前駆細胞の破骨細胞への分化は、サイトカインと成長因子によって調節されています。ここでは、in vivoでの破骨細胞の分化のための新しい遺伝子導入技術と、破骨細胞形成に対するサイトカインの影響を研究する方法として、in vitroで前駆細胞を破骨細胞に分化するための細胞培養プロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
これらの細胞が主に骨吸収に関与しているため、破骨細胞の分化と活性化は筋骨格系疾患の発症に重要な役割を果たします。破骨細胞は、生存と分化を促進する特定のサイトカインの存在下で、単球/マクロファージ前駆細胞からin vitroで作製できます。ここでは、in vivoとin vitroの両方の技術が実証されており、これにより科学者は破骨細胞の分化、シグナル伝達、および活性化に対するさまざまなサイトカインの寄与を研究することができます。minicircle DNA導入遺伝子導入システムは、骨粗鬆症関連モデルを確立するための代替方法を提供し、in vivoでの様々な薬理学的阻害剤の有効性を研究するために特に有用です。同様に、特定のサイトカインの存在下でヒト前駆細胞から破骨細胞を作製するためのin vitro培養プロトコルにより、科学者は翻訳応用のためにヒト細胞の破骨細胞形成を研究することができます。これらの技術を組み合わせることで、破骨細胞に特化した標的治療薬の創薬活動を加速させる可能性を秘めており、世界中の何百万人もの骨粗鬆症および関節炎患者に利益をもたらす可能性があります。
概要
筋骨格系疾患は、米国および国や地域の保健システムの1のために存在深刻な結果に何百万人もの人々に影響を与えます。これらの疾患は、骨の損失および広範な治療および回復の長い期間を必要とする関節機能によって特徴付けられる。一般に、数および/ または骨粗鬆症および関節炎では、骨を吸収する破骨細胞特化し、細胞の活性の相対的増加が観察される2。生理学的条件下で破骨細胞の数および活性は、骨芽細胞により産生される核因子κ-Bリガンド（RANKL）の受容体活性化によって調節される。オステオプロテゲリン（OPG）、RANKLのためのデコイ受容体はまた、骨芽3によって生成される全身sRANKLの過剰発現、又はOPGの欠失を含むインビボ動物モデルは、骨粗しょう症の研究に非常に有用である。;しかしながら、これらの方法は、トランスジェニックマウス、4,5の発生を必要とする。ここでは、新たな代替筋骨格関連疾患の研究のためのsRANKLを過剰発現させる方法が記載されている。具体的には、ミニサークル（MC）DNA技術および流体力学的送達方法は、インビボで sRANKLの遺伝子導入を達成し、全身6マウスsRANKLを過剰発現するために使用した。
この方法はまた、低カルシウム食8により卵巣切除7および食事介入後の破骨細胞のホ....
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プロトコル
sRANKL MC DNAの1。流体力学的送達
- マウス尾静脈を介して流体力学的送達
- 尾静脈注射の前に、マウスを秤量する。リンゲル液中の希釈sRANKL又は緑色蛍光タンパク質（GFP）MC（37℃で予備加温）マウスの体重の約10％の総体積。
- 血管を拡張し、横方向の静脈LVS（）が表示されるようにするために、注射の前に10分間ケージにマウスを温める。脱水と高体温を避けるために、慎重にマウスを監視します。
- とすぐのLVが拡張したと表示されているように、制止にマウスを移動し、動きを拘束するバレルに十分プラグを挿入します。このような呼吸などの正常な活動のためのマウスを監視します。必要に応じて、拘束具のプラグを調整します。
- 拭いてアルコールで尾の先端から注入領域3月4日を消毒。マウス尾静脈注射用の27〜30 Gの針を使用してください。片手でしっかりと尾を持ち、針を挿入尾静脈へ。注射器に圧力を適用し、5〜7秒以内に注入を完了します。
- 尾静脈から針を外し、出血を止めるために注射部位にコットンボールに圧力をかける。呼吸数は、通常の速度に低下した後、バックビバリウムにマウスを移動して、15〜30分間マウスを監視します。
- マウス血清TRACP5bはポスト遺伝子導入の全身マウスsRANKLの発現および定量の確認
- 血管を拡張と論理ボリュームが見えるようにするために5〜10分間ケージにマウスを温める。脱....
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結果
ここで、破骨細胞形成に対するサイトカインの効果を研究するための方法として、in vitroで破骨細胞への前駆細胞を分化するためのインビボおよび細胞培養プロトコルにおける破骨細胞の分化のための新規な遺伝子導入技術が記載されている。 図1では、マウスにおけるGFPおよびマウスsRANKL MCの成功した遺伝子導入の代表的な結果を示す。 図2において、マウス骨髄または明視野顕微鏡による破骨細胞への前駆細胞のヒトPBMC細胞分化経時培養物の代表的な画像が示されている。 図3、マウス骨髄由来の破骨細胞を特徴付けるための3つの独立した方法からの代表的な画像が示されている。マウスsRANKLの存在は、TRAPの発現（ 図3AおよびB）およびF-アクチンリング（ 図3CおよびD）の形成を活性化する。電気をスキャンするトロン顕微鏡（SEM）は、マウスsRANKL骨（ .......
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ディスカッション
筋骨格条件は、罹患率と障害の原因をリードしているし、150以上の疾患や症候群で構成されます。今日は約90万人のアメリカ人に影響を与える。関節の炎症や骨の破壊性関節炎や骨粗しょう症などの筋骨格症状の主な機能です。骨粗しょう症は、多くの場合、骨の骨折につながる骨の整合性を弱める条件である。関節炎は腫れ、圧痛およびスティッフ制限通常の移動となり、障害につながることができ、関節の炎症を特徴とする慢性、衰弱させる病気です。筋骨格疾患の病因が大幅に互いに異なるが、骨破壊は、包括的な一般的な機能です。筋骨格状態における骨破壊は、主に、骨吸収と骨形成21,22との間の不均衡によって引き起こされる。一つの治療アプローチは、骨を破壊するこれらの細胞の能力を阻止しようとすることです 23まで。ここで説明する技術および手順は、in vivoおよびin vitroの両方の破骨細胞の研究を可能にする。
ここで説明するin vivoモデルも導入遺伝子キャリア24として機能し、細菌の鎖か.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
研究は、NIHの研究助成金R01 AR062173とIEAへのSHC 250862によって部分的に支援されました。ESは、NIH T32 CTSC博士課程前フェローシップの受賞者です。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| ヒト M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| マウス M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| ヒト RANK-リガンド - 可溶 | 性 Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| マウス RANK-リガンド - 可溶 | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| マウス用テールベイナー レストレイン | Braintree | TV-150STD | |
| マウス トランス/ランク L/TNFSF11 Quantikine ELISAキット | R&D systems | MTR00 | |
| 酸性ホスファターゼ白血球 (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | 免疫診断システム | SB-TR103 |
参考文献
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T.
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再版と許可
