単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞の精製

サマリー

ここでは、単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞（のTEC）を精製するための効率的な方法を記載する。プロトコルは、通常のT細胞の発生、胸腺機能不全、およびT細胞再構成のための胸腺機能の研究のために利用することができる。

要約

胸腺は、Tリンパ球の開発のための重要な器官である。 T細胞のコミットメント、正の選択および負の選択：胸腺ストローマ細胞、胸腺上皮細胞（TECは）は、T細胞発生の複数の段階において特に重要である。しかし、胸腺内のTECの機能は完全には理解されたままになります。記事では、機械的破壊及び酵素消化の組み合わせを使用して、新鮮なマウスの胸腺からTECサブセットを単離するための方法を提供する。方法は、胸腺間質細胞および胸腺細胞を効率的に細胞 - 細胞および細胞 - 細胞外マトリックス接続から解放されると、単一細胞懸濁液を形成することを可能にする。単離された細胞を使用して、マルチパラメータフローサイトメトリーのTECおよび樹状細胞の同定および特徴付けにも適用することができる。のTECは、胸腺では珍しいな細胞集団であるため、私たちも豊かにし、胸腺細胞、胸腺で最も豊富な細胞型を枯渇させることによりTECのを浄化する効果的な方法について説明します。 Folloの細胞生存率の損失はTECの精製の間に最小限に抑えることができるように、翼濃縮を、時間を選別細胞を減少させることができる。精製された細胞は、リアルタイム-PCR、ウェスタンブロット及び遺伝子発現プロファイリングなど、さまざまな下流の分析に適している。プロトコルは、TEC機能の研究と同様にin vitroでのT細胞再構成の開発を推進していきます。

概要

初期のT細胞の開発で、骨髄の造血幹細胞由来の多能性前駆細胞が胸腺の皮質に補充される、T細胞系列へのコミットメントを受け、T細胞前駆体¹になる。非常に変化したT細胞受容体¹と前駆細胞の大きなプールを形成し、皮質では、T細胞前駆体のCD4とCD8ダブルネガティブ（DN）胸腺細胞が膨張し、未成熟CD4およびCD8ダブルポジティブ（DP）胸腺細胞に分化する。 DP細胞の選択MHC拘束性サブセットは、CD4またはCD8シングルポジティブ（SP）胸腺細胞になる胸腺の髄質に移行し、機能的に有能な成熟T細胞へのような正の選択^2-と呼ばれるイベントを差別化するだけ^6。これとは対照的に、自己反応性胸腺細胞のクローンは、負の選択を受け、自己寛容のための制御性T細胞に変換するか、まだ明らかでない目的のために上皮内リンパ球に転用、アポトーシスによって取り除かれる^3,7-10。

胸腺は、胸腺間質細胞は、これらの多様なT細胞の発生運命^5,11,12のための信号を提供するユニークな微小環境を形成している。皮質のTEC（cTECs）および髄質のTEC（mTECs）、樹状細胞、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞、神経堤由来の周皮細胞および他の間葉系細胞を^13〜15を含む-胸腺間質細胞は、胸腺上皮細胞（TECの）から構成されている。これらの中でも、TECは、T細胞の発達^1,2,16,17のさまざまな段階で重要である。しかし、TECのを隔離するための確実な方法がないことは、それらの機能¹⁶の包括的な理解を妨げている。特に、皮質の前駆細胞を囲む三次元網目構造を形成cTECsは、まだ明らかでない理由のために正の選択^13,18,19のために必須である。初期の研究は、主に形態学的および組織学的ツール¹³に頼ること、のTECの不均一性や役割などの手掛かりを提供。最近のTECサブセットのユニークな役割は、マウスモデル^12,20における遺伝的アプローチによって対処された。 TECのを単離するための堅牢で再現性のある方法がcTECsが正の選択をサポートする方法のTECサブセットの公正な特性評価、TEC機能の定量的および定性的評価、およびメカニズムの解明を達成することが基本である。

ため、彼らは無傷の器官において形成胸腺内のTECの希少性とタイトな相互作用のために、TECはの単離は困難なされています。ここで説明するプロトコルは、以前の発見、現在利用可能な試薬、技術、および胸腺構造および間質組成物の知識に基づいている。ほぼ20年前に、いくつかの手順は、トリプシン、コラゲナーゼとディスパーゼを含むさまざまな酵素が消化中に使用された胸腺組織^21-27を 、脱凝集することが報告された。 Gray ら 。彼らprecedure ²⁸のものの酵素を比較し、改善されたメタを報告した広く使用されている^20,30になった酵素カクテル²⁹の多段消化し ​​たOD。しかし、この方法は、長い準備時間と同じでもマウスのコホート^29,30でのTECの可変の最終細胞数および割合で複雑 ​​な消化工程および結果を含む。数年前、リベラーゼ研究グレード酵素、高度にコラゲナーゼを精製し、中性プロテアーゼは、胸腺組織解離³⁰で使用され始め含有する。ここでは、マウスの胸腺組織からの生のTECの高い数を出し最適化された機械的分離手順リベ消化ベースのプロトコルを記載している。 。

解離した間質細胞を濃縮するために、以前の研究では、密度勾配または磁気ビーズ分離^21,29のいずれかを使用している。しかし、両方の方法は、胸腺ストローマ細胞、cTECs ²⁹の特に人口の特定の集団から失わ厳しい引き起こす。細胞傷害性除去とパニング技術 31,32まで広く免疫学分野^12,31に枯渇またはリンパ球を分離するために使用されている。これらの技術の比較後、私たちはTECのを濃縮するための現在のパン·プロトコルを確立した。濃縮手順の間に緩やかな条件が少ない細胞死および公正な増加TECの回復につながる。

セクション3に記載される単離され胸腺細胞懸濁液を直接TECサブセット及び樹状細胞の同定および特徴付けのためにフローサイトメトリー分析に適用することができる。第4節では、サイトメーター多パラメーターフローを使用して、TECのサブセットを識別するための簡単​​で便利な方法を説明しています。精製されたcTECsまたはmTECs、TEC濃縮と手順をセルソーティングを得ようとした実験については、セクション5と6に記載されています。

プロトコル

本研究では、成人（6 - 8週）の雌のC57Bl / 6マウスを用いた。マウスは、国立癌研究所から購入し、特定の病原体フリーの条件下で維持した。ミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）は、すべての動物実験を承認した。

楽器とバッファの調製

1. 酵素液の準備、アルブミンが豊富なバッファー（1×PBSの[Ca ^{2 +} / Mgの^2+を含まない]と0.5％ウシ血清（0.05％RPMI1640培地をリベラーゼTH及びDNアーゼIの100単位/ mlの[w / vの]）アルブミン及び2mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA]）、FACS緩衝液（1×PBSの[Ca ^{2 +} / Mgの^{2 +}を含まない]を含む1％ウシ胎児血清[FBS]、0.02％のNaN _3）、FACSバッファソーティング（1X PBS 10％FBSが供給された[Ca ^{2 +} / Mgが^{2 +}を含まない]、2％FBS）を含有する、およびRP10培地（RPMI-1640培地）。
2. 10パニングプレートを準備します。 （0.01 mg / mlのGを40ml塗布液を調製しオート麦は、0.1MのNaHCO ₃緩衝液中の抗ラットIgG）を、それぞれ100×15ミリメートルプレート、スワールに塗布液の4ミリリットルを追加し、4℃、CO / Nインキュベートする。抗体溶液を捨て2回1×5mlのPBSを用いてプレートをすすぎ、リンスの間で活発に渦巻く。 4℃で準備されたプレートを保管してください。

胸腺組織の2収穫

1. CO ₂チャンバー内でマウスを安楽死させる。 、解剖マットの上に仰向けに動物を入れてマットの上に足をピンと70％エタノールを噴霧して毛皮を濡らす。
2. まっすぐにハサミで下顎への尿道口の上から出発して、皮膚を​​介して正中切開を行い、両側の膝に下向きに切開を延長。切開は「Y」逆さまのように見えます。両側のたるんだ皮膚を後ろに引き、そして解剖マットにそれをピン。
3. 次いで、肋骨を持ち上げ、鎖骨付近までそれぞれの側にリブをカット、剣状突起から横隔膜を穿刺鉗子は解剖マットにそれをピンと。胸腺はちょうど肋骨の下にあり、心の上にある二つの薄い白のローブ（ 図1）のように見えます。胸腺の周囲の結合組織を外し、緩やかに湾曲鋸歯状の鉗子で胸腺ローブのペアを引っ張って外します。 5ミリリットルのRPMI-1640を含む6ウェルプレートに胸腺葉を置きます。

胸腺間質細胞の調製

1. 周囲の脂肪と結合組織をトリミングし、新たに酵素液を調製5ミリリットルを含む6ウェルプレートの新しいウェルに胸腺葉を移す。細かいハサミで胸腺葉に小さな切開を行い、20分間、37℃でプレートをインキュベートする。
2. 組織解離のための5ミリリットルピペットを用いて3回 - 静かにピペットを上下に2を胸腺組織を消化。 10ミリリットルの酵素を中和するコールドアルブミンが豊富な緩衝液を含む50mlチューブに上清画分を収集する。氷上でコレクションチューブを保管してください。 2.5を追加します。残りの組織への溶解酵素溶液と15分間37℃でプレートをインキュベートする。
3. 凝集体を破壊するために3ミリリットルの注射器と、18G針で穏やかな機械的撹拌を実行します。コレクションチューブにプール上清。残りの組織に2.5ミリリットルの酵素溶液を加え、15分間、37℃でプレートをインキュベートする。
4. 3ミリリットルの注射器と25 Gの針で穏やかな機械的撹拌を繰り返し、プレートをさらに5インキュベート - 10分。
5. 完全消化した後、コレクションチューブに上清をプールする。遠心分離した細胞を収集するために8分間400×gで、4℃でコレクションチューブ。液体を吸引し、10mlのアルブミンが豊富なバッファ内のペレット化した細胞を中断し、100mmのメッシュを通してサンプルをフィルタリングする。血球計数器を用いて細胞を数える。その後、フローサイトメトリー分析（第4節）、またはTECの濃縮（第5節）を行う。

フローサイトメトリーによるのTECの4の同定

1. 96ウェル丸底試験板に染色FACS緩衝液中に100μlあたり4×10 ⁶細胞の最終濃度に細胞を調製し、氷上にプレートを保つ。細胞に（FACS緩衝液中10μg/ mlの抗CD16 / CD32抗体）を20μlのFcブロック溶液を加え、氷上で10分間細胞をインキュベートします。 400×gで、3分間、4℃でプレートをスピン。流しにダウン板面をフリックでウェルから液体を捨ててください。
2. 100μlの抗体カクテル（抗CD45、-EpCAM、-MHCクラスII、および-Ly51抗体におけるペレット化した細胞を一時停止し、メーカーで異なる蛍光色素で標識したUEA-1レクチンは、FACSバッファ内の各抗体の最適な濃度をお勧めしますまたはテスト）し、暗所で20分間氷上で細胞をインキュベートする。補償のために、各個別の蛍光色素で1×10 ^6個の細胞を染色する。
3. 各ウェルにFACS緩衝液100μlを加え、400×gで、3分間、4℃でプレートをスピン。洗浄ステップ1を繰り返します時間、その後100μlのFACS緩衝液中で細胞を再懸濁。 300μlのFACS緩衝液で満たされた12×15mmの丸底FACSチューブに細胞を移す。フローサイトメーターでサンプルを取得し、FACS分析ソフトウェアを用いてデータを分析する。 TECゲーティング戦略は、 図2に示されている。

パンニングによるTECの5。エンリッチメント

1. 5分間400×gで、4℃で（セクション3で調製した）胸腺細胞をスピンダウン。吸引した液体と15ミリリットルまたは50 mlコニカルチューブ中の1ml当たり2×10 ⁸細胞の濃度でFACSソーティングバッファ内のペレット化した細胞を一時停止する。細胞懸濁液を2.5μg/ mlの最終濃度で抗CD90.2抗体（クローン30-H12）（または抗CD45）を追加し、30分間4℃で回転ミキサー上で穏やかに細胞をインキュベートする。インキュベーションに続いて、5で洗浄 - RP10培地の10倍の体積と400×gで、5分間、4℃でチューブを遠心する。
2. 吸引した液体とでペレット化した細胞を再懸濁1mlあたり1×10 ⁷の濃度でRP10培地。各コーティングされたパン（ステップ1.3で調製）プレート、スワール5ミリリットルの細胞懸濁液を加え、室温で30分間インキュベートする。精力的に渦巻く;コニカルチューブに上清を移す。プレートをRP10培地を用いて2回すすぎ、収集チューブに上清をプールする。
3. 400×gで、5分間、4℃でコレクションチューブを遠心。吸引した液体と5ミリリットルのRP10培地中でペレット化した細胞を懸濁します。 、新しいパンプレートに細胞懸濁液を追加旋回し、室温で30分間インキュベートする。細胞がプレートをすすぎ、コニカルチューブにそれらをプール収集します。 TECのが濃縮されると、5分間、4℃、400×gで細胞をスピンダウンし、バッファをソートする5ミリリットルのFACSで細胞を一時停止。

細胞選別によるのTECの6。精製

1. 血球計数器を用いて細胞を数え、FACSソーティングバッファ内の4×10 ⁷細胞の濃度で細胞懸濁液を準備します。抗体デスを追加細胞溶液に4.4節でのcribed、30分間、4℃で回転ミキサー上で穏やかに細胞を培養する。染色の後、洗浄し、FACSソーティングバッファの1mlあたり10×10 ⁶細胞の濃度に細胞を懸濁する。
2. 蛍光活性化セルソーティングを使用して、100μMのノズルを通してソートテックサブセット。ソートされた細胞は、RPMI-1640中30％（v / v）のFBS）に集められる。細胞選別は、5分間、400×gで、4℃で遠心分離を行って細胞および下流の分析のために準備される一度。

結果

このプロトコルを使用して、胸腺器官成体マウス（セクション2）から除去し、得られた細胞懸濁液を3章で概説されるように胸腺細胞懸濁液を調製した胸腺細胞、造血由来間質細胞および非造血間質細胞から成っていた。 CD45は胸腺細胞とマクロファージや樹状細胞などの造血間質細胞の両方で発現し、造血汎マーカーである。対照的に、TECは、造血起源のものではなく、CD45 ^15を発現しない。セクション4に概説されるように細胞染色およびフローサイトメトリー分析を行った。

TECサブセット、cTECsとmTECsの2種類が、一般的なバイ強力TEC前駆体¹⁵に由 ​​来する。 cTECsとmTECsの両方が、それらの表面²⁸上のEpCAM分子を発現する。このためのTECは、EpCAMの陽性およびCD45陰性フローサイトメトリーによる（ 図2A）に応じてゲート制御することができます。 Ly51：cTECsとmTECsは、2つの試薬によって区別す​​ることができるCTECで表さグルタミルアミノペプチダーゼを特異...

ディスカッション

プロトコルでは、重要なステップは、胸腺間質細胞（第3節）とのTECの濃縮（第4節）の製造である。ことを強く新鮮な酵素溶液を毎回用意し、組織をできるだけ早く扱われることをお勧めします。プールされた胸腺、酵素溶液の容量を最適化する胸腺の数に応じて必要とされる。任意の組織残留物は、処理後に残っている場合、より多くの酵素溶液及びインキュベーション時間の延長を添加して細胞収量を増加させることができる。のTECの濃縮中に、上清の収集を完了し、5.3節で概説プレートリンスを繰り返してセル損失が減少します。

1980年、Wekerle ら 。完全に細胞内小胞の中、多くの実行可能なリンパ系細胞を包み込む大皮質上皮細胞である「胸腺ナース細胞」（多国籍企業^）33、 -最初のTECの種類を報告した。 1982年、Kyewskiとカプランは、さまざまな分離指揮を説明した多国籍企業³⁴の歩留まりに影響を与えるitions。最近では、高浜らは、多国籍企業の単離および特性を再訪。彼らは膜透過³⁵の後にCD45の優先的染色に基づい...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗マウス EpCAM	eBioscience	XX-5791-YY*	Clone G8.8
抗マウス MHC II	eBioscience	XX-5321-YY*	Clone M5/114.15.2
抗マウス Ly51	eBioscience	XX-5891-YY*	Clone 6C3
UEA-1	Vector Laboratory	FL-1061
Flow Cytometer	BD Biosciences	LSRFortessa
フローセルソーター	BD Biosciences	FACSAria
FACS tubes	BD Biosciences 352052
フローサイトメトリー解析ソフトウェア	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7/9
*XX は蛍光色素によって異なり、YY はバイアルのサイズによって異なります。