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方法論記事

小説 in vivoで遺伝子導入技術と in vitroで細胞ベースのアッセイ

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DOI:

10.3791/51810

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2014年6月8日

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1Division of Rheumatology, Allergy and Clinical Immunology, University of California, Davis, 2Institute for Pediatric Regenerative Medicine, Shriners Hospitals for Children - Northern California, 3Department of Dermatology, University of California, Davis

この記事について

サマリー

前駆細胞の破骨細胞への分化は、サイトカインと成長因子によって調節されています。ここでは、in vivoでの破骨細胞の分化のための新しい遺伝子導入技術と、破骨細胞形成に対するサイトカインの影響を研究する方法として、in vitroで前駆細胞を破骨細胞に分化するための細胞培養プロトコルについて説明します。

要約

これらの細胞が主に骨吸収に関与しているため、破骨細胞の分化と活性化は筋骨格系疾患の発症に重要な役割を果たします。破骨細胞は、生存と分化を促進する特定のサイトカインの存在下で、単球/マクロファージ前駆細胞からin vitroで作製できます。ここでは、in vivoとin vitroの両方の技術が実証されており、これにより科学者は破骨細胞の分化、シグナル伝達、および活性化に対するさまざまなサイトカインの寄与を研究することができます。minicircle DNA導入遺伝子導入システムは、骨粗鬆症関連モデルを確立するための代替方法を提供し、in vivoでの様々な薬理学的阻害剤の有効性を研究するために特に有用です。同様に、特定のサイトカインの存在下でヒト前駆細胞から破骨細胞を作製するためのin vitro培養プロトコルにより、科学者は翻訳応用のためにヒト細胞の破骨細胞形成を研究することができます。これらの技術を組み合わせることで、破骨細胞に特化した標的治療薬の創薬活動を加速させる可能性を秘めており、世界中の何百万人もの骨粗鬆症および関節炎患者に利益をもたらす可能性があります。

概要

筋骨格系疾患は、米国および国や地域の保健システムの1のために存在深刻な結果に何百万人もの人々に影響を与えます。これらの疾患は、骨の損失および広範な治療および回復の長い期間を必要とする関節機能によって特徴付けられる。一般に、数および/ ​​または骨粗鬆症および関節炎では、骨を吸収する破骨細胞特化し、細胞の活性の相対的増加が観察される2。生理学的条件下で破骨細胞の数および活性は、骨芽細胞により産生される核因子κ-Bリガンド（RANKL）の受容体活性化によって調節される。オステオプロテゲリン（OPG）、RANKLのためのデコイ受容体はまた、骨芽3によって生成される全身sRANKLの過剰発現、又はOPGの欠失を含むインビボ動物モデルは、骨粗しょう症の研究に非常に有用である。;しかしながら、これらの方法は、トランスジェニックマウス、4,5の発生を必要とする。ここでは、新たな代替筋骨格関連疾患の研究のためのsRANKLを過剰発現させる方法が記載されている。具体的には、ミニサークル（MC）DNA技術および流体力学的送達方法は、インビボで sRANKLの遺伝子導入を達成し、全身6マウスsRANKLを過剰発現するために使用した。

この方法はまた、低カルシウム食8により卵巣切除7および食事介入後の破骨細胞のホルモンの変調のような骨粗鬆症の他のin vivoモデルに対して相補的である。これらのモデルは、しかし、彼らは外科手術を必要とし、大幅なコスト9で、数ヶ月かかることがあり筋骨格関連障害のさまざまな側面を研究することは非常に便利です。卵巣摘出（OVX）げっ歯類モデルは卵巣の除去は、それによって人間の閉経後骨粗しょう症10を模倣するエストロゲン欠乏につながる実験動物モデルである。人間の閉経後骨粗しょう症、条件エストロゲン欠乏症encyは骨折のリスクの増加につながり、骨粗しょう症は、米国だけで約8万人の女性に影響を与えます。 OVXモデルは、閉経後の骨粗しょう症のために有用であるが、それは一般的に骨粗しょう症の研究に限定された利点を提供しています。エストロゲンは、したがって、その非存在下で破骨細胞活性の増加が観察される10〜12、破骨細胞を誘導し、骨芽細胞のアポトーシスを阻害することによって、骨損失を抑制する。骨吸収に有利RANKL-OPG比の不均衡13も観察される。しかしながら、 インビボでのエストロゲン欠乏はまた、を伴う成長因子β（TGFのβ）のレベルを減少させ、インターロイキン-7（IL-7）、TNF、IL-1およびIL-6 14,15が増加した。これらのサイトカインは、RANKL経路の骨リモデリングの調節機能が独立した知っていたとして、それは単に、RANKL-RANK軸に任意の破骨細胞活性化を帰属させることは不可能である。このホワイトペーパーで説明されたモデルは、VIVに留学する研究者を可能にしますO前炎症性サイトカインのない破骨細胞形成および骨量の減少におけるRANKL-RANK軸は、OVX齧歯類モデルと比較。

また、in vitroでの破骨細胞形成技術は、筋骨格疾患の潜在的な治療的処置のために、破骨細胞の活性化を研究するために不可欠なツールです。以前の研究は、マウスのマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）でマウス骨髄由来マクロファージ（BMMS）を培養し、マウスsRANKLが破骨細胞分化3,16,17につながることが示されている。ここで、マウスの骨髄から、ならびにインビトロ18ヒト末梢血単核細胞（PBMC）からの多核破骨細胞様細胞を生成するためのプロトコルが記載されている。成熟した終末分化して完全に機能する破骨細胞を定義するために必要な、細胞ベースのアッセイも簡単に説明している。これらのインビトロ技術は、生体内のアプローチで小説を補完し、一緒にPとして機能owerful調査ツールは、破骨細胞の分化および活性化を研究する。これらのシステムを使用して、科学者は、 インビボおよびインビトロで破骨細胞を生成し、それらの増殖および活性化に必要な刺激および信号を定義するだけでなく、薬理学的および生物学的阻害剤の有効性を試験することができる。

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プロトコル

sRANKL MC DNAの1。流体力学的送達

  1. マウス尾静脈を介して流体力学的送達
    1. 尾静脈注射の前に、マウスを秤量する。リンゲル液中の希釈sRANKL又は緑色蛍光タンパク質（GFP）MC（37℃で予備加温）マウスの体重の約10％の総体積。
    2. 血管を拡張し、横方向の静脈LVS（）が表示されるようにするために、注射の前に10分間ケージにマウスを温める。脱水と高体温を避けるために、慎重にマウスを監視します。
    3. とすぐのLVが拡張したと表示されているように、制止にマウスを移動し、動きを拘束するバレルに十分プラグを挿入します。このような呼吸などの正常な活動のためのマウスを監視します。必要に応じて、拘束具のプラグを調整します。
    4. 拭いてアルコールで尾の先端から注入領域3月4日を消毒。マウス尾静脈注射用の27〜30 Gの針を使用してください。片手でしっかりと尾を持ち、針を挿入尾静脈へ。注射器に圧力を適用し、5〜7秒以内に注入を完了します。
    5. 尾静脈から針を外し、出血を止めるために注射部位にコットンボールに圧力をかける。呼吸数は、通常の速度に低下した後、バックビバリウムにマウスを移動して、15〜30分間マウスを監視します。
  2. マウス血清TRACP5bはポスト遺伝子導入の全身マウスsRANKLの発現および定量の確認
    1. 血管を拡張と論理ボリュームが見えるようにするために5〜10分間ケージにマウスを温める。脱水と高体温を避けるために、慎重にマウスを監視します。
    2. 尾の先端からサイト1項のマウスの尾の刃で小さな切開を行います。
    3. 血清分離チューブ内の血液の約100μLを収集します。
    4. 30分間室温で血清分離管をインキュベートする。
    5. 5分間万×gで遠心分離サンプルと血清を収集します。 STORさらなる分析のために-80℃でのE血清。
    6. 市販のキットを用いて血清サンプルにsRANKL ELISAおよびマウス血清TRACP5bはアッセイを行う。

2マウス BMMSからin vitro破骨細胞世代で

  1. BMMSの単離​​と培養
    1. 脛骨および大腿骨の骨の単離：CO 2をドナーマウスを安楽死させると、70％エタノールで足を消毒。無傷で大腿骨と脛骨の骨を除去するために、踵骨の骨に恥骨から解剖。
    2. 骨を損傷することなく、慎重に皮膚や筋肉を取り外します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有するペトリ皿に処理し、大腿骨と脛骨を置く。
    3. 骨髄の除去：1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するα-MEMを装填し、大腿骨と脛骨の骨の一方の側に先端をカットし、25 G針を1ミリリットル注射器を用いて50ミリリットルチューブに骨髄を洗い流す（破骨細胞培養培地/ OCM）。
    4. プロセス骨髄：70ミクロンのナイロンセルストレーナーを通過させることにより、新しい50ミリリットルチューブに骨髄懸濁物を混合し、転送します。 300×gで遠心細胞及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％FBS（破骨細胞培養培地/ OCM（+））を含有するα-MEM中に再懸濁する。
  2. マクロファージの文化
    1. 血球計または自動セルカウンターを用いて細胞を数える。
    2. プレート6ウェルプレート、ウェルあたり1×10 6個の細胞または96ウェルプレートに入れ、ガラス製カバースリップ（5mm）を又は象牙質切片に3×10 5個の細胞を、37℃でインキュベートする。
    3. 吸引物のすべてのメディアは、非接着細胞を含有し、48時間、25 ng / mlのマウスM-CSFを含有する新鮮なOCM（+）37℃で細胞をインキュベートする。
    4. 吸引物は、すべてのメディアと新鮮なOCM（+）メディアは、破骨細胞形成を開始する25 ng / mlのマウスのM-CSF、および30 ng / mLのマウスsRANKLを含む、37℃で細胞を培養する。必要に応じて、3日おきにメディアを補充する。
    5. 細胞を育てる約6〜8日間、骨を再吸収することのできる巨大な多核細胞を形成する。とすぐに多核細胞が出現するように、市販のキットを用いて染色し、TRAP（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）を行い、完全に成熟したときに、機能的アッセイを行う。ファロイジン染色および画像先に説明したように19、走査電子顕微鏡（SEM）によってスライスを象牙質に付着細胞を使用してカバースリップ上でF-アクチンを可視化リング。

ヒトPBMCから3。 インビトロ破骨細胞の生成

  1. ヒトPBMCを単離
    1. 50ミリリットルチューブに予め温めヒスト-1077の10ミリリットルを追加します。
    2. 空の白血球フィルターは50mlのチューブ（PBSで血液を1:1の比）中に滅菌PBSで血液バンクから得た。血がヒストと混合しないことを確認しながら、非常にゆっくりとヒストソリューションより希釈した血液をレイヤー。
    3. 18℃で20分間1000×gで遠心分離サンプルフォロー遠心ING、慎重に白血球および新しい50mlチューブへの転送を含む白色バフィーコート層を単離する。
    4. 細胞を回収し、5分間650×gで再度遠心PBSで細胞を希釈する。
    5. メディアや細胞カウンターを用いて細胞を数える - （）OCMで上清と再懸濁細胞を除去する。
  2. メッキおよび培養したPBMC
    1. OCMにおける細胞（+）培地およびプレート8×10 6細胞/ ml当たり6ウェルプレートまたは1×10 6細胞/ ml当たりに96ウェルプレートにウェル再懸濁する。免疫蛍光イメージングのため、ならびに骨吸収アッセイに適した骨切片上のカバーガラス（5mm）をプレート上の細胞を、必要に応じて以前に20に記載のように。
    2. 2〜3日毎に又は必要に応じてヒトM-CSFで細胞を補充変化培養培地。その後、OCMにおける25 ng / mlのヒトM-CSF（+）と一緒に、人間のsRANKLの30 ng / mlのを追加して5日目の分化のステップに進んでosteoclastogenesを開始するメディアです。
    3. 巨大多核細胞を形成するために約14〜21日間、細胞を増殖させる。できるだけ早く多核細胞が出現ように、これらの細胞は次いで、TRAPのために標識することができ、完全に成熟したときに、機能的アッセイを行うことができる。 F-アクチンリングはファロイジン染色を用いてカバーガラス上で可視化することができる。細胞形態は、SEMにより象牙質切片に付着した細胞において試験することができる。

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結果

ここで、破骨細胞形成に対するサイトカインの効果を研究するための方法として、in vitroで破骨細胞への前駆細胞を分化するためのインビボおよび細胞培養プロトコルにおける破骨細胞の分化のための新規な遺伝子導入技術が記載されている。 図1では、マウスにおけるGFPおよびマウスsRANKL MCの成功した遺伝子導入の代表的な結果を示す。 図2において、マウス骨髄または明視野顕微鏡による破骨細胞への前駆細胞のヒトPBMC細胞分化経時培養物の代表的な画像が示されている。 図3、マウス骨髄由来の破骨細胞を特徴付けるための3つの独立した方法からの代表的な画像が示されている。マウスsRANKLの存在は、TRAPの発現（ 図3AおよびB）およびF-アクチンリング（ 図3CおよびD）の形成を活性化する。電気をスキャンするトロン顕微鏡（SEM）は、マウスsRANKL骨（ ...

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ディスカッション

筋骨格条件は、罹患率と障害の原因をリードしているし、150以上の疾患や症候群で構成されます。今日は約90万人のアメリカ人に影響を与える。関節の炎症や骨の破壊性関節炎や骨粗しょう症などの筋骨格症状の主な機能です。骨粗しょう症は、多くの場合、骨の骨折につながる骨の整合性を弱める条件である。関節炎は腫れ、圧痛およびスティッフ制限通常の移動となり、障害につながることができ、関節の炎症を特徴とする慢性、衰弱させる病気です。筋骨格疾患の病因が大幅に互いに異なるが、骨破壊は、包括的な一般的な機能です。筋骨格状態における骨破壊は、主に、骨吸収と骨形成21,22との間の不均衡によって引き起こされる。一つの治療アプローチは、骨を破壊するこれらの細胞の能力を阻止しようとすることです 23まで。ここで説明する技術および手順は、in vivoおよびin vitroの両方の破骨細胞の研究を可能にする。

ここで説明するin vivoモデルも導入遺伝子キャリア24として機能し、細菌の鎖か...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

研究は、NIHの研究助成金R01 AR062173とIEAへのSHC 250862によって部分的に支援されました。ESは、NIH T32 CTSC博士課程前フェローシップの受賞者です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
alpha-MEMLife Technologies 12561-056
ヒト M-CSFMiltenyi Biotec130-096-492
マウス M-CSFMiltenyi Biotec130-094-643
ヒト RANK-リガンド - 可溶性 Miltenyi Biotec130-094-631
マウス RANK-リガンド - 可溶Miltenyi Biotec130-094-076
マウス用テールベイナー レストレインBraintreeTV-150STD
マウス トランス/ランク L/TNFSF11 Quantikine ELISAキット R&D systemsMTR00
酸性ホスファターゼ白血球 (TRAP) KitSigma387A
MouseTRAP assay 免疫診断システムSB-TR103
性

参考文献

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