方法論記事

ショックグリッドを使用することなく、マウスの運動持久力の評価：強制運動への代替

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DOI：

10.3791/51846

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2014年8月14日

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1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

この記事について

サマリー

ショックグリッドを使用せずに実験用マウスの運動持久力を評価する方法が示されています。この方法は、実験パラメータに対するストレスの交絡効果を減らすことができる人道的な改良です。

要約

実験用マウスモデルを使用して、持久運動の代謝の利点を担当する分子経路が定義され始めている。マウスにおいて、運動持久力を評価するための最も一般的な方法は、ショックグリッドを搭載した電動トレッドミル上で実行されている強制的な使用しています。ランニングを終了する動物は、電気フットショックを実現し、グリッド上に移動トレッドミルベルトに押されている。負の刺激を逃れるために、マウスは、ベルト上で実行されているに戻ります。しかし、衝撃装置の使用を回避行動と心理的ストレスは、実行中の持久力の定量だけでなく、運動後の血清ホルモンおよびサイトカインレベルの交絡測定を妨害することができます。ここでは、実証し、ショックグリッドを利用することなく、電動トレッドミル上でナイーブC57BL / 6実験用マウスでは動作して耐久性を測定するための洗練された方法を検証します。マウスをトレッドミルにpreacclimatedされる場合、それらは各覚書に固有の歩行速度で自発的に実行メール。ショックグリッドの使用は、マウスの一部に実行するための自​​主的な意欲に感度と相まって舌圧子を使用して、人間のオペレータが穏やかな励ましに置き換えられます。実行中のタイム·ツー·疲労各マウスについての定量化のための明確なエンドポイントが定義され、広がった姿勢や呼吸困難などの消耗の行動の兆候に反映されます。この方法は、実験パラメータに対するストレスの交絡効果を低下させる人道的改良したものです。

概要

肥満、インスリン耐性、および2型糖尿病は、米国および世界中の集団1-4両方の健康に深刻な影響を及ぼし相互に関連する代謝障害である。持久運動は、これらの条件の5,6を防ぐだけでなく、治療することができます。また、歩行速度や耐久性の評価は、ヒト被験者7に、虚弱、サルコペニア、ならびに慢性閉塞性肺疾患などの他の疾患の影響のための診断テストとして臨床的に利用されている。

身体組成およびインスリン感受性に対する持久運動の有益な効果の根底にある生化学的経路は、増強または運動能力8-11を縮小表示遺伝的または薬理学的に改変されたマウスを用いて、解明され始めている。しかしながら、多くのそのような研究は、8〜11を実行するためにマウスを強制的に衝撃グリッドを備えた電動トレッドミルを利用している。ランニングを終了した動物は、に押されている電気フットショックを実現し、グリッド上に移動し、トレッドミルベルト;負の刺激を逃れるために、マウスは、ベルト上で実行されているに戻ります。このような手順は、実験パラメータ12に影響を与える交絡因子として心理的ストレスおよび回避行動を導入することができる。そのような中で、ケージの車輪走行ビームブレーク装置や定量を使用して歩行活動の定量として耐久性を測定する他の方法は、概日周期の変調、不安、不注意トレーニング、または食品探索行動12-16によって混乱することもできる。また、これらの手順は、単一のハウジング、マウスに対する心理的ストレスの別のソースを必要とする。そのため、ストレスによって混乱しない運動持久力の直接測定が必要とされている。

これらの懸念を解消するために、当研究室が開発され、最大のランニング能力を評価する方法を検証し、エクイしない電動トレッドミルを使用して訓練されていない、ナイーブマウスに速度を実行して支えてきたショックグリッドpped。ショックグリッドが通常存在する走行ベルトの末尾にスペースが、、その後残りの部分にマウスのためのプラットフォームとなり、装置から取り出すまで座って実行を拒否したマウスのための場所を提供しています。マウスは、穏やかなタッピングを使用するか、マウスの一部で実行するために自主的な意欲に対する感度と相まって舌圧子、触人間の観察者によって実行するように奨励されています。この方法は、筋肉由来のサイトカインであるインターロイキン15（IL-15）、16,17の発現が異なる遺伝子的に修飾されたおよび対照C57BL / 6マウスとの間の運動持久力の違いを定量化するために使用されている。このメソッドは、ショックグリッドの使用に起因する負の強化の交絡効果を低下させる人道的改良したものです。

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プロトコル

ここで説明する手順は、VAピュージェットサウンド施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関するILARガイドに準拠していました。

1。実験の準備

  1. 血液または組織採取した場合、運動が必要である直後あらかじめ決定し、もしそうであれば、そのような手順の伝導のための運動後の間隔を決定。例としては、循環への運動誘発性ホルモンまた​​はサイトカイン放出の決定（採血が必要）、（組織収集に続いて安楽死を必要とする）目的のmRNA種の運動誘導発現の決定を含む。直後の運動血液又は組織収集が示された場合、処置室で手にこれらの手順のための材料を持っています。治験審査委員会の承認を受け、規制ガイドラインに従って行う。すべての実験は、運動後の血中又は組織コレクションVolを必要としない上;実行中の持久力の単純な比較は必要とされるすべてのことであってもよい。
  2. マウスに対する実験群と運動後の手続き上、事前に決定します（上記の説明を参照してください）​​。
  3. この手順を実行している試験中に専用の静かな部屋で頑丈なテーブルの上にトレッドミルを配置します。
  4. マウスサイズのレーンのために、プロトコルに適切な傾斜でトレッドミルを設定します。 5 Oの傾きは下り坂走行時に発生した（収縮と同時に筋肉を長くする）伸張運動による筋肉の損傷を回避するためにここで使用されます。
  5. 糞をキャッチするためにトレッドミルベルトの下に吸収パッドを配置します。

トレッドミルへのマウスの2順化

マウスの「定住」（無運動）グループが必要でないかどうかを決定し、ステップ2.1に概説されているよう実行せずにトレッドミルに定住したマウスを公開 - 2.5。 2または4つの実験群が必要であるかどうかを判断し、。 たとえば 、定住/演習（2基）、行使コントロール/行使トリートメント（2群、無定住動物）;または、定住/行使Xコントロール/トリートメント（4グループ）。 「治療」は、トランスジェニックまたはノックアウト遺伝子型、薬理処方計画、特別な食事療法、または他の実験的介入かもしれない。

  1. 2時間 - マウスは1のため、ケージの仲間で、その運搬ホームケージ内の処置室に順応できるようにします。
  2. マウスのシングルとレコードタグ番号を選択します。マウスとレコード体重を量る。
  3. モータなしトレッドミルの場所に入れてマウスを順化、約5分間オンになって。トレッドミルベルト走行せずに、電源を入れて、マウスが別の5分間の機械騒音に順応しましょう​​。
  4. この時点で、トレッドミルから、それらのケージに戻すか（注2を参照）実験計画に従って運動後の手続きを行って、（注1使用している場合）「定住」の群のマウスを削除します。

3。ラン·トゥ​​·疲労困憊テストを開始

  1. 動物がプラットフォーム上でベルトを探索していないときに順化した後、低速（10m /分）にベルトを回す。
  2. 静かにタップするか、トレッドミル、実行に滞在する消極的動物を奨励する舌圧子、1〜3回、とマウスの後半部を持ち上げます。
    注：ほとんどのマウスは容易に実行されますが、彼らは、時には短期間停止します。これが発生すると、静かにタップするか、実行中の再開を促進するために、動物の後部を持ち上げるために舌圧子を使用しています。多くの場合、マウスは、舌圧子でタッチする必要はありません。舌圧子で手に気付かそれらに向かってくると、いくつかの詳細を実行するためにマウスを引き起こす。
  3. マウスは10m /分の初期速度で走行されると、実験室でのタイマーを起動します。
  4. マウスは1メートル/分、約2分ごとの増分で、ベルトの最上部（上り坂端）にあるときにゆっくりと速度を上げます。
  5. に速度を下げてください以前の設定でマウスが繰り返し短いバーストではなく、着実なペースで実行される場合。
  6. 最大を決定する各マウスの走行速度、持続 - 速度を調整し、マウスを見て（通常14 C57BL / 6マウス17メートル/分）。この速度を記録しておきます。
    注：トレッドミル上の動物の位置をより高速に実行するために、動物の意欲に関して調査員を頭出し。マウスが遠く（上り坂）終わりにし、壁に実行しようとしている場合、それをより高速に実行する準備ができました。マウスはトレッドミルの途中で着実なペースで実行されている場合には、その最大速度であってもよいし、実行の品質に応じて、さらに調整が必要な場合があります。

4。エンドポイントおよびマウスの停止

  1. 舌圧子を使用そっと停止の動物の後半部をタップするか、持ち上げて、（3.2の注を参照）を実行しているの再開を奨励する。実行中に一時的な停電のためにタイマーを停止しないでください。
  2. 特定とremov実行を拒否した電子マウス。データシートには注意してください。あなたの実験計画に応じて、拒否したマウスは、別の日に再試験することができます
    注：一部のマウスは、完全に実行を拒否します。このようなマウスは新郎または「ペダル」、つまり、プラットフォームの上に座るとベルトに自分の前足を使用することを停止し、その後、短いバーストで実行されます。動物の下に植えられた4つのすべての足が舌圧子によってトレッドミル上に押し戻されるの保つために、これらのマウスの姿勢が、猫背である。時折マウスがときに実行して不本意舌を噛んで、舌圧子に対して攻撃的になる圧子またはエスケープする方法としてそれを登って。これは、マウスがない、または意志、実行するかどうかを試験の最初の5分以内には明らかである。分析から実行を拒否したが、「定住」マウスとしてそれらをカウントされませんマウスを外します。
  3. 疲れマウスを特定し、タイマーを停止します。
    注：枯渇は三つの連続が停止し、再拒絶によって定義されますSUME優しく励まし、プラスなどの呼吸困難や広がった姿勢などの消耗の物理的な兆候にもかかわらず、実行されている。マウスは、30〜60分以内に枯渇から回復。
  4. すべての速度で動作して費やした時間の合計を記録します。
  5. 実験計画に応じて、どちらかは、マウスがそのケージにある戻るか、そのような制度的なガイドラインに従って、血液や組織採取などの即時運動後の手続きを行っています。
  6. 前のマウスの香りがテスト以降のマウスの行動に影響を与えないように、各個別のマウスをテストした後、殺菌ウェットティッシュできれいにベルトを拭きます。
  7. 次のマウスをテストします。各マウスについて、新鮮な舌圧子を使用してください。同じケージ内に存在したマウスは、処置室への追加順化することなく、同じ日に連続してテストすることができます。

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結果

運動持久力を測定するためのこの手順では、正確性サイトカインIL-15 16,17の発現が異なり、C57BL / 6マウスの異なる系統の分子および代謝プロフィールを反映している。 IL-15（IL-15 KOマウス）の出品を欠くマウスは、かなり前に到達する実行時間を削減しながら、IL-15（IL-15 TGマウス）の出品を過剰発現するトランスジェニックマウスは著しく、同腹子対照と比較して、ラン·トゥ​​·消耗倍に増加枯渇（ 図1A）。公表された研究は、筋肉がIL-15 TGマウス16でより酸化的表現型に向かってシフトしていることを示している。逆に、IL-15 KOマウスの筋肉が少なく、酸化的表現型にシフトしている17。これらの筋肉の表現型は、ビームブレーク装置における自発的身体活動のレベルと相関し、運動持久力と自主的なラン·トゥ·疲労試験を用いて。 2つの異なるソース（社内コロニーおよび商業sから野生型対照C57BL / 6マウス upplier）著しく異なる実行時 ​​間（ 図1A）を示さない...

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ディスカッション

ここで説明ショックグリッドを使用することなく、電動トレッドミルを使用して実験用マウスにおいて自発的ランニング持久力を評価する方法である。この方法は、次に、運動持久16,17の根底にある因子の発現の相違を引き起こすサイトカインIL-15の発現が異なるC57BL / 6マウスのサブラインの違いを明らかにすることができる。の原則を踏まえて「三Rの「実験動物科学において、この方法はショックグリッド8-11を利用する強制運動プロトコルのより人間的な代替、又はリファインメントとして使用することができる。強制運動はまた、心理的ストレスおよび血清サイトカインおよびホルモンのような実行されているパラメータや運動後の測定の両方で、回避行動12の交絡効果を導入することができます。

技術の限界は、持続的な最大走行速度の決定、実行するための拒否、およびeの終点であるxhaustionは、各人間の観察者によって主観的に評価されています。装置にゆっくり順応させた場合は、最も若いマウスは、自主的に実行されます。また、マウスは、一般的に実行するために...

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開示事項

著者らは、開示することは利害関係はありません。

謝辞

退役軍人局（LSQ）からメリットレビュー＃1 BX001026でサポート、およびVAピュージェットサウンドヘルスケアシステム、高齢化の基礎生物学における優秀ワシントン大学ネイサンショックセンターのトランスジェニックリソースのコアでの資源や施設の利用（NIA＃5P30AG-013280）、ワシントン糖尿病内分泌学研究センター大学（NIH＃1 P30 DK-17047）。私たちは、シンシアPekow DVMおよびカリ·L. Koszdin DVMに感謝、バージニア州ピュージェット湾、原稿上で役に立つコメントを提供しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オープンげっ歯類トレッドミルExer-3 / 6コロンバスインスツルメンツ、コロンバスOH1050RMこのカタログ番号は、ショックグリッドのないモデル用です。ショックグリッドは、古いモデルから手動で取り外すことができます(Eco 3/6)
Sani Cloth Germicidal TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NY通常、地元の施設を通じて注文10% イソプロピルアルコールが含まれています。同等の製品であれば、任意の製品を使用できます。
舌圧子任意の地元のサプライヤー
ラボラトリータイマー任意のサプライヤー
IL-15 TGマウス*JAX、バーハーバー、ME011002マウスIL-15導入遺伝子は、分泌を促進するためにシグナル配列を変更した修飾ヒトα骨格アクチンプロモーターから発現します。
C57BL/6Jマウス(野生型)*JAX, Bar Harbor, ME000664IL-15 TG
IL-15 KOマウス用Taconic Farms, Germantown, NY4269-MC57BL/6背景上のホモ接合IL-15「ノックアウト」マウス
C57BL/6NTac (野生型)*Taconic Farms, Germantown, NYB6-MIL-15 KO用コントロールマウス
*オプション; マウスの系統と治療は実験に特有のものにすることができます議定書。
されます コントロールマウス*

参考文献

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

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