CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

サマリー

特定の環境ストレス要因にさらされた後、線虫Caenorhabditis elegansは広範な表現型の可塑性を受け、ストレス耐性のある「ダウアー」幼若期に入ります。 ダウアー中の神経可塑性の制御された誘導とイメージングの方法を紹介します。

要約

動物でストレス誘発表現型の可塑性を制御するメカニズムは、生体内で勉強することがしばしば複雑で困難である。ストレス誘発性可塑性の典型的な例はCのdauer段階である虫 。 Dauers、細菌食品やdauerフェロモン高濃度、低濃度の条件下で形成された代替案の発達幼虫期である。 Dauersは、広範な発達や行動の可塑性を表示します。例えば、4つの内側陰唇象限（IL2Q）ニューロンのセットはdauer形成中に豊富な可逆的リモデリングを受ける。 dauerエントリを調節するよく知られた環境の経路を利用して、大量の液体線虫培養物からの粗dauerフェロモンの製造のための以前に確立された方法が示されている。この方法では、50,000濃度 - 液体培養の線虫75,000 / mlを非常に強力な粗dauerフェロモンを生成するのに十分である。原油フェロモン効力はDETEです用量反応バイオアッセイによりrmined。最後に、dauer形成中IL2Qs のin vivoタイムラプスイメージングのために使用される方法が記載されている。

概要

発達や行動の可塑性を含む表現型の可塑性は、不利な環境条件に適応するために重要であると進化¹の原動力であると考えられる。C.虫が頻繁に開発·神経生物学における研究のために使用されるモデル生物である。理想的な条件下で、C.エレガンスは、成人の生殖段階に入る前に4幼虫の段階を経て開発しています。しかし、低食品の可用性と高い人口密度、Cの条件の下でエレガンスは、発達スイッチを受け、長い寿命とストレス耐性のdauerステージ²に入ることができる。 Dauersはおそらく、このストレス耐性を媒介する非dauersからのいくつかの形態学的および行動の相違を示す。 dauerエントリを規制する環境的合図と遺伝的経路は広範囲に^{3、4、5、6、7}について説明したが、分子機構をdを発生する個別の表現型の変化を制御するuringのdauer形成はあまりよく理解されている。

dauer固有の表現型の検査はdauer動物の生産を必要とします。これは、3つの方法で達成することができる。1）Cの飢えた培養物からピッキング虫 、dauer形成構成的（DAF-c）の変異体の2）を使用し、精製されたフェロモンを通じてdauer形成の3）誘導。これは、Cと標準のNGMプレートからdauersを選ぶことは比較的簡単であるその細菌の食料供給を使い果たした虫個体群。私達の手の中に、標準的なNGMプレートがもともと3日間成長させ、その後3を接種したOP50 大腸菌 50μlを、を播種4 -成体雌雄同体は、一週間以内に食糧供給を排気して数千を生成し、25℃に保っさらに3日以内にdauers（多数の飢餓状態の非dauersに加えて）。しかし、この方法は、dの中に脱皮中に発生するプロセスを調べるため不十分であるアウアー。これは、典型的な飢餓プレート上の動物はdauerに入力している数千のかを判断することは困難である。さらに、飢餓状態のプレートの使用は、同期のための可能性を提供していません。 DAF-cの変異体の使用は、同期とdauersの信頼性の高い生成を可能にする。しかし、特定のDAF-C変異は、単独で、またはさらなる変異と組み合わせて他のdauer固有の表現型に影響を与えないという保証はありません。

dauerフェロモンの存在が最初Cassadaとラッセルによって暗黙以降ゴールデンとリドルによって実証された。フェロモンは、以来、化学的に^{2、図8、図9、図10に}特徴付けられている。精製されたフェロモンは異なる形で両方の行動や発達過程^9を規制ascarosidesの複雑なブレンド^、11で構成されています。使用した粗dauerフェロモン抽出物dauerを可能にする野生型のバックグラウンドで同期されたdauersの信頼性が制御さ誘導。

神経系および関連するグリア細胞がdauer幼虫形成が^12、13、14時のリモデリングを受けています。これらの変更のいくつかは、そのようなdauer ^13、14時のグリア細胞のリモデリングとして、不可逆的であるが、他のリモデリング事象が良好に戻った際に可逆的である環境条件。デンドライト樹枝状分岐、multidendriticニューロンと軸索リモデリング^〜12の単一樹状からスイッチ：たとえば、4 IL2Qニューロンの集合が含むdauer形成時の迅速かつ可逆的神経細胞リモデリングを受ける。本明細書の方法は、モデル生物におけるストレス誘発神経可塑性の信頼性のin vivoイメージングを可能にします。生産、粗dauerフェロモンの試験のために提示される方法は、以前にいくつかの情報源^{4、8、15、16、17、18}から説明され、コンパイルされている。

プロトコル

1原油Dauerフェロモン生産

1. OP50 E.を育てる200rpmでLBブロス100mLに振とうしながら37℃でシングルコロニーO / Nから大腸菌 。注：このO / N培養物を、事前に作製し、4℃で保存することができる。
2. N2 C.を育てる虫について15から20 OP50 E.を50μlを接種したNGM寒天（表1のレシピを参照してください）と6センチメートルペトリ皿大腸菌は菌までほとんど^19を空乏化される。
3. 1リットルのエルレンマイヤー中のS·メディアの5倍250ミリリットルを（表1のレシピを参照してください）makeは¹⁹フラスコ。注記：この溶液は、事前に行うことができる。
4. OP50 Eの文化を育てるE.におけるOP50 1mlで接種することによりLBブロスOの4のL / Nが大腸菌大腸菌および16時間37℃で振とう。
5. 4-（ステップ1.3で調製したSメディアとの4 1Lの三角フラスコのそれぞれに4-5プレートから1 S基底溶液（表1のレシピを参照）、転送線虫でプレート（ステップ1.2）から線虫を洗う5プレート各フラスコのための^）19。
6. 10分間650×gでステップ1.4からOP50を遠心し、上清を除去します。 S基底溶液10mlに各細菌ペレットを再懸濁。線虫の各フラスコに再懸濁した細菌の同量を転送します。
7. 解決策は、食品の枯渇を示す、クリアし始めるまで5日間 - （ - 25°Cの20）および100 - 4 150 rpmで室温でオービタルシェーカーフラスコを置きます。
8. 食料が枯渇したら、OP50 Eの別のO / N培養を育てるLBブロスの4倍1L中大腸菌 。 10分間650×gで、細菌を遠心分離し、線虫とSメディアフラスコのそれぞれに1フラスコからのペレットを追加します。食べ物が再びなくなるまでさらに3〜4日間、ステップ1.7のように、オービタルシェーカーにSメディアフラスコを返します。
9. 各フラスコからの溶液〜1ミリリットルのアリコートを取り、サブサンプリング、各1ミリリットルアリコートから1μLをし、線虫の数をカウントすることによって、線虫の濃度を推定。注：75,000線虫/ mlの - 線虫の人口50,000にする必要があります。この濃度での線虫の大部分はdauersある。
10. いずれの汚染されたフラスコを捨てる。注：汚染が頻繁にステップ1.9の間に見られる真菌の菌糸として現れる。
11. 4℃で10分間、4,000×gで遠心分離した線虫。線虫のペレットを捨て、上清を保持している。別の方法として、低効力フェロモンを作るためにこれらの動物を使用するための説明を参照してください。
12. ＃1ワットマン濾紙で上澄みをろ過する。 NOTE：真空フラスコは、このプロセスを促進するであろう。
13. さらに0.45μmの無菌真空濾過ユニットを通して上清をフィルタリングする。注：ろ液を4℃でO / N保たまたは1.14に進むことができます。
14. 攪拌棒を備えた2リットルのビーカーにろ液を追加します。加熱撹拌プレート上のドラフト内に置きます。攪拌しながら沸騰させ、約200mlに蒸発する。 500ミリリットルのビーカーにソリューションを転送します。約50ミリリットルがルになるまで沸騰続行フィート注：ソリューションがオーバー沸騰することは可能であるように注意がこのステップの間に注意する必要があります。最後の50ミリリットルの色はダークブラウンです。調理プロセス中の任意の時点で、加熱を停止することができ、ろ液をRTまたは4℃でO / Nを記憶する。
15. クール1,000×gで5分間遠心分離してみましょう。 100ミリリットルのビーカーに上清を注ぎ、ペレットを捨てる。
16. 茶色の皮に、上清を煮詰める。暑さから削除し、へらで地殻を破る。地殻をカバーするのに十分な200プルーフのエタノールを追加します。パラフィルムでビーカーをカバーし、それは、室温でO / Nを座らせて。きれいなビーカーにエタノールを捨て、横に置く。地殻をカバーする新たなエタノールを追加します。 O / Nの抽出を3回繰り返します。抽出物をプール。
17. エタノール抽出を乾燥させるために、真空ポンプを使用してください。真空ポンプが使用できない場合はドラフト内で攪拌しながら、50℃にきれいなビーカーと暖かいにエタノール抽出物を追加します。注：エタノールをlの粘着性の残留物を蒸発した後IGHTブラウン色がままにしてください。加熱が使用される場合、注意が長すぎるために加熱して溶液を燃焼しないように注意すべきである。
18. 滅菌蒸留水10mlに残渣を溶解。フィルターは1mlアリコートにおいて-20℃で0.22μmのシリンジフィルターとストアこの溶液を滅菌する。 NOTE：1mlの水は、元の液体線虫培養物100ml毎ための残渣を溶解するために使用される。液体培養フラスコの一つは、汚染に起因して破棄された場合、次に残留物を溶解するために使用される水の量を調整する。

フェロモン用量反応の2の決定

1. ペプトンことなく、ノーブル寒天でNGM培地の6倍5ミリリットルを行うことで、dauerフェロモンを準備し、および50μg/ ml硫酸ストレプトマイシンとdauerフェロモンの範囲（表1のレシピを参照してください^）4、19を補充した。13x100 mm単位で成分を混合ガラス培養管は、ブンゼンバーナーの上に沸騰してから、3センチメートルペトリ皿に注ぐ。
2. 午前の重量を測定icrocentrifugeチューブ。 EのO / N培養の1ミリリットルを追加します。マイクロチューブ内〜17000×gでチューブと遠心分離機に大腸菌 OP50。上清のすべてを削除します。再びチューブを計量し、細菌ペレットの重量を決定する。 4％の最終濃度（表1の処方を参照）M9緩衝液でペレットを再懸濁^（w / _v）の 。一定分量の各フェロモン板⁴の中央部への細菌懸濁液10μl。 RTで保管プレートO / N。
3. 10-15妊娠N2野生型の雌雄同体のフェロモン板⁴の上に大人になって脱皮した後、ある日を選択してください。 4時間 - 3、25℃でプレートを保管してください。
4. 大人の雌雄同体のすべてをオフに選んでください。各プレートについての産卵数を記録します。パラフィルムでプレートを密封し、3日間¹⁷ 25℃に戻ります。
5. dauersのパーセンテージをカウントし（ 図2）。注：両方の方法のためには、dauers（およびより少ない元に留意することが重要である10トン非dauers）が壁を登るとペトリ皿の蓋の上になります。これは、線虫のための料理のすべての表面を調べることが重要である。
6. 用量反応曲線にデータをフィットし、 図3に示すように、（dauersを形成するために、動物の90％を誘導するのに十分なフェロモン）フェロモンのEC ₉₀濃度を推定注：私たちは、典型的にはEC _90を推定するためにロジスティック回帰モデルを使用ししかし、異なる統計ソフトウェアパッケージは、同様の推定値を生成する別の方法を有することができる。

Dauer IL2ニューロンの3。ライブイメージング

1. ステップ2.6で決定されたEC ₉₀値を使用して、プロトコル2のようにdauerフェロモンプレートを準備します。
2. 統合されたIL2レポーター導入遺伝子を有する株（myIs13 [Pの_KLP-6 :: GFP]、myIs14 [Pの_KLP-6 :: GFP]、myIs16 [Pで、プロトコル2の方法を使用してdauersを誘導する _KLP-6 :: tdTomato]またはqIs56 [P _ラグ-2 :: ^{GFP]）12、20、21}注：Q Is56を使用する場合には、GFPの発現は、中に数時間までIL2Qsに表示されませんdauer脱皮し、初期のリモデリング事象の一部が表示されません。 P _ラグ-2 :: GFP導入遺伝子からの蛍光シグナルは、P _KLP-6蛍光レポーターよりdauer中にIL2sにおける究極的に明るくなっている間に加えて、P _ラグ-2は :: GFP導入遺伝子はまた、頭部の筋肉に弱く発現する細かいIL2の枝をマスクすることができます。
3. 産卵の後、大人の雌雄同体を削除するパラフィルムでプレートを密封し^、25℃17で34時間インキュベートする。注：dauerの脱皮までの時間の長さは、個体間でわずかに異なります。 dauer脱皮の開始後5時間（39 - - デンドライト樹枝状分岐の中で最も急速な期間は4を開始する44時間後に産卵25℃で^）12。
4. イメージング前日は、EC ₉₀濃度のdauerフェロモンとM9緩衝液中の^10％（w / _v）アガロースの溶液を作る。アリコートをアガロースの約100μlの顕微鏡スライド上に、迅速に、かつ慎重に、平らなアガロース面を作成するために上に別のスライドを置く。アガロースが固化した後、湿度室（ウェットペーパータオルでピペットチップボックス）にサランラップや店舗でスライドを包む。
5. 34時間のインキュベーション期間の後、咽頭のポンピングを停止した線虫のためのフェロモンプレートを調べます。つのスライドの片面のみがそれをアガロース有するように、別個のスライド。 10％のアガロースパッドと0.1ミクロンのポリスチレンビーズ²²の1μlの上に1つ以上の線虫を選択してください。注：よく同期人口、プレート上の線虫の大部分はL2dをからdauerに脱皮を締結されます。しかし、私の中で変​​動​​があるかもしれないndividuals。それは、動物はdauer脱皮内であった時間（例えば代表的な結果を参照してください）​​の量を推定するための追加機能（ストーマ閉塞、咽頭リモデリング）を注意することが重要である。
6. 線虫の向き（左/右、背側/腹側）を決定します。可能な限り低い蛍光強度100倍、15分毎にIL2QデンドライトのZスタック画像を取り込むか、特定の実験の必要に応じ。線虫はL2dのキューティクルおよび固定化から分離するまで、画像を撮影続行動物はdauerから回復した場合（咽頭のポンピングを開始する）ことは不可能であるか。積極的にイメージングしない場合には、湿度チャンバ内のスライドを置く。注：私たちは、電動ステージと微分干渉コントラスト（DIC）光学系と落射蛍光顕微鏡を使用しています。

結果

暑さと寒さに安定でもある黄色の液体中の粗dauerフェロモン結果（ 図1）の産生。原油フェロモンのアリコートの活性の明らかな損失で無期限に-20℃で保存されている。フェロモンの生産に続き、単用量反応バイオアッセイは、効力を概算するのに十分である。 3回、各実験からの平均を取る - しかし、ほとんどの実験のためにはバイオアッセイ2を繰り返す必要がある。 2フェロモンバイオアッセイからの代表的結果を図3に示す。これらのデータからEC ₅₀およびEC ₉₀を計算すること_ができる。

ドデシル硫酸ナトリウム²に対する抵抗性に加えて、dauersが閉塞されたストーマを含むいくつかの形態学的特徴によって認識することができ、横方向の鼻翼前方皮下組織および咽頭収縮（ 図2及び図4Aのfoにおいて、屈折体R L2幼虫）。 Dauersも含むいくつかの特徴的な行動特性があります。運動...

ディスカッション

dauer特有の神経可塑性およびその他のdauer関連形態学的変化を調べたところ、遺伝子変異（ すなわち、DAF-C変異体）を介して、またはフェロモンに野生型動物の曝露のいずれかによってdauersの制御された、信頼性の高い形成する必要がある。 dauersを誘導する遺伝子変異の使用が便利であるが、それは、結果を混乱させることがある。したがってDAF-cの変異を有する収集されたデータは、その後、dauerフェロモンへの曝露によってdauer段階に入るように誘導野生型動物で確認する必要があります。

粗製dauerフェロモンの生産は比較的単純であり、このプロトコルのバリエーションは^18を発表^している。汚染の可能性を除いて、ここで紹介する方法は、非常に信頼性が高い。抽出物を製造するためには、Sメディア液体培地¹⁹で線虫の大密度を培養する標準的な方法を使用します。イニシア量の柔軟性が多量に存在しLの線虫の接種物を、液体培養物に添加。線虫のより大きな数字で起動すると、手続きを迅速化します。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
N2 C. elegans ブリストル株	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	シュローダー研究室
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	シュローダー研究所
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri Dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM 寒天	各種		3 g NaCl、17 g 寒天、2.5 g ペプトン 975 ml H2O オートクレーブ 55°C に冷却;Cに続いてエタノール中の5 mg / mlコレステロール1 ml、25 mlの1 M KPO4緩衝液(pH 6.0)、1 mLの1 M CaCl2、1 mLの1 M MgSO4
S培地	さまざまな		S培地は、S基礎溶液(1.46 g NaCl、 0.25g K2HPO4、1.5g KH2PO4、エタノール中の5mg/mlコレステロール0.25mlおよびH2O〜250mlのオートクレーブ滅菌済み。S基礎溶液に2.5 mlのクエン酸カリウムpH 6.0(2 gのクエン酸一水和物、29.4 gのクエン酸カリウム一水和物<サブ>、H<サブ>2< / sub>O〜100 ml、オートクレーブ)、2.5 mlの微量金属溶液(1.86 gのEDTA二ナトリウム、0.69 gのFeSO4 &ブル;7 H2O、0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 &ブル;7 H2O, 0.025 g CuSO4 &ブル;5 H2O、H2O to 1 L. オートクレーブ滅菌して暗所で保存)、0.75 ml の 1 M CaCl2、および 0.75 ml の 1 M MgSO4。
用量反応アッセイ用のダウアーフェロモンプレート	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 & micro;5 mg / mlコレステロールのLを6x 15 mL培養チューブのそれぞれでエタノールに溶解。各チューブに十分な粗フェロモンを添加して、さまざまな濃度を作り出します。H2Oを加えると、容量は4.725mlになります。寒天が溶けるまでブンゼンバーナーで沸騰させ、55°Cに冷まします。l 1 M KPO4バッファー(pH 6.0)、50 µl 0.1 M CaCl2、50 µl 0.1 M MgSO4および50 µ各チューブに5 mg / ml硫酸ストレプトマイシンのl。 各チューブの内容物を直径35mmのペトリ皿に注ぎます。寒天を室温で一晩固化させます(それ以上の場合は、過度の乾燥を防ぐために密閉容器に保管してください)。
マイクロスフェアビーズ 0.1ミクロン	Polysciences Inc.	00876-15
M9 バッファー	各種		混合 3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO4、 H2Oから1リットル。オートクレーブ滅菌

からの要請に応じてからの要請に応じて