タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

細胞の超微細構造の私たちの知識は、数ナノメートル¹の範囲の内容を解決することができ、電子顕微鏡から主に来る。サンプル調製は時間がかかり、面倒なプロトコルを必要とし、開業医からいくつかの専門知識を要求するように分解能TEMで非常に強力であるにもかかわらず、ユーザーフレンドリーとはみなされません。サンプルの伝統的な固定は、樹脂中に埋め込み、次いで重金属で染色した超薄切片を作製するために切片化、脱水を含むさらなる処理の前に、アルデヒドおよび四酸化オスミウムの使用を組み合わせている。しかしながら、化学的な固定は、最終的にいくつかの細胞区画²に影響^を与える膜へのタンパク質凝集及び脂質¹の損失、および変更を含むアーティファクトを生成することが知られている。これらのアーティファクトは、主に、室温^3、4、5で固定し、脱水の遅い速度に起因する。

、7。HPFが低下し^、20度の水の凝固点を低下させる氷結晶の核生成及び成長を遅くし、細胞成分を本質的に⁶固定されているように、生物学的サンプル中の水の粘度を増大させることであるミリ秒単位の非常に高圧（210 MPa以上2,100バール）の下で、液体窒素とサンプルの温度、。適切に行われると、HPFは、細胞の超微細構造に大きな損傷を引き起こす可能性があり、大きな氷結晶の形成を防止する。 HPFは、生物学的溶質⁷の典型的な濃度で100〜200ミクロンの厚さのサンプルを固定するために使用することができる。多数の物理学の口コミHPF、 たとえば ^1、7,8の基礎となる原則があります。

HPF後、試料を低温でインキュベートする（-78.5°C〜-90＆＃176; C）は、一般的に数日間、四酸化オスミウムなどの化学固定剤を含有する液体有機溶媒の存在下で行われる。この低い温度では、サンプル中の水、有機溶媒、典型的にはアセトンまたはメタノール^1,9によって置換される。したがって、このプロセスは、凍結置換（FS）と呼ばれている。次いで、試料を次第に温め、この時間の間、通常は四酸化オスミウムおよび酢酸ウラニル⁹と、固定されている。低温での架橋は^1を固定化された分子を固定するという利点を有する。 FSしたがって、改良された超微細構造の保存をもたらし、特に、室温で通常の化学的固定により固定したものに比べて優れた品質、抗原性の良好な保存のサンプルを生成し、未結合の細胞成分^10,11の損失を減少させた。

最もFSは、典型的には数日間まで、長期間にわたって行われる。これは、特にトゥルーである植物標本^12、13、14の電子。マクドナルドやウェッブによって開発された最近のプロトコルは大幅に数時間から¹⁵数日からFSのための時間を削減します。スーパークイックFS（SQFS）でサンプルが90分で処理されている間、それらの急速凍結置換（QFS）手順では、FSは、3時間かけて行われる。これらの方法により作製したサンプルの品質は、従来のFSプロトコルによって得られたものに匹敵する。私たちは、HPF後に植物試料の下流処理のためQFSプロトコルを採用しています。 QFSおよびSQFSではなく、高価な市販のFSマシンの一般的なラボ機器を使用するため、これは、時間だけでなく、お金ではないだけを保存することが証明されています。

植物組織は、多くの場合、TEMの準備をすることは非常に挑戦的である。平均して、植物細胞、細菌細胞または動物細胞のいずれよりも大きくしている。疎水性のワックス状のキューティクル、厚い細胞壁、有機酸、加水分解酵素とフェノールcを含む大きな水で満たされた空胞の存在総細胞体積¹⁶の最大90％を占め、曝気スペースの存在は、深刻なシステム¹⁷の熱伝導率を低下させることができるompounds。さらに、植物の場合には、試料の厚さは、ほとんどの場合は20μm、化学的固着の使用の制限を超えています。これらの厚さで、水の低い熱伝導率は、サンプルの中心に凍結速度を超える-10,000°C /秒のを防止する。その速度は、有害な六角形の氷の形成（10〜15ナノメートルよりも低い密度と大きな氷結晶^）8を回避するために必要とされる。サンプルの適切な凍結およびその後のFSの両方に同時に、これらの課題を提示。それにもかかわらず、低温固定は植物試料を固定するための最良の方法です。ここで植物組織試料のHPF-QFSのためのプロトコルが提示される。これは、モデル種のシロイヌナズナに焦点を当て、またベンサミアナタバコで使用されてきた。典型的な結果は、HPF-QFSはSAを生成することを実証わずかな時間での伝統的なHPF-FSに匹敵する品質のmples。適切な調整で、このプロトコルは、他の比較的厚い生物学的試料のために使用することができる。

注：QFS手順は、ユーザが十分な注意と注意を必要とし、私たちは、適用上の注意と注意事項としてここにこれらの安全上の注意を強調表示します。

HPFラン用1.Preparation

1. サンプル調製を開始する前に、製造業者の指示に従って、高圧冷凍庫の電源をオンにします。
   注：このプロトコルで使用されるHPFユニットがWohlwendコンパクト02単位（ 図1A）で、HPFの実行前には開始することができる起動手順の1時間半に約1かかります。
   1. Wohlwendコンパクト02高圧冷凍庫に切り替える。
      1. "1"から"0"メインスイッチを回すことにより、機器のスイッチを入れる。
      2. マシンに圧縮空気を解放します。
      3. マシンに液体窒素をリリースします。
      4. "SYSTEMドライUP」ボタンを押します。
      5. 30分後、「本稿では、Webを押してくださいMドライUP」ボタンを押します。
      6. 計器のスイッチを入れる「ON / OFF」ボタンを押します。
      7. 「窒素」ボタンを押します。
      8. 「DRIVE IN」ボタンはすでに点灯している場合でも、マシンは20分間冷却して。
      9. ボタン "でドライブ"が点灯。
      10. ボタン "でドライブ」を押します。
      11. 「AUTO」ボタンを押します。
      12. 「SYSTEM READY」ボタンが点灯します。
      13. 圧力室に温度と圧力プローブを配置し、ピンを使用して固定します。
      14. 「JET AUTO」ボタンを押します。このステップは、必要に応じて圧力上昇と温度低下であることをチェックする。基本的に試運転。シャープは、温度に低下し、圧力の急激な増加は、（ 図1B）が期待されている。
      15. さらに2つのジェットのサイクルを実施する。

Receiviのため2。準備ngの冷凍サンプル

1. 保有者が完全に覆われるように（ 図1C）、（安全上の警告を参照のこと）、液体窒素で冷凍バイアルホルダーを含む断熱箱を埋める。
   注：液体窒素を取り扱う際に使用してPPEはcryoglovesとゴーグルを含む。
2. 液体窒素（ 図1C）でアルミニウム管ホルダーにFS培地を含むバイアルの適切な数を配置します。最大4つのディスクは、このプロトコルでは、単一のサンプルを含む各単一の凍結バイアルに配置することができます。
   注：バイアルはダイヤモンドひっくり返されたスクライブし、非常に柔らかい鉛筆のような鋭利な器具で標識する必要があります。
   1. QFS中の固定剤のためには、1％のOsO ₄及びアセトン⁹中の0.1％酢酸ウラニルを使用しています。大量に溶液を調製し、液体窒素中で凍結クリオバイアルとストアに1.5ミリリットルのアリコートを分注する。
      注：のOsO ₄及び酢酸ウラニルを処理するための安全に関する警告に従ってください。
      注：のOsO ₄ 注：QFSのためのサンプルを保持するために使用されるクライオバイアルチューブはのOsO ₄の漏れを避けるために、QFSの間に密封されたままであることを確実にするためにハードにOリングを持っている必要があります。
3. ペーストが滑らかになるまで、爪楊枝又は他のそのような器具を用いて10％メタノールの約等量のパン酵母を混合することにより、酵母ペーストを準備します。酵母ペーストは、細胞外凍結保護剤として作用し、試料キャリア内の試料の周りの空間を充填するために使用される。ペーストの量はサンプル数に依存する。 10サンプルまたはより少ない用ペースト（1ml）をマイクロ遠心管中で混合することができる。

サンプルの3。高圧凍結

1. 植物から興味のある葉（または他の組織）を外し、静かにdentaの作品の上に置きますlのワックス又は他の切断面。葉からサンプルを切断するために2.0mm以下所望の大きさのパンチを使用してください。ピンセットで軽くサンプルを処理し、可能な限り迅速に動作します。
2. 解剖顕微鏡下での作業、型試料キャリア0.2ミリ側にリーフディスクを配置し、酵母ペーストで完全に覆う。ディスクが完全に満たされていることを確認し、ペーストが細かい絵筆（ 図2）を用いてペーストを滑らかにすることにより、ホルダの縁と同じ高さ。
3. 試料ホルダーにキャリアを配置します。タイプB検体キャリア、平らな面を下にしたサンプルをカバー。
   注：試料ホルダーは、乾燥し、室温であるべきである。
4. 試料ホルダーにサンプルを取り、機械に挿入し、1〜2秒で完了するはずです "JET AUTO」ボタンを押すと、冷凍サイクルを開始。
5. 可能な限り迅速に作業を、機械からホルダーを取り外し、SAMPを保持するチップを置くルHPFマシンの上に絶縁されたボックス内の液体窒素に変換する。それらを冷却する液体窒素中で鉗子の二対の先端を浸し。
   注：凍結後、キャリアは、液体窒素冷却した鉗子で処理する必要があります。ウォーム（室温）鉗子は、多くの場合、cryotechniquesの失敗の原因となっています。
6. FS培地を含むクリオバイアルを開き、箱の側面に蓋を置く。液体窒素で冷却したピンセットを用いて、そっとディスクは、液体窒素または蒸気中に常にあることを確認、試料ホルダからディスクを取り出します。液体窒素蒸気での作業、1予冷した鉗子でFSチューブを保持し、FSのバイアル中にホルダーを配置するために、他を使用しています。背面のFSバイアル​​の蓋をねじ込みます。いないトラップのバイアル内の任意の液体窒素の操作を行います。
   注：、QFS用のクライオバイアルに液体窒素がバイアル中に閉じ込められていないことを確実にするためのサンプルを転送する。液体窒素は温暖化とあらゆるTrappeの間に700倍に拡大しdは、液体窒素はこの時間の間に爆発を引き起こす可能性があります。
7. すべての希望するサンプルが凍結されるまで繰り返して3.7に3.1を繰り返します。サンプルの同じタイプを含む複数のリーフディスクを同じバイアルに入れることができる。試料ホルダーを乾燥させ、凍結実行の間に室温に戻しする必要があることに注意してください。すぐにこれを行うには、ブロードライヤーでそれを加熱し、タッチでその温度を監視します。

フリーズ交代のため4。準備

1. 完全に10分間、または核沸騰が止まるまで液体窒素中でアルミニウムヒーターブロックを浸す。これが起こっているが、FSチャンバー（ 図3）として使用される容器の底にドライアイス（1-2センチ）の層を配置します。発泡スチロール容器またはアイスバケットを砕いたドライアイス又はペレットと一緒に、FSのために使用することができる。
2. すぐにヒータブロックの中段に温度プローブと一緒にサンプルを含むクリオバイアルを挿入します。必ずその上に蓋FSメディアがFS中に漏れないようにバイアルをしっかりとねじ止めされている。温度の記録を開始します。
   1. それはチューブの底に達するようにクリオバイアルの上部を通って熱電対を配置することによって、温度プローブを作る。液体が漏れるないように樹脂でチューブのふたを密封。各QFSの実行の開始時に1.5ミリリットルのアセトンでチューブを埋める。
3. 絶縁cryoglovesや大きな鉗子を使用して、ヒーターブロックからすべての液体窒素を注ぐ。クリオバイアルを注ぎないように注意してください。
   注：液体窒素を取り扱う際に使用してPPEはcryoglovesとゴーグルを含む。
4. QFS室においてドライアイスの層へのバイアルを含むブロックを配置します。チューブが水平に横になったが、わずかな上向きに傾斜しているように、ブロックが置かれていることを確認します。正しいクリオバイアルを使用する場合に漏れがあってはなりません。
5. FS管が覆われるようにそれがする必要はありませんが、ドライアイスでQFS室をパックブロックの上部をカバーしています。チャンバーに蓋を置きます。

5。クイックFS

注：のOsO ₄の漏れが誤って他の予防措置にもかかわらず、発生した場合にはドラフト内でQFSの実行を行います。

1. ドラフト内でプラットフォームロータリーシェーカー上QFS室を置き、120分間125 rpmで回転する。この間、ブロックの温度は、約-80℃に次第に増加するはずである。攪拌は、より良い、FSのための成分の混合を確実にします。
   注：ドラフト中シェーカーの配置とヒュームフードドアの位置がQFS手順全体を通して、サンプルの一貫した温暖化を確実にするために実行するたびQFSのために同じである必要があります。
2. チャンバからドライアイスを取り出し、さらに1時間振盪し続ける。
   注：温度が約-15℃〜-20℃に増加するはずである。
3. QFS室からのサンプルおよび温度プローブを外し、上に置くさらに10〜15分間、室温でシェーカーまで、それらが室温に達する。温度の記録を停止します。
4. FSの間に、HPFマシンをオフにしてください。
   1. HPFマシンは窒素を充填されている間に、液体窒素タンクのタップを閉じます。
   2. 「窒素」ボタンを押します。
   3. 赤い "PISTON DOWN」ライトが消灯するまで待ちます。
   4. 「ON / OFF」ボタンを押します。
   5. "SYSTEMドライUP」ボタンを押します。
   6. マシンへの圧縮空気の供給を遮断する。
   7. 12時間の最小値の後、（存在する水分の乾燥を確実にするため） "0"から "1"にメインスイッチを回すことにより、マシンのスイッチを切る。

6ポストFS処理

1. 慎重に有毒廃棄物の適切な容器にプラスチック製ホールピペットと場所で、FSメディアを取り出します。
   注：のOsO ₄及び酢酸ウラニルは危険な化学物質であるクローズドつま先の靴、白衣や手袋などの適切な保護具（P​​PE）を装着したままとドラフト内で処理する必要があります。
2. 洗浄サンプル、100％アセトンで4回。最初の2回の洗浄を収集し、有毒廃棄物容器内に配置します。
3. 細かい鉗子を使用して、所有者からの組織サンプルを削除します。これが行われているようにアセトンで湿ったサンプルを保管し、破損のサンプルを回避するために、非常に静かに動作します。
   注：これは珍しいことではないし、それが実際に酵母ペーストは、この時点でサンプルから離れて落ちる有することが有用であり得る。葉組織がまだ緑である間酵母ペーストは通常​​、非常に濃い茶色です。
4. アセトンを含むクリオバイアル内のサンプルを収集します。通常のプロトコールに従ってTEM用サンプル調製（浸潤と埋め込み）を続行します。

以下に示す結果は、HPFのためWohlwendコンパクト02（ 図1A）を使用して得られている。この装置の1つの主な利点は、試料キャリア及びその所有者の使いやすさである。他の楽器を使用する場合は、マクドナルド、2人のユーザーが、他の凍結を行い、FSへの転送が9をクリオバイアルながら試料を調製する試料調製とHPF、1を行うべきであると推奨しています。しかし、Wohlwend標本キャリアやホルダーは、独立して操作するための単一のユーザ（ 図2A、B、E、FおよびG）のために十分に簡単である。しかし一つは、いくつかの試験は、貴重なサンプルを操作する前に、HPF機器に精通するために実行する実行する必要があることに言及すべきである。経験のあるユーザーは、時間のいくつかの（10以上）のサンプルを修正することができるはずです。しかしながら、このプロトコルで提示原理は、市販のHPF機のいずれかと共に使用することができる。

たぶんHPF-QFS手順の最も重要な部分は、試料キャリア（ 図2C）にロードするためのサンプル調製である。これは直感的ではないかもしれないが、それは研究者がほとんどで支配しているプロトコルのステップである。 HPF機は堅牢で、かつ適切な使用とメンテナンスで、サンプル間のばらつきの少ない圧力と温度の予想される変化を生成する必要があります。試料が不十分準備中に処理される場合には、他のステップはそう被害を買い戻すん。彼らは培地で培養していないし、その細胞壁は、細胞の良好な強度を与えるように植物組織は、プロセスのこの段階で、操作は簡単です。これは、サンプルが、親植物からの除去から生じる超微細構造の変化を避けるために、ストレスや負傷応答を制限するために迅速に処理されることにもかかわらず重要である。サンプルを収容できる最小の試料キャリアは、効率的かつ一貫性のあるHPF（ 図を確実にするために使用されるべきであるUREの2C）。最後に、試料キャリアはいっぱいあるが（ 図2D）オーバーフローしていない必要があります。充填された試料キャリアが容易に（ 図2 H及びI）を冷凍するためのHPF機に挿入される。

QFSプロトコルにおける最初のステップは、初心者のために挑戦することができますので、ユーザーが手順（ 図3A-E）で快適になるまで二人は一緒に仕事することをお勧めします。液体窒素と固定剤の四酸化オスミウムおよび酢酸ウラニルを取り扱う際には注意を常に注意する必要があります。 QFS中の温度変化の典型的な曲線を図2Jに示されている。約-80℃〜-196℃の液体窒素の温度、より急速に温度が上昇する。これは、凍結置換が9起こると考えられている周りに-78℃〜-90℃の温度である。 QFSプロトコルにおける一つの挑戦的なステップは、FSの2時間後に、ドライアイスの除去である。アットこのステップでは、サンプルの取り扱いを誤ると、温度のスパイクを生成することができます。このため、ヒータブロック迅速cryogloveを使用してQFSチャンバから持ち上げされるべきであり、ドライアイスを迅速に第2の容器中に注ぎ出した。

HPFは、 ベンサミアナタバコの葉とシロイヌナズナの葉と胚を含むさまざまな植物組織を固定するために使用されてきた。それが原因で最も細胞の大きな中心液胞に成熟した葉から試料を固定するために挑戦している。若い葉は小さい空胞が含まれているが、毛状突起は通常、非常に密に充填されている。毛状突起の存在が困難酵母ペーストでサンプルをパックするために作るが、これは正しく葉の表面とペーストの間に閉じ込められた空気の量を最小化するために行われることを保証するために注意しなければならないことができる。閉じ込められた空気は、HPFの間に熱伝達を妨げ、固定の質が低下します。これは、任意のサンプルについても同様です。

HPFとQFSのサンプルは、viのために調製することができる後浸潤や樹脂で埋め込むことにより、TEM下ユーイング。 65〜100ナノメートルの薄切片を切片化することによって調製することができる。典型的な結果を図4に示す。示されている画像は、シロイヌナズナの葉サンプルから全てである。原形質膜は、典型的には良好な固定（ 図4A、C及びE）の符号円滑かつ細胞壁に押し付けられている。葉緑体（ 図4A、D、FおよびH）およびチラコイド（ 図4B）、ミトコンドリア（ 図4DおよびF）、ゴルジ（ 図4、G）、微小管（ 図4E）およびリボソーム（特に図4C）を含む他の細胞小器官でもあるはっきりと見えると中央の大きな空胞（ 図4A）は無傷のままである。氷結晶による損傷（ 図4D）、および原形質分離（ 図4H）を含むアーティファクトHPF-QFS結果中に悪い扱い。鉛の沈殿物はまたセクションの染色の際に形成することができるS（ 図4F）。

図1：Wohlwend小型02高圧冷凍庫（A）接続されたコンピュータ端末との低温固定するために使用Wohlwendコンパクト02 HPF機。サンプルは、凍結のための機械（小さな円）の前に挿入されます。温度曲線は、ユーザが所望するように、各実行するためのコンピュータ画面上に生成することができる。（B）HPF実行するための典型的な温度-圧力曲線。黄色、紫色線は、それぞれ、温度および圧力を表す。両方の曲線の急な斜面に注意してください。高い圧力は約400ミリ秒維持される。 x軸上の各間隔が50ミリ秒を表す。データはDSIM12ソフトウェア用EasyScopeIIで収集した。ストレージOに使用する（C）絶縁されたボックスとカバー直ちに凍結後のfの凍結試料は、好都合上HPF機を配置することができる。これは、液体窒素が充填されている。丸いアルミ容器は、凍結バイアルを保持します。

図2：HPFのための準備組織サンプル。その閉じた構成における（A）コンパクト02 HPF機用の試料ホルダ。（B）試料ホルダーが開いている。（C）タイプの試料キャリア0.2ミリメートルウェル内のリーフ·サンプル。このキャリアの反対側は0.1mmで深さ（D）は、酵母ペーストで覆われた葉のサンプル。キャリアが完全なく溢れないことに注意してください。（E）試料ホルダ内の試料キャリア。（F）試料は、B型キャリアで覆われている。このキャリアは、一方の平面を持ち、反対側にもその0.3ミリメートルの深さである。ここで平坦な表面を試料挟むように使用されます。（G）のサンプルホルダーを閉じて、HPF機に挿入するための準備ができました。（H）試料ホルダーは、凍結のために挿入されるHPF機器の前面にあるオリフィスHPF機に投入。（I）の温度と圧力プローブ/ホルダー。（J）QFS実行の典型的な温度曲線（EasyLogソフトウェアを使用して収集されたデータ）。温度が毎秒記録した。ランの開始時にスパイクが使用されるプローブの電子機器によるもので、実際の温度測定値を反映していない。

図3：QFSで使用される機器 QFSは、発泡スチロールの箱またはアイスバケットなどの任意の断熱容器で実施することができる（A）を<。/ strong>は1〜2センチメートル深いドライアイスの層がここにQFS室の底、発泡スチロールの箱をカバーしています。（B）13mmの穴にヒータブロックがQFS中に家のサンプルに使用されます。デジタルデータロガーとの温度プローブは、ヒーターブロック中に配置されている。（C）サンプルはブロックに配置され、液体窒素中でヒータブロックを冷却した後、液体窒素を注ぎ出し、そしてアセンブリ全体QFSチャンバ内に配置されているドライアイス（D）試料が覆われるようにQFSチャンバはドライアイスで充填されている。ドライアイスで全体のヒーターブロックをカバーへの不利な点はありません。（E）ボックスがカバーされてからサ ​​ンプルがQFS手順全体を通して攪 ​​拌されるドラフト内でロータリーシェーカー上に移動させる。

フィギュア4：シロイヌナズナはHPF-QFSして調製葉ツァイス天秤座200 HT FE MCにTEMによってHPF-QFSにより調製し、画像化された試料について得られた結果を、（A）細胞壁を持つ葉緑体（CH）を示す媒質高倍率画像と隣接する細胞の細胞質。液胞（V）は、電子高密度材料を含んでいる。 =0.5μmのスケールバー。（B）の葉緑体の高倍率画像。スケールバー= 100nmである。（C）は 、隣接するセル間のセル壁の高倍率画像。分岐した原形質連絡が見える（矢印）である。液胞によって細胞壁に押し付け、滑らかな細胞質膜に注意してください。細胞質は密にリボソームが満載されています。 Vは液胞である。液胞膜は、滑らかで連続的である。スケールバー= 200nmである。（D）氷のダメージ（アスタリスク）の領域に近い葉緑体（CH）での良好な固定の領域を示す低倍率画像。スケールバー= 0.5程度である。（E）細胞WALの高倍率ビューlおよび微小管。葉緑体（CH）とミトコンドリア（M）の良好な保存を示すスケールバー= 100nmである。（F）画像。大きな黒い沈殿物をクエン酸鉛で切片を染色からのものである。スケールバー=1μmである。ゴルジ（GA）の（G）高倍率ビュー。スケールバー= 200nmである。（H）が不十分な葉緑体および原形質分離（黒矢印）のディテールの欠如を示すサンプルを保存した。スケールバー=1μmである。

著者らは開示するものは何もない。