解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

サマリー

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。

要約

ショウジョウバエにおけるポスト胚発生のかなりの部分、 キイロショウジョウバエは 、成虫と呼ばれる袋状構造のセット内で行われます。これらのディスクは、大人のハエ内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせる。ここでは、これらのディスクを回復し、抗体、転写レポーターとタンパク質トラップを用いた分析のためにそれらを準備するために最適化されたプロトコルを記述します。この手順では、成虫のような薄い組織に最も適しているが、簡単にそのような幼虫の脳と大人の卵巣厚い組織に使用するために修正することができます。書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは3齢幼虫、組織の固定、および抗体と成虫の治療の切開を介してリーダ/ビューアをご案内いたします。プロトコルは、同様に若い第一及び第二齢幼虫から成虫を分析するために使用することができます。このプロトコルの利点は、比較的短く、それがいることである解剖した組織の高品質保持のために最適化が備わっています。別の利点は、使用される固定手順ショウジョウバエタンパク質を認識する抗体の圧倒的な数でうまく動作することである。われわれの経験では、この手順ではうまく機能しない敏感な抗体の非常に小さな数があります。このような状況では、救済策は、私たちが解剖工程および抗体インキュベーションのために記載されているガイドラインに従うことを継続しながら、代替の固定カクテルを使用することであるように思われる。

概要

一世紀以上ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエの場合は、開発、行動や生理機能を研究するための最高のシステムとなっている。成虫^1-3と呼ばれる単層の上皮内後者の撮影場所の多くで胚および後胚：ハエにおける開発は、二つの大きな段階に分けることができる。 成虫の図面は最初の昆虫開発¹の彼の広範な研究論文の一部として8月ワイスマンによって1864年に出版された。これらのディスクは^{、1〜14のフライ} 、大人内で発見された成人の構造の割合が高いを生じさせ、最終的には初期の蛹の段階の大規模な組織分解を生き残る、と、幼虫の段階でパターニングして、胚形成の間彼らの開発を開始。幼虫の開発中に各ディスクには運命、形状やサイズに関するいくつかの重要な決定を行う。第一及び第二の幼虫齢の中では、ディスクはestablisは、原発運命を採用する使命を帯びている正確な形状を採用し、セル^15〜16の必要な数を生成し、コンパートメントの境界を興。第三の幼虫齢と初期のプレ蛹段階では、成虫は分裂を続け、細胞がそれらの端末の運命^16を採用するようにパターニングする。

ショウジョウバエ発生生物学の初期の歴史の中で、成虫は正常な発達との関連で、損失または機能獲得変異体が生存された限られたケースではほぼ独占的に研究した。幼虫および成体組織内の細胞クローン中で分析される致死突然変異のために許可された有糸分裂組換えを誘導するX線の使用。この方法は、幼虫および成体の両方の組織における損失と機能獲得型突然変異を分析するためにトランスジェニック法の導入により改善されている。野生型および変異型の組織の分子景観を説明するための抗体の転写レポーターおよびタンパク質トラップの数も定数であるantly成長。損失を分析し、機能獲得型変異細胞クローンするために、これらの分子マーカーを使用すると、突然変異細胞は、発達中にその野生型いとこから逸脱方法のリアルタイムの理解を得ることがますます可能になった。適切にこれらのツールおよび試薬を利用するためには、閲覧撮影し分析することができる成虫の高品質の製剤を有することが重要である。この原稿の目標は、目を触角複合体（ 図1A）の単離および調製のための最適化されたプロトコルを提供することです。また、正常翼、平均棍、T1-T3脚および性器（ 図1B-E）を生じるものを含む追加のディスクの多種多様な単離することができる。この手順は、わずかな変更で、ほぼ80年間、 ショウジョウバエ成虫を単離するために使用されている。

ほとんどの遺伝子は、ミュー中に発現されているので、上記のように発達段階ltipleおよび組織の多数では、動物が三齢幼虫期前によく死ぬようにヌル変異体が眼全体に与える影響を研究するために、多くの場合不可能です。 4つの方法は、網膜などの先進の組織の研究は著しくより扱いやすくなりました。最初は、そうでなければ、野生型組織^17-19内の変異体細胞クローンを生成するフリッパーゼ（FLP）/フリッパーゼ換えターゲット（FRT）メソッドです。この場合、変異体組織は、緑色蛍光タンパク質（GFP）のような視覚的なマーカーの非存在により識別され、GFPの存在する周囲の野生型組織（ 図2D）と比較することができる。二つ目は、導入遺伝子が細胞²⁰の集団において発現している「FLPアウト」方式である。この場合、細胞クローンは、GFPレポーターを欠いている周囲の野生型組織（ 図にGFPの存在によって同定され、比較される2E）。第三は、FLP / FRT突然変異体クローンとFLPアウト発現システム²¹の要素を組み合わせた抑制性細胞マーカー（MARCM）技術とモザイクの分析である。この方法では、導入遺伝子を同時に個体の遺伝子座のための突然変異体である細胞の集団内で表現することができる。 FLPアウトクローンと同様に、MARCMクローンは、GFPの存在によって同定およびGFPマーカー（ 図2F）を欠いている周囲の野生型組織と比較している。最後に、遺伝子及びRNAi構築物は、特異的プロモーター-GAL4構築物の制御下成虫組織内で発現させることができる。変異または過剰発現クローンまたはパターンが直接隣接野生型組織と比較することができるので、これらの4つの方法は、成虫の研究に関心が高まっている。この手順に記載された方法が開発されているように、ショウジョウバエでは、成体組織の後胚発生を研究、研究者、特に目を触角から誘導されるものが、分析のために高品質の組織を得ることができるであろう。個別の研究者は、わずかな変更を行ってきたが、（私たちはここで説明する）この手順のコアは、大部分が変更されていないままである。高品質の組織を得ることが私たちは、この書かれたプロトコルとそれに付随するビデオは貴重な教育資源として役立つことを願ってい成虫の研究に重要であることから。

プロトコル

幼虫の調製

1. 解剖バッファーで35ミリメートルペトリ皿を埋める。
2. ペトリ皿に幼虫を置き、それらを数分間（セルフクリーニング工程）の周りに泳ぐことができます。
3. シリコーン系解剖板に解剖バッファーのプールに幼虫を転送します。このプールは、プレートの一方の端にあるべきである。解剖板はガラスシャーレ内注入し、硬化したシリコーン溶液で構成されています。
4. パスツール·ピペットを用いて、解剖プレートの中央に解剖バッファの大きなプールを配置します。
5. ＃5鉗子を使用して、解剖バッファの大きなプールに小さなプールから単一の清掃幼虫を移す。

幼虫の2。粗い解剖

1. 幼虫は解剖バッファーの大きなプールの中にある間にピンセットで幼虫を握る。鉗子の他のペアがアニムを保持するために使用される鉗子の一組は、口フックをつかむために使用されるべきであるまだら（1月3日体長穏やかに幼虫をつかむ）。
2. すぐに鉗子の第二の対を廃止本体の残りの部分を引っ張りながら、口のフックの近くでキューティクルを含む一対の鉗子を安定保持します。
3. 幼虫は引き裂くし始めると、あなたは緊張のわずかな解放を感じるだろう。鉗子から幼虫を放し、こぼれにする幼虫の "根性"を可能にします。これは成虫が通常の立体配座に留まることを可能にし、変形することを防ぎます。
4. 鉗子の1対の場所で幼虫の先端部を保持するために、再び口のフックを持ってください。鉗子の他のペアを使用すると、内側の内臓を含めた幼虫の下部3分の2を削除します。注：口のフック、アイ触角ディスク、脳半球、腹側神経節、唾液腺、いくつかの脚ディスク、およびその上のキューティクルを含む複合体が残ります。
5. ピンセットでそっとキューティクル、唾液腺、脚ディスクを覆う取り外し、他の組織。注：残るべき唯一の組織は、口のフック、アイ触角ディスク、脳半球、および腹側神経節（ 図3）である。
6. 繰り返します15〜20分間の追加の幼虫を2.1から2.5を繰り返します。注：より長期間解剖バッファーに残って成虫が低下する傾向があり、最終的に撮影するのに理想的な試験体よりも小さいとして表示されます。このように、20分の最大後に全ての解剖した組織は、（下記参照）のPLP固定液に転送する必要があります。

抗体を用いた3。固定および組織の染色

1. P-200ピペットマンを使用して、冷たいパラ - リジン - 素酸（PLP）固定液を含む時計皿に解剖した組織を移す。 50μlのに移し解剖バッファの限界容積がPLPの希釈を最小限にする。先端開口が解剖した組織を収容するのに十分な大きさであるように、カミソリの刃で先端をカットしてください。ピンセットを使用したか、タングステン針を切開した組織が完全に適切な固定が起こるようにするために沈めていることを確認します。 45分間冷たいPLP固定液中で解剖した組織をインキュベートする。このインキュベーションは撹拌せずに室温で行うことができる。
2. P-200ピペットマンを使用して、45分間の別のカット黄色のチップを使用してバッファ（RT）を洗浄するために解剖した組織を移す。 50μlのに移しPLPの限界容積が洗浄緩衝液の希釈を最小限にする。注：すべての解剖した組織を完全に沈めなければならない。
3. 1.5mlマイクロチューブに解剖した組織の20〜30セットを転送します。注：アイ触角複合体のより大きな数がチューブ内で結合している場合、チューブの底の組織を抗体に適切に曝露されない可能性がある。最適な結果を得るためにはせいぜい20〜30人目触角複合体は、単一の管内に存在してはならない。解剖した組織は、マイクロチューブの底に沈殿します。そのため、後工程でのuの削除し、洗浄緩衝液、ブロッキング溶液、および抗体を交換するピペットマンをSE。
4. 洗浄バッファーを削除し、ブロッキング溶液100μlで置き換えます：洗浄緩衝液中10％正常ヤギ血清。 10分間、卓上回転装置上で穏やかに回転しながら室温でインキュベートする。
5. ブロッキング溶液を除去し、適切に10％正常ヤギ血清中で希釈された一次抗体を100μlと交換してください。 16時間穏やかに回転しながら室温でインキュベートする。
6. 一次抗体を取り出し、洗浄バッファー750μlのと交換してください。場所チューブニューテーター上で10分間室温で章動させることを可能にする。注：一次抗体（4℃で保存）保存し、後で再利用することができます。複数回の抗体を再利用する非特異的結合を減らすのに役立つ。
7. ヘッドはその後、チューブの底に沈殿の洗浄緩衝液を除去し、適切に10％正常血清中で希釈された二次抗体を100μlを追加することができます。 2̵穏やかに回転させながら、室温でインキュベートする1; 4時間。
8. 組織から二次抗体溶液を取り出し、洗浄緩衝液500μlと交換してください。組織がチューブの底に沈殿することを許可する。
9. P-200およびカット黄色のチップを用いて、解剖皿に置かれた洗浄緩衝液のプールにすべての解剖組織を移す。細かい解剖の次のステップに進む一方で、組織は、洗浄緩衝液中でインキュベートします。これは、過剰な二次抗体を除去するのに役立ちます。

4。アイ触角複合体の微細解剖及びスライド上にマウントする

1. 下向きの複合体の腹側で口フックによりキューティクルを握るために鉗子の一組を使用してください。鉗子の第二の対では、脳と目のディスクの間の空間にします（ 図3、赤矢印）を第二の鉗子を閉じて速やかに口のフックから離れて脳を引いて2脳ローブを削除します。
2. 口のフックに押したまま、ピンチオフアイ触角の触角部分と口のフック（ 図3、青色の矢印）との間の接続にできるだけ近い組織。注：アイ触角錯体は、すべての組織（ 図1A）があってはならない。スライド上に配置することができたいすべての所望の組織を解剖されるまで続けます。このプロトコルは、翼、平均棍、脚および性器成虫（ 図1B-E）を単離するために適合させることができる。
3. ティッシュペーパー（カバーガラスのサイズ）の2つの小片を約3インを追加します。離れて解剖皿に。皿の上にガラススライドを置きます - ティッシュペーパー2枚のスライドの端の下でなければなりません。これは解剖皿のシリコーンベースに付着するスライドを防ぐことができます。
4. ノーカットチップでP-20を使用して、顕微鏡用スライドガラスの中央に抗漂白剤の9μlを添加する。蛍光で見たときにこれは、組織の漂白を防ぐ軽い。
5. 同じノーカットチップを使用して、すべての目を触角ディスクを収集し、抗漂白試薬の滴に追加します。引き継がれ、洗浄緩衝液の量を最小限に抑えます。 10μlの以下の洗浄緩衝液の量を制限してみてください。
6. 抗漂白試薬の滴内に目を触角ディスクを分離し、広げるためにピンセットを使用してください。ディスクが数分間抗漂白試薬にインキュベートすることを許可する。注：組織は抗漂白試薬を吸収するようにディスクが明確になります。
7. 細かい絵筆を使って静かに試料上にカバースリップを下げる。これは、気泡の形成を防止する。
8. Storeは光や蛍光顕微鏡を使用して人目を触角や他の成虫を表示する直前まで、-20℃でスライドする。

結果

確実に上述した方法は、その場プローブ 、転写レポーター、タンパク質トラップおよび抗体中での分析のための高品質の素材を生成します。 図1では、私たちが日常的にこの方法で回収されたアイ·アンテナ、性器、翼、平均棍と脚のディスクを表示します。これらのディスクは、F-アクチンに結合し、従って、各セルの概要を説明ファロイジン結合体化フルオロフォアで処理した。組織はその後、適切に目のディスクの形態形成溝を固定されている場合は、生殖器における同心の組織襞の縁、触角、脚ディスク、翼と平均棍ディスクの背腹軸はすべてシャープなエッジを表示されます。組織が ​​適切に固定されている場合は、抗体、蛍光タンパク質およびin situプローブにおいても、シャープなパターンを明らかにする。いくつかの例が図2に示されている。ながら異なる抗体で染色された上部つのパネルディスプレイディスク下位3のパネルは、GFPは、細胞の集団をマークするために使用されるディスクを示す。

ディスカッション

この手順は、主に目を触角ディスクの単離およびその後の治療に焦点を当ててきたが、それは翼、平均棍、足や性器ディスク（ 図4）を単離および分析するために使用されることに適している。 （目を触角ではなく）これらのディスクを分離するためのプロトコルの唯一の必須修正は、粗い解剖（プロトコルのセクション2）の方法である。第一胸椎の脚（T1）のペアは、幼虫の前で見られると目を触角の分離のためのプロトコルに従うことによって回収することができる。しかし第二胸椎の脚（T2）ディスクはクチクラに取り付けられている。鉗子の別のペアは、動物の腹側キューティクルを握るために使用する必要がありながら、（上述のように）一対の鉗子口のフックを保持するために使用されるべきで、これらのディスクを単離するために（から幼虫約3分の1を握るようにしてください口のフック。幼虫は、単純にLARの残りの部分から離れて腹キューティクルを引き裂くことによってフィレットすることができますVA。 T2は脚がキューティクルに付着したままになります。第三の胸部（T3）の脚も、キューティクルに装着され、それ自体複合体の一部として翼と平均棍のディスクに取り付けられてい...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Sylgard 184シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング	184 SIL ELASTキット0.5 KG	解剖プレートのベースを作成するために使用されます
Pryexガラスペトリ皿 150 x 20 mm	ダウコーニング	3160-152CO	解剖プレート
#5 解剖鉗子	テッドペラ	525	鉗子は非常に鋭利に保つ必要があります
9ウェルウォッチガラス	Vairousベンダー		想像上のディスク複合体の固定に使用
50ml 三角フラスコ	様々なベンダー
小さな攪拌棒	様々なベンダー		三角フラスコに収まるほど小さい
50mlコニカルチューブ	様々なベンダー
1.5mlのマイクロフュージチューブ	様々なベンダー		アプリケーションに応じてクリアまたはダーク
マイクロフュージラック	さまざまなベンダー
ベンチトップローテーター	さまざまなベンダー		100 μl容積は低い設定で飛び散るべきではない
パラホルムアルデヒド	マクロンの化学薬品	2-26555-1	固定剤として役立つ
リン酸ナトリウム Monobasic	Sigma Chemical Co	S-3139	解剖および洗浄緩衝液を作るために使用される
Nadium Phosphate Dibasic	Sigma Chemical Co	71636	解剖および洗浄緩衝液を作るために使用される
Lysine	Acros Organics 125221000		固定液に使用
過ヨウ素酸ナトリウム	シグマケミカル社	S-1878	固定液に使用
トリトンX-100	EMDケミカル	ズMTX1568-1	虚円板の穿孔に使用
水酸化ナトリウム	EMサイエンス	SX0593-3	パラホルムアルデヒド
100%正常ヤギ血清	ジャクソン研究所	005-000-121	ブロッキングソリューションとして機能します
一次抗体	さまざまなベンダー		メーカーの指示に従って10%ヤギ血清で希釈します
二次抗体	さまざまなベンダー		メーカーの指示に従って10%ヤギ血清で希釈します
Vectashield	分子プローブ	H-1000	サンプルの漂白を防ぎます
顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	48312-003
ガラスカバースリップ 18 x 18 mm	フィッシャーサイエンティフィック	12-542A
キムワイプティッシュ	様々なベンダー		ガラススライドがシリコンベースに付着するのを防ぎます
パニットブラシ 000	様々なベンダー		サンプルにカバースリップを優しく下げるために使用します