高品質の透過型電子顕微鏡画像を取得することは、特に植物細胞の場合、水で満たされた大きな液胞と曝気された空間が豊富にあるため、困難です。タンデム高圧凍結と急速凍結置換により、TEM用の植物試料の調製時間が大幅に短縮され、超微細構造保存性に優れた試料が得られます。
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この記事について
サマリー
要約
1940透過型電子顕微鏡（TEM）ので、生物学的材料の超高分解能画像で生物を提供している。しかし、理由もアーチファクトのない試料の調製の経験を求めて、面倒で時間がかかるのプロトコルにより、TEMはユーザーフレンドリーな技術とはみなされません。 TEMのための伝統的なサンプル調製は、細胞構造を維持するために化学固定剤を使用した。高圧凍結することにより細胞の超微細構造の完全性に有害な氷の形成を制限し、非常に速い冷却速度を生成するために、高圧下での生体サンプルの低温固定である。高圧凍結し、凍結置換は、現在TEM用樹脂切片における最高品質のモフォロジーを製造するための最適な方法である。これらのメソッドは、通常、薄い切片のTEMのための従来の処理に関連する成果物を最小限に抑えます。低温固定した後、サンプル中の凍結された水が液体で置き換えられる低温での有機溶媒は、プロセスは、凍結置換と呼ばれる。凍結置換は、典型的には、専用の高価な設備で数日間にわたって行われる。最近の技術革新ではなく通常の2日間で、プロセスは3時間で完了することを可能にする。これは、典型的には、浸潤およびセクショニングの前にエポキシ樹脂中に包埋を含む試料調製のいくつかのより多くの日が続く。ここでは、植物試料の固定は時間内で達成されることを可能にする、高圧凍結急速凍結置換を組み合わせたプロトコルを提示する。プロトコルは、容易に他の組織または生物を操作するために適合させることができる。植物組織が原因曝気スペースと水の氷のない凍結を妨げる水で満たされた空胞の存在のために、特別な関心事である。また、化学的固定化のプロセスは、組織内の深いへの化学物質の浸透を妨げ、細胞壁のために、植物では特に長いです。植物組織は、したがって粒子フィルタであるularly挑戦が、このプロトコルは、信頼性があり、最高品質のサンプルを生成する。
概要
細胞の超微細構造の私たちの知識は、数ナノメートル1の範囲の内容を解決することができ、電子顕微鏡から主に来る。サンプル調製は時間がかかり、面倒なプロトコルを必要とし、開業医からいくつかの専門知識を要求するように分解能TEMで非常に強力であるにもかかわらず、ユーザーフレンドリーとはみなされません。サンプルの伝統的な固定は、樹脂中に埋め込み、次いで重金属で染色した超薄切片を作製するために切片化、脱水を含むさらなる処理の前に、アルデヒドおよび四酸化オスミウムの使用を組み合わせている。しかしながら、化学的な固定は、最終的にいくつかの細胞区画2に影響を与える膜へのタンパク質凝集及び脂質1の損失、および変更を含むアーティファクトを生成することが知られている。これらのアーティファクトは、主に、室温3、4、5で固定し、脱水の遅い速度に起因する。
高圧凍結（HPF）による低温固定は、化学固定によって引き起こされるアーティファクトのほとんどを回避できます。低温固定の原理は、7。HPFが低下し、20度の水の凝固点を低下させる氷結晶の核生成及び成長を遅くし、細胞成分を本質的に6固定されているように、生物学的サンプル中の水の粘度を増大させることであるミリ秒単位の非常に高圧（210 MPa以上2,100バール）の下で、液体窒素と....
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プロトコル
注：QFS手順は、ユーザが十分な注意と注意を必要とし、私たちは、適用上の注意と注意事項としてここにこれらの安全上の注意を強調表示します。
HPFラン用1.Preparation
- サンプル調製を開始する前に、製造業者の指示に従って、高圧冷凍庫の電源をオンにします。
注：このプロトコルで使用されるHPFユニットがWohlwendコンパクト02単位（ 図1A）で、HPFの実行前には開始することができる起動手順の1時間半に約1かかります。- Wohlwendコンパクト02高圧冷凍庫に切り替える。
- "1"から"0"メインスイッチを回すことにより、機器のスイッチを入れる。
- マシンに圧縮空気を解放します。
- マシンに液体窒素をリリースします。
- "SYSTEMドライUP」ボタンを押します。
- 30分後、「本稿では、Webを押してくださいMドライUP」ボタンを押します。
- 計器のスイッチを入れる「ON / OFF」ボタンを押します。
- 「窒素」ボタンを押します。
- 「DRIVE IN」ボタンはすでに点灯している場合でも、マシンは20分間冷却して。
- ボタン "でドライブ"が点灯。
- Wohlwendコンパクト02高圧冷凍庫に切り替える。
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結果
以下に示す結果は、HPFのためWohlwendコンパクト02（ 図1A）を使用して得られている。この装置の1つの主な利点は、試料キャリア及びその所有者の使いやすさである。他の楽器を使用する場合は、マクドナルド、2人のユーザーが、他の凍結を行い、FSへの転送が9をクリオバイアルながら試料を調製する試料調製とHPF、1を行うべきであると推奨しています。しかし、Wohlwend標本キャリアやホルダーは、独立して操作するための単一のユーザ（ 図2A、B、E、FおよびG）のために十分に簡単である。しかし一つは、いくつかの試験は、貴重なサンプルを操作する前に、HPF機器に精通するために実行する実行する必要があることに言及すべきである。経験のあるユーザーは、時間のいくつかの（10以上）のサンプルを修正することができるはずです。しかしながら、このプロトコルで提示原理は、市販のHPF機のいずれかと共に使用することができる。
たぶんHPF-QFS手順の最も重要な部分は、試料キャリア（ 図2C）
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ディスカッション
ここで紹介するプロトコルの成功は、ユーザーに大きく依存します。まず、先進的な製造は、すべての必要な材料が容易に入手でき、全体のHPF-QFSの実行を完了するのに十分な量であることを保証するために必要とされている。第二に、これにより、ユーザは、組織の天然状態への変更を最小限に抑え、試料の取り扱いを最小限にする効率的な方法でのステップ·ツーステップから移動し、すぐに働かなければならない。サンプルは凍結し、彼らは脱水前に介護が誤ってサンプルを加熱することができる任意の取り扱いを避けるようにしなければならないので、彼らは、寒さに保つことが不可欠ですしたら、例えば、代わりに予め冷却した鉗子の手袋をはめた手で扱う。スピードとプロトコルに精通した効率増加なので、実際の実行は、関心のある人のサンプルを修正しようとする前に、推奨されている。第三に、ユーザーは、FS媒体に使用される化学物質の危険性だけでなく、液体窒素やドライアイスでの作業の危険性を認識でなければなりません。ヒュームフードは、FS培地の調製のため及びQFS手順のために必要である。他のすべての手順については、手袋、白衣を含む必要な個人用保護具は、閉じたつま先の靴、ゴーグルが推奨される。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
カリフォルニア大学バークレー校の博士ケントマクドナルドの優しさと寛大さが大幅に高く評価されています。私たちは、非常に有用な提案のための匿名査読に感謝します。バーチ·スミスラボは、テネシー大学からのスタートアップ資金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Wohlwend HPF Compact 02 高圧凍結機 | Technotrade International, Inc | HPF02 | 凍結と圧力曲線を表示するオシロスコープを内蔵しています。表示にはPC(別売)が必要です 凍結パラメータの |
| DN 3 x 0.5 mm アルミニウム apecimen キャリア | Technotrade International, Inc | 290 | |
| 試料キャリア、P=1,000、DN 3 x 0.5 アルミニウム、タイプ A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| 試料キャリア、P=1,000、DN 3 x 0.5 アルミニウム、タイプ B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| ストレージデュワー 20.5 L、MVE ミレニアム 2000 XC20 | チャート | ||
| ベイカー酵母 | 古いほど良い、過剰なガス(CO2)生産を避けるために | ||
| つまようじ | |||
| 熱電対データロガー EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | 交換用バッテリーは別途購入 |
| 温度プローブ | 電子顕微鏡科学 | 34505 | |
| ヒーターブロック 12/13 mm | |||
| ロータリーシェーカー | フィッシャーサイエンティフィック | 11-402-10 | |
| リーフパンチ - ハリスユニコア 2.00 | テッドペラ株式会社 | 15076 | |
| ピンクの歯科用ワックス | 電子顕微鏡科学 | 72660 | |
| 極低温バイアル 2 ml | 電子顕微鏡科学 | 61802-02 | |
| メタノール | |||
| ブロードライヤー | |||
| ドライアイス | |||
| 液体窒素 | |||
| アセトン | |||
| 鉗子数 | ペア |
参考文献
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M.
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再版と許可
