方法論記事

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

DOI：

10.3791/51845

⸱

2014年10月9日

 ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

選択的スプライシングは、様々な生理学的および病理学的プロセスで発生する重要な細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)において重要な役割を果たします。ここでは、誘導性EMTモデルを用いて転写リプレッサーTwistを発現させることにより、EMT中の選択的スプライシングを検出する戦略について述べます。EMTは、細胞形態の変化、細胞間接合部でのE-カドヘリン局在の喪失、および上皮マーカーE-カドヘリンとγ-カテニンの喪失、間葉系マーカーN-カドヘリンとビメンチンの獲得などのEMTマーカーのスイッチ発現によって監視されます。 アイソフォーム特異的プライマーセットを使用して、関心のあるmRNAの選択的スプライシングを定量的RT-PCRで分析します。対応するタンパク質アイソフォームの産生は、イムノブロッティングアッセイによって検証されます。ここで説明するスプライスアイソフォームの検出方法は、他の生物学的プロセスにおける選択的スプライシングの研究にも適しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上皮間葉転換（EMT）は、胚発生の間に臓器の形態形成や組織リモデリングを駆動発生プログラムです。異常に活性化されると、EMTは腫瘍転移および臓器線維症1,2を推進しています。説得力のある研究はcobble-が失われ、接着結合タンパク質E-カドヘリンの発現を抑制するなどのツイスト、カタツムリ、およびZEBなどのいくつかの転写因子、によって定義されたEMT過程において転写調節の重要性を記載している上皮形態と紡錘形の間葉表現型3-8のゲインのような石。 RNAのゲノムワイド解析による最近の研究では、スプライシングパターン上皮または間葉表現型9,10のいずれかと関連している遺伝子群が存在することを明らかにした。私たちの研究室からの作業は、機能的に選択的スプライシングとEMTを接続。細胞表面接着分子CD44を研究することによって、私たちはCD44 alternことが実証されativeスプライシングは、しっかりとEMTの間に規制され、より重要なのは、因果的に切り替えることがCD44スプライスアイソフォームは11 EMTに貢献します。

ヒト多エキソン遺伝子の95％までは、あるいは12〜14にスプライシングされる選択的スプライシングは、遺伝子調節の普及と保存されたモデルを表す。単一の遺伝子から複数のタンパク質産物を生成することにより、選択的スプライシングは、ヒトゲノムの複雑さの別の層を追加すること、タンパク質の多様性のために必須の機構を構成する。このように、選択的スプライシングの調節不全は、潜在的にヒトの疾患の原因となる重大な生物学的効果につながる可能性があります。実際、疾患における異常な選択的スプライシングはスプライソソーム機構をコードする遺伝子の変異は、一般的に骨髄異形成症候群26-28に見られる最近の知見を含め、十年以上15-25文書化されています。従って、選択的にスプライシングされたiを検出するための信頼できる方法を開発するsoforms EMTを含む多様な生物学的プロセスの研究に非常に重要である。

ここでは、誘導性EMTモデルを用いて選択的スプライシングの変化を検出するためのプロトコルを提供する。 PCRプライマーを設計し、スプライスアイ​​ソフォームを検出するための方法は、EMTの間の選択的スプライシングの研究のためだけでなく、他の生物学的プロセスにおける選択的スプライシングの研究のためのみならず、適当である。 EMTの間に​​選択的スプライシングを調査することは、より良い、癌の転移を治療するための効果的な戦略の開発を促進し、EMTおよび腫瘍転移のメカニズムを理解するために不可欠である。

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プロトコル

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EMT誘導の1。細胞培養

注：EMTは、上皮細胞におけるTGFβの治療または転写因子ツイストの異所性発現、カタツムリ、またはZEB1 / 2によって誘導することができる。このプロトコルで9,11,29不死化ヒト乳房上皮細胞（HMLE /ツイスト-ER、博士Jヤン、UCSDの贈り物）でのツイスト-ER融合タンパク質の発現を介して誘導性EMTシステムについて説明する。 4 -ヒドロキシタモキシフェン（TAM）処理すると、融合タンパク質ツイスト-ERは12〜14日9,11,29フルEMT遷移に転写し、その結果を駆動するために核に移行。そのようなHMLE /カタツムリ-ER、HMLE /TGFβ、およびMCF10A /TGFβのような追加のEMT誘導系は、これまでの出版物11,30に記載されています。

  1. 5％のCO 2で37℃のインキュベーター内で無血清乳房上皮細胞成長培地（MEGM）にHMLE /ツイスト-ER細胞を維持します。継代の細胞を2〜3日毎にそれらを80％コンフルエンスに達したとき。 5〜10分間、37℃で0.15％トリプシンで細胞をインキュベートし、次いで、5％ウシ血清/ DMEMでトリプシンを不活性化する。細胞をスピンダウンし、MEGMで再懸濁します。 1〜4個の割合で新しい組織培養皿で細胞をプレート。
  2. 200μMの溶液を作製するためにエタノールにTAMに溶解する。 -20℃で、光とストアからTAMを保護します。 20 nMのTAMの最終濃度を作るために10,000希釈：使用前に、たて1でMEGM培地にTAMを追加します。
  3. EMTの誘導のために、重複して10cmの組織培養皿に1.6×10 6 HMLE /ツイスト-ER細胞をプレート。 20 nMのTAM含有MEGM培地で培養細胞。
  4. 重複して10cmディッシュにプレート1.6×10 6 HMLE /ツイスト-ER細胞と非TAM処理の対照として0.01％エタノールで細胞を処理。
  5. 二日間のインキュベーション後に、細胞の形態学的変化を記録するために10倍の倍率で光学顕微鏡下で写真を撮る。
  6. 制御の一皿から培地を吸引したりTAM処理された細胞。 RNA単離およびタンパク質分析のためのRIPAバッファー中で、残りの半分のためのRNA溶解緩衝液中にプレートの半分を廃棄することにより、冷PBSで細胞を、収穫細胞を洗浄する。
  7. 重複して10cmディッシュにおける再メッキ1.6×10 6細胞による制御またはTAM処理した皿から継代細胞。連続して20 nMのTAMや車両で細胞を処理する。
  8. 繰り返しますビヒクル処置対照細胞が敷石状の上皮形態を維持する一方で、その時点で、TAM処理されたツイスト-ER細胞は、紡錘状の間葉の形態を示し、14日目まで5回隔日〜7を繰り返します。

EMTの2キャラ

注：EMTの完了は次式で示されます。紡錘状の線維芽細胞のような外観に石畳状の上皮形態から（1）細胞の形態学的変化; （2）細胞間結合におけるE-カドヘリンの局在の喪失;損失によって定義されたEMTマーカーの（3）切り替え式上皮マーカーおよび間葉マーカーのゲイン。

細胞形態学的変化がEMT誘導の時間経過の間に10倍の倍率で光学顕微鏡によって捕捉され、細胞接合部におけるE-カドヘリンの節で説明1免疫蛍光検出は、このセクションに記載されている。 EMTマーカーの発現を免疫ブロット法によって検出される。一般的な上皮マーカーはE-カドヘリン、γ-カテニン、およびオクルディンであり、間葉マーカーは、フィブロネクチン、N-カドヘリンおよびビメンチンを含む。イムノブロット法の一般的な手順は、セクション4で説明されている。

  1. TAM処理、種子を24ウェルプレートのウェルに入れ12mmのガラスの円形カバースリップ上で1×10 5細胞の12日目に。
  2. 48播種後時間、吸引媒体及び予め温めPBSで細胞を洗浄する。
  3. 15分間予め温め、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
  4. PBSで細胞を3回洗浄する。
  5. 15のためにPBS中0.2％トリトンX-100で細胞をインキュベートRTで分。
  6. PBSで細胞を3回洗浄する。
  7. 非特異的結合をブロックするために室温で1時間、5％BSA / PBSで細胞をインキュベートする。
  8. 加湿チャンバーOの中で/ N 4℃で1％のBSA / PBSで1:50に希釈した一次抗体、E-カドヘリンと細胞をインキュベートします。注：一次抗体の希釈の範囲は1時50分〜1の間、通常は次のとおりです。200、および各抗体のための最適な希釈は、実験的に決定されるべきである。
  9. 一次抗体をデカントし、PBSで細胞を3回洗浄する。
  10. RTで1時間500希釈：1中の蛍光標識二次抗体で細胞を培養する。この段階からは、光から細胞を保護する。
  11. 二次抗体をデカントし、PBSで3回洗浄する。
  12. 10分間の0.1〜1グラム/ mlのDAPIまたはヘキストで染色細胞。
  13. PBSで細胞を3回洗浄します。
  14. マウントはマニキュアと封入剤の液滴と、シールカバースリップでカバースリップ。
  15. 細胞を観察し、取る63X蛍光顕微鏡画像。

付加的な抗体を用いた染色は、EMT表現型を確認するために行うことができる。例えば、N-カドヘリンおよびα-平滑筋アクチンは、間葉表現型29,31,32のために染色することができる。細胞骨格構造の再編成は、F-アクチン11ファロイジンで細胞を染色することによってモニターすることができる。また、細胞運動性および細胞死抵抗性についてのアッセイは、EMT 11の特性を調べるために行うことができる。

定量RT-PCRアッセイを用いて検出スプライスアイ​​ソフォームの3。

  1. プライマー設計
    注：プライマー対は、慎重に異なるスプライスアイ​​ソフォームを増幅するように設計されるべきである。エクソンは、最も一般的に観察された選択的スプライシングイベントをスキップし、プライマー設計の戦略を説明するために例として示されている。 図1Aは、可変エクソンのような第三のエクソンと4つのエクソンプレmRNAを示している。エクソンの包含3結果エクソン3のスキッピングのに対し、より長いスプライスアイ​​ソフォームの生産は、短いスプライスアイ​​ソフォームを生成します。プライマーは、エクソン3に含まれるアイソフォームおよびエクソン3スキップさアイソフォームを区別するために、およびこのmRNAの全転写産物を検出するように設計される必要がある。
    1. エクソン包含を検出するために、慎重に可変エクソン含まアイソフォームの特異的増幅を可能にする、可変エクソン3、近隣の構成的エクソン4内のリバースプライマー内部フォワードプライマーを設計します。フォワードの両方を設計し、ゲノムDNAまたはプレmRNAから増幅されたPCR産物を避けるために、同じ変数エクソン内のプライマーをリバースしないようにしてください。
    2. 特にエクソンスキッピングイベント、変数エクソン3が含まれている場合には他の方法で破壊される構成的エクソン2及びエクソン4の接合部にまたがるプライマーの設計1を増幅した。このように、構成的エクソン4内の他のプライマーを設計し、PCR産物は、可変エクソン3がexcludである場合にのみ生成されますエドと構成的エクソン2及びエクソン4は、続いて接合されている。
    3. 遺伝子の全転写物を検出するために、したがって、2つの構成のエクソン1及び2内のプライマーを設計し、PCR産物は、すべてのアイソフォームから増幅される。
    4. 必ず全てのプライマーの融解温度（Tm）が約55°C、各プライマーの長さは約18〜22ヌクレオチドであることを確認し、PCR産物のサイズは80〜150塩基対である。
  2. RNA抽出：全RNA単離キットを用いてRNAを抽出し（材料の表を参照）。
    1. 350μlのRNA溶解バッファーで細胞を回収します。
    2. 溶解物に70％エタノール350μl添加し、十分に混合します。
    3. RNA精製カラムにサンプルを転送します。
    4. 1分間のを10,000×gで遠心し、フロースルーを捨てる。
    5. RNA洗浄緩衝液IIで二度私は、RNAの洗浄緩衝液500μlで一回カラムを洗浄して。
    6. 残留するRNA洗浄バッファーを削除する2分間最高速度で遠心分離することにより、カラムからII。
    7. 新しい1.5 mlチューブにカラムを移し、カラムマトリックスの中央に50μlのヌクレアーゼフリー水を添加し、最高速度で遠心分離してRNAを溶出する。
  3. 第一鎖cDNAの合成
    1. UV吸収測定によりRNAの濃度と品質を決定します。注：良質のRNAは、約2.0の260nmで/ 280 nmの吸光度比を持つ必要があります。
    2. 20μlの最終容量中250 ngの全RNA、0.05μgのランダムヘキサマープライマー、50pmolのMgCl 2を 、10ピコモルのdNTP、2μLの5×GoScriptバッファー、及び1μlのRT酵素が含まれている逆転写酵素（RT）反応を設定します。
    3. RT酵素を不活性化するために5分間70℃でインキュベートし、1時間、42℃でRT反応を行います。
  4. リアルタイムPCR
    1. 10μlのSYBRグリーンマスターミックスで構成されて20μlの反応を設定し、0.1〜1.0μlのcDNAテンプレート、および5フォワードピコモルおよびリバースプライマー。
    2. 以下のステップを40サイクルでリアルタイムPCRを実行します。95℃の変性を10秒、10秒、58℃のアニーリング、および30秒間60℃の拡張のために。三重でPCR反応を実行します。
    3. 解離曲線を確認し、単一のピークが各プライマーセットについて観察されることを確認してください。
    4. 増幅曲線の二次導関数値を計算することによって定量化サイクル（CQ）値を得る。
    5. 「デルタデルタはCq（ΔΔCq） 'は、次式に示すような方法を使用して、非誘導サンプルと比較して、誘導されたサンプル中の標的mRNAの相対量（RQ）を算出する。参照として、そのようなGAPDHまたはTBPのようなハウスキーピング遺伝子を使用します。

figure-protocol-1
より正確にスプライスアイ​​ソフォームの相対値を算出し、tの彼は考慮されるべき複数の参照遺伝子の使用。結果は、Pfaffl ら 33,34により記載された修飾絶対値の定量法を用いて分析することができる。

タンパク質レベルでのスプライスアイ​​ソフォームの4。審査

  1. 100μlの氷冷したRIPA緩衝液中で細胞を回収します。
  2. 約10分間、氷上で溶解物を設定してください。
  3. 4°Cで10分間14,000×gで遠心分離し、上清を収集する。
  4. ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を測定する。
  5. SDSローディング緩衝液中のタンパク質試料を希釈し、10％SDS-PAGEゲル中のタンパク質の20〜40μgのを読み込む。
  6. 1.5時間20mAでSDS-PAGEゲルを実行します。
  7. 85 V.で3時間、4℃での湿式転送システムでPVDF膜へトランスファータンパク質は、標的タンパク質の分子量に応じて転送時間を調整する。
  8. RTで1時間30分間、5％無脂肪乳でブロック膜。
  9. メンブレンWIインキュベート4℃のCO / Nにおける一次抗体番目。 200〜1：5000、実験的に各抗体のための最適希釈を決定する一次抗体の希釈の範囲は、通常1との間である。このプロトコルで使用される抗体の希釈は、「特定の試薬や機器一覧表」に記載されています。
    1. スプライスアイ​​ソフォームを検出するために、特定のアイソフォームを認識する特異的抗体を使用しています。別の方法として、構成的エクソンコード領域中のエピトープを認識する抗体を使用し、それらの異なるタンパク質の大きさに基づいて、同時にスプライスアイ​​ソフォームを検出します。
    2. 同時に、EMTマーカーについて免疫ブロッティングによりEMTを監視します。間葉系マーカーとして使用するE-カドヘリン、γ-カテニン、および上皮マーカーとしてオクルディン、およびフィブロネクチン、N-カドヘリンおよびビメンチン。
  10. 5分間隔でTBS-T（50mMのトリス、150mMのNaCl、0.05％ツイーン20、pH7.4）で洗浄膜は三回。
  11. HRP結合二次蟻を有する膜をインキュベートRTで1時間10,000希釈：1 ibody。
  12. 5分間隔でTBS-Tで洗浄膜は三回。
  13. 化学発光検出システムを用いてタンパク質を可視化し、オートラジオグラフィーフィルムに膜を公開します。

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結果

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上記の手順は、EMTの間に​​選択的スプライシングを検出するための堅牢な方法を提供する。ツイストに誘導されるEMT時のCD44スプライスアイ​​ソフォームの切り替えの代表的な結果は、一例として以下に示す。

HMLE /ツイスト-ER細胞でのツイストによって誘導されるEMTは、細長い線維芽細胞表現型への上皮表現のような石畳、石からの移行（ 図2A）、上皮マーカーE-カドヘリン、γ-カテニンとオクルディンとの欠如によって特徴づけられた間葉マーカーフィブロネクチン、N-カドヘリン、およびビメンチン（ 図2B）のアップレギュレーション。さらに、EMTは、細胞-細胞間結合（ 図2C）におけるE-カドヘリンの局在の消失によって評価した。

EMT中のCD44スプライスアイ​​ソフォームの切り替え式は定量RT-PCRおよび免疫ブロッティングによって調べた。ヒトCD44遺伝子は、9変数のエクソンから構成されている。 CD44の選択的スプライ...

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ディスカッション

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ここで説明する手順は、誘導性EMTモデルにおける選択的スプライシングの検出を可能にする。このように、スプライスアイ​​ソフォーム発現の動的変化は、EMTの時間経過を通して捕捉することができる。非関連の細胞株とは異なる遺伝的背景が過度選択的スプライシングに影響を与える可能性があるため、この方法は、選択的スプライシングの比較のために異なるepithelial-または間葉表現する細胞株の使用よりも利点を有する。選択的スプライシングの変化について何らかの結論を引き出すことができる前に、しかし、EMTをうまく誘導は慎重にさまざまなEMTマーカーを使用して確認する必要があります。さらに、ここで説明するツイスト-ER誘導性EMTシステムに加えて、カタツムリ-ERまたはTGFβによって誘導されたもののような他のEMTシステムが実験結果11,30の検証のために推奨されている。

EMTの間のスプライスアイ​​ソフォームの切り替えは、RNAおよびタンパク質レベルの両方で検出することができる。スプライスイソフォーム特異的抗体は、タンパク質分析のために好ましい。アイソフォーム特異的抗...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、細胞イメージングにおける貴重な支援に対して、Wensheng Liuに感謝したいと思います。この研究は、米国国立衛生研究所(R01 CA182467)、米国がん協会(RSG-09-252-01-RMC)、Lynn Sage Foundation、およびA Sister's Hope Foundationからの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4-ヒドロキシタモキシフェングマH7904タノールに4-ヒドロキシタモキシフェンを200μMに溶かしてストック溶液を作ります。Cは光から保護します。
E.Z.N.A. Total RNA Isolation kitOmega Bio-TekR6731Total RNA Isolation kit
GoScript Reverse Transcription SystemPromegaA5001qRT-PCRアッセイ用試薬
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002qRT-PCRアッセイ用試薬
LightCycler 480 Real-Time PCR SystemRocheEquipment for qRT-PCR assay
CD44 antibodyR&D SystemsBBA101:1,000 希釈
E-カドヘリン抗体Cell Signaling Technology40651:2,500 免疫ブロッティング用希釈液; 1:50 免疫蛍光染色
用希釈液 γ;-カテニン抗体Cell Signaling Technology23091:1,000 希釈
オクルージン抗体Santa Cruz Biotechnology Inc.sc-55621:500 希釈
フィブロネクチン抗体BD Transduction Laboratories610077 1:5,000 希釈
N-カドヘリン抗体BD Transduction Laboratories6109201:2,000 希釈
ビメンチン抗体NeoMarkersMS-129-p11:500
希釈 GAPDH 抗体ミリポアコーポレーションMAB3741:10,000 希釈
アマシャム ECL ウェスタンブロッティング検出試薬GE Health Life ScienceRPN2209化学発光システム
シエ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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