデルを活用することで、最終的には患者の転帰の改善に役立たせていただきます。現在の星状細胞腫モデルは、ヒト細胞株、患者由来の異種移植片（PDX）、遺伝的に改変された正常なヒト星状細胞および神経幹細胞（NSC）、及び遺伝子操作されたマウス（GEM）10-14を確立することを含む。皮質星状細胞およびNSC - -フロックス発癌性対立遺伝子のさまざまな組み合わせを宿すGEMから収穫当社は、主要な脳細胞を利用し、代替、非生殖系列GEM（nGEM）モデル15を開発しました。目標は、表現型がiの前臨床薬剤開発のためのインビトロおよびインビボの両方を特徴とする、潜在的に利用することができる遺伝的に定義された細胞と星状細胞腫モデルを生成することであったmmuneコンピテントマウス。

確立されたヒト細胞株は、彼らはまっすぐ進む、技術的に広く入手可能である。星細胞腫の病因とin vitroおよびin vivoでの薬物応答の中で最も一般的に使用されたモデルであり、免疫不全マウス10,11,16-18に同所異種移植時の動態および腫瘍形成性を定義している。その欠点は、高悪性度星状細胞腫の研究を制限し、低グレード星状細胞腫から確立された細胞株を生成することができないことが挙げられる。起源の定義されたセルの欠如;多くの場合、元の患者の試料から著しく異なるゲノムプロファイルとの複合体のゲノム異常の存在、;血清11,17,19-22シリアル培養中の表現型および遺伝子型のドリフトに対する感受性。確立されたヒトGBM細胞株における個別の発癌性変異の表現型の結果は、多くの場合、elucを排除し、実際に存在している異常の多数によってマスクすることができる直接遺伝子型 - 表現型の結果のidation。

PDXは、免疫不全マウス、または免疫不全マウス12,23の脳への同所注射前に定義され、無血清培地中で非付着性スフェロイドとしてのそれらの培養を通して患者絶縁星状細胞腫細胞の皮下通路を介して生成される。 PDXより正確にヒト星状細胞腫のゲノム景観を維持するが、確立されたヒト細胞株と同様に、個別の発癌性変異の表現型効果は、それらのゲノムの複雑19,24をマスクすることができる。特に新規治療法に応答して、特定の発癌性突然変異の表現型の結果を定義するために、確立されたヒト細胞株またはPDXのパネルは、しばしば、遺伝子型 - 表現型相関を確立する一般化を示し、細胞株特異的効果の可能性を最小化するために利用される。 PDXは正確に人間の星状細胞腫、株式会社の組織病理学的特徴を再現しながら侵略をluding、確立されたヒト細胞株の同所異種移植片は、一般的ではない21,23,25を行います。さらに、正常なヒト星状細胞およびNSC は、in vitroおよびin vivo 13,14,26 で星状細胞腫腫瘍形成をモデル化するために定義された発癌性変異を有する遺伝子操作されています。これらの細胞は、樹立されたヒト細胞株およびPDXのゲノム複雑性を欠いており、正確に人間の星状細胞腫組織病 ​​理を再現するが、 生体内で免疫不全げっ歯類における異種移植を必要とする。すべてのヒト細胞モデルは免疫介在異種移植片拒絶を防止するために、免疫不全げっ歯類宿主を必要とするため、これらのモデルは間質を標的とする免疫調節性の前臨床研究を制限する、同系のシステムのネイティブ腫瘍 - 間質相互作用を再現するために失敗し、無傷の免疫系を欠いている治療法10,11。

発癌牟田所定の組み合わせの表現型の結果のGEM許可検査その場での腫瘍形成における中の生体内でのン。非条件GEM開発を通じて全ての組織内に変異を有するのに対し、条件付きGEMは、細胞型特異的プロモーター10,11,15,18の使用を介して特定の細胞型へのCre介在組換えを制限することにより、突然変異の標的化可能に発癌性対立遺伝子をフロックスいる。条件付き星細胞腫GEMは、無傷の脳11内の異なる細胞型において発癌性変異の機能的役割を解明するために利用されてきた。条件付きGEMを用いたin situハイ gliomagenesis での前臨床有用性は、1）in vitroでの相関の欠如は、複雑な遺伝子型インサイチュ腫瘍発生での、3）長い待ち時間をマウスの大集団を生成する2）難しさを含むいくつかの要因によって制限され、4）、確率的腫瘍進行。 その場で腫瘍形成は、対応するin vitroモデルがないため、in vitroでの薬物検査は、ワットを行うことができないi番目の従来の条件付きのGEMモデル。他の癌とは対照的に、星状細胞腫の条件付きGEMモデルはめったに単一の発癌性の変異11によって誘導されていません。したがって、複雑な育種スキームは、複数の発癌性変異を有する条件付きGEMを生成するのに必要とされる。ハイグレード星状細胞腫への進行は、一般的に不均一な、確率論的な方法で行われ、最終的には、複雑なゲノム風景や急速な成長速度27を有する腫瘍を引き起こすながらさらに、星状細胞腫開始は、これらのモデルにおける長い潜伏期間の後に変数浸透率で発生し、 28。可変浸透度と条件GEMモデルにおける悪性進行の確率的性質は、個別のマウスは前臨床薬物試験におけるそれらの入学前にハイグレード星状細胞腫の存在および位置を検出するために、放射線画像撮影によりスクリーニングされている必要があります。まとめると、これらの制限は、広報に必要な発生および条件GEMの大コホートの試験を妨げるeclinical薬物検査。

特定の神経細胞タイプで、ウイルス受容体（TVA）を発現するように操作GEMを感染させるために、鳥類レトロウイルス（RCAS）ベクターを利用したRCAS-TVAのGEMシステムは、広範囲に星状細胞腫腫瘍形成11をモデル化するために利用されてきた。条件GEMとは対照的に、このモデル系は、複雑な育種スキームを必要とすることなく、特定の細胞型における複数の発癌性突然変異の導入を可能にする。しかし、宿主ゲノム29に可変浸透度、積極的にウイルス組込みを達成するためにセルを分割するための要件、および導入遺伝子のランダム挿入によって制限される。

彼らは他のモデルシステム15の制限の多くを克服するために、GEMから採取した細胞を利用することが非生殖系列GEM（nGEM）モデルは、ますます重要になってきている。星状細胞腫の病因に細胞型と共に生じる突然変異を開始する役割を抑止することが困難であるそれらは悪性進行の過程で未定義の細胞型において広範な遺伝子突然変異を蓄積して最終段階の腫瘍に由来しているので、鉱山は、ヒトGBM細胞株またはPDXを確立用い。対照的に、星状細胞腫のすべてのグレードは、特定の精製された脳細胞型11,30内に定義され、遺伝的突然変異を誘発することによってnGEMを使用してモデル化することができる。したがって、特定の遺伝子変異および細胞および分子の表現型上の細胞型の影響は、in vitroおよびin vivoで決定することができる。確立されたヒトGBM細胞株と同様に、nGEMを使用して初期のin vitro薬物試験は、同じ細胞を用いたin vivo試験薬を優先順位付けするために使用することができる。 in vivoでの腫瘍形成は、その後、免疫能のある同系同腹仔30の脳に同所nGEM細胞を同種移植することによって決定することができる。これらの同所同種移植モデルはそのためだけでなく、従来の細胞毒性aのin vivo試験を許可ND治療を目標とするが、免疫調節および間質標的療法にも。最後に、腫瘍の開始と進行に対する微小環境の役割は、同じ細胞型において同じ突然変異を用いてnGEM、従来のGEMモデル間の結果を比較することによって決定することができる。

星状細胞、NSC、またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC） - - GEM 30-34から採取たちなどが初代細胞を使用して星状細胞腫nGEMを開発した。星状細胞腫nGEMの開発の背後にある理論的根拠は、潜在的に免疫コンピテント動物においてin vitroでの前臨床薬物試験およびインビボで使用することができる特定の細胞型における発癌性変異の表現型の結果を決定するためのモデルを作成することであった。 Rb1の型loxP / loxP配列 、またはTgGZT -私たちは、表現、表現型、WT皮質星状細胞および非CreをからNSC、フロックスRB経路で> 94％C57BL / 6バックグラウンド上で維持条件付きGEMを収穫121 -とRTK / RAS / PI3K経路フロックス- NF1 のloxP / loxP配列 、KrasのG12D、のPten のloxP / loxP配列 -さまざまな組み合わせの遺伝子35-39を 。私たちは、Creリコンビナーゼをコードするアデノウイルスベクターを用いてインビトロで遺伝子組換えを誘導した。皮質アストロサイトの収穫は、細胞型の混合物が含まれているため、当社はこれらの培養におけるGFAP +アストロサイト皮質を濃縮するために、Ad5GFAPCreベクターまたはヒトGFAPプロモーターから駆動されるようTgGZT 121のような支配的な発癌性遺伝子を、使用しました。私たちは、MAPKおよびPI3K経路突然変異は、インビトロおよびインビボでの皮質星状細胞およびNSCにおいて、G 1 / S（RB）の表現型の結果を定義した。 MAPKおよびPI3K経路活性化、G1 / S-欠陥のあるアストロサイトに分子模倣人間の前神経のGBMと、同所注射の際、均一な成長速度、短いレイテンシで事前に定義された場所に形成された腫瘍および組織病理学的人間GBM 30のアル顕著な特徴。 インビボでの腫瘍増殖の長手モニタリングは、治療コホートの正規化および処置40に応答した腫瘍増殖の定量分析を介して前臨床薬物試験を助ける。私たちは、皮質星状細胞を発現するルシフェラーゼを注射したマウスの長手方向の生物発光イメージングによる腫瘍増殖速度を決定した。そのため、条件付きのGEMから派生皮質星状細胞およびNSCは、星状細胞腫関連変異の機能的な結果および前臨床薬剤開発のための潜在的なモデルシステムの定義のための扱いやすいモデル系を提供する。

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プロトコル

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すべての動物実験は、ノースカロライナ施設内動物管理使用委員会の大学によって承認された。

新生仔マウスから1培養皮質アストロサイト

  1. 準備
    1. 2-3繊細な作業組織をくしゃくしゃと70％エタノールを含有するフラスコの底に配置します。このフラスコ内にはさみ、曲がったピンセットストレートマイクロ鉗子の2ペアを解剖置きます。組織を微細鉗子を曲げないように使用される。
    2. 60ミリメートルの組織培養ディッシュに1mlのHBSSを追加します。各動物ごとに個別の皿を準備し、氷の上の料理を維持している。
    3. 制度的規制あたりの動物を麻酔。
    4. ウォーム10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン - ストレプトマイシン（完全DMEM）、37℃の水浴中で各動物用を含むDMEM 7mlの。注：5匹のマウスについては、1.1.1-1.1.4は〜15分かかります繰り返します。
  2. ティッシュハーベスト
    1. institutiあたりの新生児マウス（一日1〜3）に捧げる角項の規則。
    2. エタノールからはさみを解剖外し、それらが乾燥してドリップし、鼻に脊髄から頭蓋上の皮膚での矢状カットをすることができます。
    3. 脊髄から開始し、嗅球を過ぎて延長、矢状縫合に沿って頭蓋内のカットを行います。脳組織の損傷を最小限に抑えるために頭蓋の内側の表面付近のはさみのヒントを保つように注意してください。
    4. 湾曲した鉗子を使用して、静かに横方向に離れて脳から頭蓋の各半球の皮をむく。
    5. ストレートマイクロ鉗子を使用して、静かにそれぞれの皮質半球の背の部分を離れてつまむとHBSSを含む組織培養皿に入れてください。小脳および嗅球を避けるように注意してください。脳梁下の任意の組織を服用しないでください。
    6. 解剖顕微鏡やマイクロ鉗子の2ペアを使用して、静かにそれぞれの皮質半球から髄膜を除去します。組織を開始するまで氷に組織培養皿を返すhomogenizationは。
    7. 繰り返します各追加動物について1.2.6を通じて1.2.1を繰り返します。注：5匹のマウスについては、1.2.1-1.2.7は〜30分かかります繰り返します。
  3. 組織均質化
    1. きれいなカミソリの刃を使用して、細かく皮質半球をダイシングし、組織培養フードにプレートを移動します。
    2. 無菌15ミリリットルコニカルチューブに切断組織を転送します。氷冷HBSS 1mlでプレートを洗浄し、組織を含むチューブに移す。
    3. 組織がチューブの底に入るまで待ち、その後、慎重にピペットを用いて過剰のHBSSを削除します。
    4. 室温トリプシン/ EDTAを2ミリリットルを追加します。 1ミリリットルピペットでピペット〜10倍はさらに、細胞を解離する。
    5. 20分 - 15、37℃で細胞懸濁液をインキュベートする。慎重に反転によって5分毎に混ぜる。
    6. トリプシンを阻害するための完全DMEM 3ミリリットルを追加します。 1ミリリットルピペットでピペット〜10倍の溶液を混合する。
    7. 室温で5分間、200×gで遠心分離する。
    8. 削除する1ミリリットルピペットで上清。ペレットが緩んでいる可能性があるため、培地を吸引しないでください。
    9. のDMEMを完了し、37℃4mlにペレットを再懸濁。 75センチメートルに細胞懸濁液を転送する上部組織培養フラスコねじ。注：5匹のマウスについては、1.3.1-1.3.9は〜50分かかります繰り返します。
    10. 約アストロサイト収穫後16時間は、その後、DMEMを完全なC 4ミリリットル37°を追加し、37℃のHBSS 4mlでフラスコを洗う。 5％のCO 2中、37℃で皮質アストロサイトを維持します。注：洗浄工程を培養皿からの非接着細胞および破片を除去するために重要である。
    11. 文化は、〜95％コンフルエントである5％CO 2中、37℃で一晩振った場合、37℃のHBSS 4mlでフラスコを洗浄、分離した細胞を含む培地を除去します。 37の4ミリリットルの℃の完全DMEMを加え、5％CO 2中37℃で細胞を維持する。注：ミクログリアを汚染するとして、このステップは、皮質アストロサイトのための文化を豊かにすることが重要であるとオリゴデンドロサイト前駆細胞は、この手順をデタッチし、培養41から削除されます。
    12. 繰り返しは、各動物について1.3.1-1.3.11を繰り返します。
  4. 遺伝子組換えの誘導
    1. ステップ1.3.11を完了した後、37℃の2mlの培地を交換して24時間後には、DMEMを完全なC。 Ad5CMVCreまたはAd5GFAPCreの> 10 10 PFU / mlの1μLを含む37℃のSCMの1ミリリットルを追加します。利用BSL2の安全上の注意取扱い組換えアデノウイルス：5％のCO 2 .CAUTIONで32℃で6時間インキュベートする。
    2. ウイルス含有培地を取り出し、皮質アストロサイトへのウイルスなしで37℃で完全DMEMを追加します。注意：BSL2の安全上の注意を使用した組換えアデノウイルスを処理し、制度的規制ごとのウイルス含有培地を捨てる。注： - 〜6時間のインキュベーションを除く15分かかります1.4.3 5星状細胞培養物については、1.4.1を繰り返します。
    3. インの皮質星状細胞培養を展開vitroおよびin vivoで特性評価した 。注：再結合遺伝子または特定の変異タンパク質またはそのシグナル伝達の結果のいずれかについてイムノブロットによる特異的なプライマーを用いたPCRによってCre媒介組換えを以下の変異の有無を決定します。のCre組み換え後の皮質星状細胞培養物の表現型の安定化に必要な時間は、利用の変異に依存することになると経験的に（ 図2）を決定しなければならない。

新生仔マウスから2培養神経幹細胞

  1. 準備
    1. 98ミリモルのNa 2 SO 4、30mMのK 2 SO 4、5.8のMgCl 2、0.25のCaCl 2 -切開を開始する前に、3.1mgのパパイン4mlの解離培地に1.3 mgのシステインを加えることにより、脳あたり4ミリリットル消化溶液を調製（1MのHEPES pH7.4のストックから）、1 mMのHEPES 20 mMグルコース、0.001％フェノールレッド、および0.125 mMのNaOHを。パパインの追加解離培地にシステインが黄色の溶液を向けるだろう。
    2. 15分間37℃の水浴中でインキュベートする。反転によって定期的に混ぜる。
    3. 消化液が薄赤色の色に戻るまで、0.1M NaOHを滴下して加える。
    4. 組織培養フード中で、滅菌フィルターシリンジフィルター（0.22μmの細孔サイズ）を使用して、消化溶液。氷上で消化溶液を保管してください。
    5. 5ミリリットル、44.5ミリリットルNSC基礎培地を混合することにより、幹細胞培地（SCM）の50ミリリットルを用意NSCサプリメント、0.5ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン、50μlの0.2％ヘパリン、10μlの100μg/ mlのEGF、および10μlの100μg/ mlのbFGFを。 4°Cで保存した場合SCMは、1週間安定である。
    6. 完全なHBSS（cHBSS）10×HBSS 50 mlの1.25 50mlの1M HEPES（pH7.4）に混合することによって準備する15ミリリットルの1M D-グルコースを5mlの100mMのCaCl 2を5mlの100mMのMgSO 4、2mlの1のNaHCO 3。のddH 2 Oで500ミリリットルに全量を
    7. cHBSSのウィットを殺菌フィルター4°Cでヘクタール0.2μmの孔サイズのフィルターとストア。
    8. 2-3繊細な作業組織をくしゃくしゃと70％エタノールを含有するフラスコの底に配置します。このフラスコ内に解剖はさみ、曲がったピンセット、直マイクロ鉗子の2ペアを配置します。組織を微細鉗子を曲げないように使用される。注：5匹のマウスについては、2.1.1-2.1.8は〜45分かかります繰り返します。
  2. ティッシュハーベスト
    1. 制度的規制あたり（一日1〜3）新生仔マウスを生け贄に捧げる。
    2. 70％エタノールからはさみを解剖外し、それらが乾燥してドリップし、鼻に脊髄から頭蓋上の皮膚での矢状カットをすることができます。
    3. 脊髄から開始し、嗅球を過ぎて延長、矢状縫合に沿って頭蓋内のカットを行います。脳組織の損傷を最小限に抑えるために頭蓋の内側の表面付近のはさみのヒントを保つように注意してください。
    4. 湾曲した鉗子を使用して、静かに横方向に離れてからの頭蓋の各半球の皮をむく脳。
    5. 静かに氷冷cHBSSに脳全体と場所を削除します。
    6. 解剖顕微鏡を使用して、慎重に微細な解剖ツールと脳から髄膜を除去します。
    7. 底面に脳を置き、サイズ11メスで切る垂直（冠状）と小脳/後脳及び嗅球/前頭皮質を取り除く。
    8. このように、脳の冠状ビューを生成、尾の部分の上に配置するために90°、残りの脳を回転させます。側脳室の位置を確認します。
    9. 脳室下帯（SVZ）を含む立方体のセクションを切り取る。
    10. サイズ11メスで新鮮な氷冷cHBSSとミンチ組織と60ミリメートルの組織培養皿にSVZ含有組織を転送します。
    11. 15mlの滅菌チューブに細分化した組織を転送します。チューブを氷上に置きます。
    12. 1〜2ミリリットルの氷冷cHBSSとペトリ皿を洗ってください。組織を含むチューブに洗浄液を転送します。
    13. 繰り返して、追加neonataで2.2.1-2.2.12ステップlのマウス必要に応じて。プロトコルの残りのために、組織培養フードに全15 mlチューブに移す。注： - 〜45分かかります2.2.13 5匹のマウスについては、2.2.1を繰り返します。
  3. 組織均質化
    1. 5分間37℃の水浴中で消化溶液（ステップ2.1.1で調製した）を配置します。また、37℃の水浴中脳あたり暖かいの2ml SCM。
    2. 慎重に1ミリリットルピペットで細分化した組織の上清を除去。吸引しないでください。
    3. 15mlチューブ当り2ミリリットルを37℃の消化溶液を加え、反転により慎重に混合します。
    4. 15分間37℃の水浴中でインキュベートする。転倒ごとに5分を混ぜる。
    5. 各チューブに37℃の消化溶液を繰り返しステップ2.3.4の別の2ミリリットルを追加します。
    6. 細胞は重力によって、チューブの底に沈殿することを許可し、1ミリリットルピペットを用いて消化された組織から上清を除去。
    7. cHBSS中に希釈し、10μME-64の2ミリリットルを加え、反転により慎重に混合します。
    8. 室温で3分間インキュベートする。
    9. 細胞は重力によって、チューブの底に沈殿することを許可し、消化された組織から上清を除去。
    10. 37℃cHBSSの1ミリリットルを追加し、1ミリリットルピペットチップ（〜20ストローク）で均質化する。組織均質化の間に気泡を注入することは避けてください。
    11. その後、37℃cHBSS 5mlでストレーナーをすすぎ、40μmの孔サイズのセルストレーナーを通して組織ホモジネートを渡します。
    12. 5分間125×gで組織ホモジネートを遠心。
    13. 細胞ペレットを乱すことなく、1ミリリットルピペットで上清の95％を削除します。慎重に200μlのピペットの先端で200μlの37℃、SCMにおける細胞ペレットを懸濁します。
    14. 1.8ミリリットル、37℃、SCMを追加し、滅菌6ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液を転送します。注：5匹のマウスについては、2.3.1-2.3.14は〜75分かかります繰り返します。
  4. 神経幹細胞培養
    1. 別の2ミリリットル37°を追加することによって、3日後に培地を補充C SCM。
    2. 7日後、15mlチューブにニューロスフェアを転送し、ニューロスフェアは、> 5分間重力により沈降させ。
    3. 上清を除去し、2mlの37℃のSCMを追加します。
    4. 6ウェルプレートの新しいウェルにニューロスフェアを転送します。
    5. 3〜4日毎に37℃でのSCMの2ミリリットルを追加し、7日ごとに培地を完全に変更します。
    6. ニューロスフェアの直径が>100μmである場合は、慎重に幹細胞解離溶液で解離し、所望の細胞密度でNSCをreplate。
  5. 遺伝子組換えの誘導
    1. 現在のセル上でのSCMの2mlまでAd5CMVCreまたはAd5GFAPCreの> 10 10 PFU / mlの1μLを含む37℃のSCMの1ミリリットルを追加します。注意：BSL2の安全上の注意を使用した組換えアデノウイルスを扱う。
    2. 5％のCO 2中で32℃で6時間インキュベートする。
    3. 15ミリリットルチューブにニューロスフェアとSCMを移し、球が5分間重力によって沈降してみましょう。
    4. その後200μlのピペットを用いて、1ミリリットルピペットで最初の上清を取り除きます。注意：BSL2の安全上の注意を使用した組換えアデノウイルスを処理し、制度的規制ごとのウイルス含有培地を捨てる。
    5. 6ウェルプレートに移した後、原子力安全委員会へのウイルスなしで37℃でのSCMの2ミリリットルを追加します。注：5 NSC培養のために、2.5.1-2.5.5は6時間のインキュベーションを除く〜15分かかります繰り返します。
    6. 次の日は、繰り返しは、必要に応じて神経球継代が続き、2.5.1-2.5.5繰り返します。球は今インビトロ特徴付けおよびin vivoでのマウスの脳内同所注入前の2〜3継代のために拡張することができます。注：再結合遺伝子または特定の変異タンパク質またはそのシグナル伝達の結果のいずれかについてイムノブロットによる特異的なプライマーを用いたPCRによってCre媒介組換えを以下の変異の有無を決定します。 Cre媒介組み換えの後NSC培養物の表現型の安定化に要する時間が依存する（ 図2および図3）利用の変異について、経験的に決定されなければならない。

受信者Iimmunocompetentマウスの脳に組み換え細胞の3同所注射

  1. 5％メチルセルロースの調製
    1. 100ml中の最終体積50mlまで脱イオン水で15センチポイズメチルセルロース5gの溶解キャップボトルスクリュー。凝集を防ぐために4℃で撹拌しながらゆっくり粉末を加える。これは、ソリューションを入力して、すべてのメチルセルロース、4℃で攪拌し24時間ほどかかる場合があります。
    2. ボトルを計量し、重量を記録する。
    3. 5％メチルセルロース溶液をオートクレーブ。オートクレーブした後、メチルセルロース半固体ゲルとなる。
    4. 瓶を計量し、オートクレーブ中に失われた体重を計算します。
    5. 無菌的に失われた体重のあらゆるグラムのための滅菌水1mlを加える。
    6. 氷上に置き、氷冷2倍のDMEM 50ミリリットルを追加します。
    7. 4℃で一晩、磁気スターラーを用いて混合する。の20mlのアリコートに5％メチルセルロース溶液を分割する無菌技術を使用する。最長半年間または2x DMEM中の有効期限が切れるまで4℃で保存アリコート。注：ステップで5％メチルセルロース溶液の調製3.1.1-3.1.7〜2.5日かかります。
  2. 注射用皮質アストロサイトの調製
    1. 収穫皮質アストロサイト時〜90％のコンフルエント。
    2. 、収穫吸引完全DMEM、37℃のHBSS等量のプレートを洗浄します。
    3. プレートをカバーするのに十分なトリプシンを追加します。静かに傾けて、細胞が剥離し始めるまでプレートをタップします。
    4. 37℃の等量のトリプシンを不活性化するDMEMを完了C。
    5. 50ミリリットルコニカルチューブに細胞を移し、3.2.4で使用し、37℃の完全DMEM同じ体積でプレートを洗浄する。
    6. 細胞を含むチューブに洗浄培地を転送します。 3分間200×gで遠心分離する。
    7. 吸引するの37°Cの完全DMEM 1ml中upernatant再懸濁細胞。
    8. 細胞/μlの数を決定するために、血球計または他の適切な細胞カウンターを用いて細胞懸濁液をカウントする。
    9. 新しい15ミリリットルコニカルチューブに細胞の所望の数を転送します。 3分間200×gで遠心分離する。
    10. 37℃の800μlの再懸濁細胞を、DMEMを完全なC。細胞ペレット（ - 800μlの細胞懸濁液の全容積）の音量を決定します。注：注射のための正確な細胞濃度を達成するために不可欠である。したがって、細胞ペレットの体積は、ステップ3.2.12に追加し、5％のメチルセルロースの量を計算するために、このステップで決定されなければならない。
    11. 無菌1.5ミリリットルマイクロチューブに細胞を移した後、3分間200×gで遠心する。
    12. 細胞ペレットから上清を吸引除去し、氷冷した5％のメチルセルロース（所望の全体積の適切な体積の皮質星状細胞懸濁 - の音量を細胞/μlの所望の数を得るために、細胞ペレット）。
    13. 注射まで氷上にセルを配置します。
    14. 注射器に鈍18 G針を配置し、その後繰り返し抗原ディスペンサーに250μlのガラスシリンジを配置します。
    15. 皮質星状細胞懸濁液中の針でゆっくりプランジャーを撤回。気泡が圧縮し、実際に脳に注入量を減少するので、除去する必要があり、細胞上の気泡が存在します。
    16. ちょうど皮質アストロサイトサスペンション上の針の先端を持ち、迅速にプランジャーを押してください。気泡が速い細胞懸濁液よりも移動し、主に排出される。
    17. すべての気泡が針から削除されるまで、ステップ3.2.16を繰り返します。
    18. 約〜200μlのシリンジを満たし、その後、針を保持し、それが止まるまで戻ってプランジャーを引く。小さな気泡が針の先端を上に保持し、急速に約5にプランジャーを押すことによって除去することができる0μlをゆっくりと最大容量まで撤退。
    19. 直立の先端を保持し、ステップ3.2.18 4-5xを繰り返します。
    20. 18ゲージの針を破棄し、注射器に27Gの針を装着します。
    21. 流体が針から排出されるまで、抗原ディスペンサーのボタンを押します。注：1アストロサイト細胞株については、3.2.1-3.2.21は〜60分かかります繰り返します。
  3. 注射用NSCの調製
    1. ニューロスフェアは、直径> 100μmである場合には、15ミリリットルチューブに移し、ニューロスフェア>は5分間重力によって沈降してみましょう。
    2. 42に記載されているように、メーカーの指示に従って、または0.05％トリプシン-EDTAで応じて、幹細胞解離溶液またはACCUTASEとして、上清を除去し、穏やかな解離試薬でニューロスフェアを解離。
    3. 血清にNSCを公開せずに、製造業者の説明書に従って解離試薬を阻害する。 5分間100×gで遠心分離する。
    4. 上清を吸引し、次に、単一細胞懸濁液を生成するために37°C cHBSS 1ml中に細胞を再懸濁。
    5. 細胞/μlの数を決定するために、血球計または他の適切な細胞カウンターを用いて細胞数を計測する。
    6. 新しい15ミリリットルコニカルチューブに、NSCの希望数を転送します。 5分間100×gで遠心分離する。
    7. 37℃のHBSS800μlの中に細胞を再懸濁します。細胞ペレット（ - 800μlの細胞懸濁液の全容積）の音量を決定します。注：注射のための正確な細胞濃度を達成するために不可欠である。したがって、細胞ペレットの体積は、ステップ3.3.9に追加し、5％のメチルセルロースの量を計算するために、このステップで決定されなければならない。
    8. 無菌1.5ミリリットルのマイクロチューブに細胞を移した後、5分間100×gで遠心する。
    9. 上清を吸引し、3.2.12-3.2.21のように同所注射のための細胞を調製終える。注：1 NSC細胞株については、3.3.1-3.3を繰り返します。図9は、〜60分かかります。
  4. 注射用マウスの作製
    1. 制度的IACUCガイドラインあたり250ミリグラム/ kgのアベルチン（2,2,2トリブロモエタノール）または100mg / kgのケタミンプラス10mg / kgのキシラジンのIP注射を介してレシピエント動物を麻酔。注：使用帯域は、ここに同種移植片の宿主として生後3〜6ヵ月の時点でマウスである。異なる年齢でのマウスは、腫瘍形成上の発達脳年齢の微小環境影響を調査するために利用することができる。
    2. バリカンやハサミで切開部位を介して頭皮を剃る。
    3. 70％エタノールおよびベタジンの3交番綿棒で手術部位を滅菌する。
    4. まばたき反射の損失による損傷を防ぐために、眼に眼軟膏を適用します。
    5. ペダル撤退（つま先ピンチ）反射によって麻酔の深さを評価する。注：5匹のマウスについては、3.4.1-3.4.5は〜15分かかります繰り返します。
  5. 同所移植
    1. 定位フレームに動物を固定します。
    2. マック耳と目の間約0.5cm、長矢状縫合にわたって切開をメール。
    3. 冠状および矢状縫合（ブレグマ）の交差点だけでなく、ラムダとサジタル縫合（ラムダ）との交点の位置を確認します。ブレグマとラムダが同一水平面内にあることを確認します。
    4. 注射器の細胞懸濁液を含有し、頭の上に定位フレームに抗原ディスペンサーを繰り返して取り付けます。ブレグマと接触するように、27G針の先端を持参してください。これは、3次元座標の操作のために使用される起源である。
    5. 頭蓋骨の表面からわずかに針を上げ、2ミリメートル、横とブレグマから1mmの吻側移動します。
    6. ブレグマからその先4mmの腹側に頭蓋骨を通して慎重に針を下ろします。注：私たちは、大脳基底核を対象とし、これらの定位座標を利用した。別の定位座標は、異なる微小環境の影響を調査するために利用され得る腫瘍形成における脳領域。
    7. 繰り返し抗原ディスペンサーを一度活性化することによって、細胞懸濁液を5μl注入する。頭蓋内圧を平衡化することを可能にするために2分間の場所に針を残します。
    8. 30秒かけてゆっくり針を撤回。発生する可能性の出血に圧力を適用するために綿棒を使用してください。
    9. 傷のエッジを近似し、組織接着剤を使用して切開を閉じます。切開部位でのリドカインを皮下20μlのを管理します。注：5匹のマウスについては、3.5.1-3.5.9は〜50分かかります繰り返します。 UNC動物実験委員会は、局所麻酔の術後使用を承認した。地元の制度的IACUCとの協議は、この手順の後の術後鎮痛の使用のための要件についてをお勧めします。
  6. 手術後のケア
    1. 回復するためにきれいな温水ケージに動物を配置します。偶然の吸引が発生する可能性がある動物は、寝具に直接置くべきではありません。
    2. 観察するそのようなグルーミング、食べて、排便などの通常の動作の再開のための動物。注：通常の行動の再開は、〜60分かかることがあります。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、表現型的に、インビトロおよびインビボで特徴づけることができる条件発癌性対立遺伝子（ 図1）フロックス新生児のGEM内部に持つから収穫皮質星状細胞およびNSCとnGEMモデルシステムを開発しました。具体的には、インビトロでの皮質星状細胞における発癌性突然変異の影響を調べるために、最初に星状細胞を濃縮するために重要である。皮質アストロサイトの収穫はミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、OPC、および神経細胞の混合物が含まれていますが、機械的および遺伝的方法は、星状細胞の濃縮を助けることができる。ニューロンは、通常の培養条件下でダイのに対し、ミクログリアおよび乏突起膠細胞を一晩41,43を振盪することによって除去することができる。さらに、Ad5GFAPCreを使用して、GFAP +アストロサイトを標的にフロックス、発癌性対立遺伝子の遺伝的組換えは、星状細胞を濃縮することができます。当社は、FLOとRb1のloxP配列/ loxP配列 GEMの仔から皮質収穫を感染させる...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最も重要なステップは、2）、3）徹底的に細胞を解離するために、髄膜を除去して、脳梁の下に組織を取らずに皮質を切除するための適切な収穫と皮質アストロサイトの文化である1）を確保するため、4）、GFAPを濃縮するために+アストロサイト。私たちは（GFAPプロモーターの制御下Ad5GFAPCreベクターまたはドミナント転換、導入遺伝子の利用と遺伝子組換えの制約（TgGZT 121））、GFAP +アストロサイトのために豊かにする方法を（揺れ）機械的および遺伝的に使用しましたが、他の技術は、皮質を浄化するために利用されているアストロサイト。たとえば、汚染性ミクログリアがl-ロイシンメチルエステル47に続く有糸分裂阻害剤とのコンフルエント培養物を処理することによって除去することができる。血清含有培地中で機械的に精製され、培養されたアストロサイトの形態と発現プロファイルは、前者hypothesiで、急性孤立アストロサイトとは異なるZEDは、より未成熟アストロサイトの細胞または反応性アストロサイト表現型48,49

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRMはDamon Runyon-Genentechの臨床研究者です。この研究は、Damon Runyon Cancer Research Foundation(CI-45-09)、Department of Defense(W81XWH-09-2-0042)、およびUniversity of North Carolina University Cancer Research Fund(UCRF)からCRMへの助成金によって部分的に支援されました。著者は、ネズミの飼育支援についてDaniel Rothに感謝したいと思います。また、Hannah Chae氏、Carter McCormick氏、Demi Canoutas氏、Stephanie Gillette氏、Susannah Krom氏にも、組織培養と免疫蛍光の支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Invitrogen11995065DMEM は、GIBCOSigma and Cellgro
Fetal Bovine Serum、RegularCellgro35-010-CV
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
Sharp-Pointed Dissecting ScissorsFisher Scientific08-395などの他のサプライヤーからも購入できます。
軟骨親指鉗子、湾曲Fisher Scientific1631
Miltex 17-301 スタイル 1 ジュエラースタイル鉗子、ファイン、4Miltex17-301
エタノール (200プルーフ)Decon Labs2710
Razor BladesVWR55411-050
Hanksk' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x)、液体Invitrogen14175-095
TrypLE Express (1x), Phenol RedInvitrogen12605-010他のトリプシン溶液は、皮質アストロサイトにも適しています havest およびculture
Dish, 60 x 15 mmThomas Scientific9380H77
15 ml TubesBD Biosciences 352096
50 ml TubesBD Biosciences352070
アデノウイルスストック遺伝子導入ベクターコア、アイオワ州Ad5CMVCreストア5µ-80°Cのlアリコート。Bsl2の安全上の注意を使用してください
ナトリウム(Na2SO4) Sigma-Aldrich238597
硫酸カリウム (K2SO4)Sigma-Aldrich221325
塩化マグネシウム (MgCl2)Sigma-AldrichM8266
塩化カルシウム (CaCl2)Sigma-Aldrich746495
HEPES カリウム塩Sigma-AldrichH0527
D-(+)-グルコースSigma-AldrichG8270 
フェノールレッドSigma-AldrichP3532
水酸化ナトリウム (NaOH)Sigma-AldrichS5881
PapainWorthingtonLS003127
L-Cysteine-HClSigma-AldrichC1276
シリンジフィルター (0.22 µミリポアSLGP033NS
Neurocult増殖キット、マウスStemcell Technologies5702このキットには、NSC培養に必要なNeuroCult NSC基礎培地とNeuroCult NSCサプリメントが含まれています
0.2%ヘパリン溶液Stemcell Technologies7980
EGF InvitrogenPMG8041
bFGF InvitrogenPHG0261
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (10x)Invitrogen14185-052
Mg sulfate (MgSO4)Sigma-AldrichM7506
重炭酸ナトリウム (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
E-64Sigma-AldrichE3132Make 10 mM stock inDMSO、-20°Cで保存。C
6 ウェルプレートFisher Scientific07-200-83
セルストレーナー (40 & micro;Corning352340
幹細胞解離液Stemcell Technologies5707あるいは、Accutase
Methyl cellulose 15 cPSigma-AldrichM7027
Dulbecco's Modified Eagle's Media 2xMilliporeSLM-202-BFor making 5% methyl cellulose solution
1.7 ml Snap Capマイクロ遠心チューブCorning3620
ハミルトン シリンジ、250 & マイクロ;l LT 針なしフィッシャーサイエンティフィック14-815-92
PB600-1 抗原ディスペンサーハミルトン 83700
使い捨て 18 G 針フィッシャー サイエンティフィNC9015638
27 ga 1/2" ルアー チップ針フィッシャー サイエンティフィック14-826-48
2,2,2-トリブロモエタノール (アベルチン)シグマ-アルドリッチT48402
ベタジンフィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィNC9386574
プラルベ オプタルミックス 軟膏ッシャー サイエンティフィック
900型 脳定位固定装置フレームKopf Instruments
VETBONDFisher ScientificNC9259532 ティッシュ接着剤 
リドカイン ShopMedVetRXLIDO-EPI
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)PromegaG3580
Anti-SOX2MilliporeAB5603
Polyclonal Rabbit Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)DakoZ0334 
IVIS KineticPerkinElmerin vivoイメージング用
D-ルシフェリン - K+ 塩 生物発光基質PerkinElmer122796in vivo 生物発光イメージング用
EdU イメージングキットInvitrogenC10340
MSCV ルシフェラーゼ PGK-hygroAddgene18782
、硫酸ック ック フィNC9689910

参考文献

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