ヒト細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNAのインビトロ合成における

サマリー

このビデオの記事では、細胞におけるタンパク質発現の誘導のために修飾されたmRNA のインビトロ合成を記載する。

要約

所望の細胞におけるタンパク質合成を誘導するための合成メッセンジャーRNA（mRNA）をコードする外因性送達は、再生医療、基本的な細胞生物学、疾患の治療、および細胞の再プログラミングの分野で大きな可能性を有している。ここでは、フローサイトメトリーにより誘導されるタンパク質の発現の減少した免疫活性化の可能性と安定性の増加、産生されたmRNAの品質管理、細胞のトランスフェクションされたmRNAと、検証と修正されたmRNAの生成のためのステップバイステップのプロトコルを記述する。 eGFPのmRNAを持つ単一のトランスフェクション後3日までに、トランスフェクトHEK293細胞のeGFPを生産。このビデオの記事では、eGFPのmRNAの合成を例に挙げて説明する。しかし、この手順は、他の所望のmRNAの産生に適用することができる。 mRNAを変性合成を使用して、細胞が一過性に、彼らは通常は発現しないと所望のタンパク質を発現するように誘導することができる。

概要

細胞では、メッセンジャーRNAの転写（mRNA）のおよび所望のタンパク質へのmRNAの翻訳は以下の細胞の適切な機能を確保する。遺伝性または後天性の遺伝性疾患は、タンパク質の不十分や機能不全の合成につながり、深刻な病気を引き起こす可能性があります。したがって、存在しないか、または欠陥のあるタンパク質の産生を誘導するための新しい治療的アプローチは、所望のタンパク質をコードする細胞への合成修飾されたmRNAの外因性送達である。これにより、細胞は、それらが正常に作り出すことができない、または天然必要はありません機能性タンパク質を合成するためにトリガされます。このアプローチを用いて、遺伝的障害は、欠陥または欠落タンパク質¹をコードするmRNAを導入することによって補正することができる。 mRNAの療法は、腫瘍細胞または病原体により発現されるタンパク質抗原を、synthetizeするワクチン接種のために使用することができる。それによって、宿主免疫系を効果的に腫瘍細胞を排除またはinfeを防止するために活性化することができるctions ^2,3。また、近年では、mRNAは、正常に誘導された多能性幹細胞（iPS細胞）を作製した。この目的のために、線維芽細胞は、再プログラミングの発現が^4~6因子誘導し、再生医療において大きな可能性を有するiPS細胞でそれらを変換するためにmRNAをトランスフェクトした。

以前は、従来のmRNAの使用は、低い安定性および強力な免疫原性と関連していた。このように、従来のmRNAの臨床応用は限られていた。しかし、Karikoと同僚によるmRNA分子内の5-メチルシチジン及びシュードウリジンによるシチジンおよびウリジンの置換は、生物学的液体中の安定したmRNA分子をレンダリングし、劇的に今修正されたmRNAの臨床適用性を可能にする免疫活性化^7-10、減少した。

合成的に生成された変更されたmRNAを用いて、所望の遺伝子の転写物は、一時的に、生体内 ¹¹ で送達することができるまたはインビトロでタンパク質発現を誘導した。導入されたmRNAは細胞翻訳機構によって、生理的条件下で翻訳される。によるウイルス遺伝子治療ベクターと比較して、宿主細胞ゲノムへの組込みの欠如のために、腫瘍形成のリスクが^12,13を防止することができる。このようにして、変性合成mRNAを用いた治療は、将来の良好な臨床受け入れを取得します。

ここでは、変更されたmRNA（ 図1）、mRNAおよびトランスフェクトされた細胞におけるタンパク質発現の評価を用いた細胞のトランスフェクションを製造するための詳細なプロトコールを記載する。

プロトコル

必須のDNAコード配列を含むプラスミドの1増強（CDS）

1. 前加温室温への変換キットに含まれているSOC培地中、37℃で、100μg/ mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート。 42℃に水浴を平衡化する。
2. 化学的に部品Eの1バイアルを解凍氷上で大腸菌 。
3. 化学的に部品Eのバイアルに、CDSを含むプラスミドの1-5液（100 ngのには10pg）を追加大腸菌とは穏やかに混合。ピペッティングにより細胞を混在させないでください。プラスミドを追加した後、静かにチューブをタップして混ぜる。
4. 氷上で30分間混合物をインキュベートする。
5. 熱ショックE.振盪せずに水浴中で42℃で30秒間大腸菌 。
6. 2分間氷上にバイアルを置きます。
7. Eに予め温めSOC培地250μlを添加するcoliおよび細菌インキュベーター中で37℃で1時間、300rpmで水平に細菌を振る。
8. 、予め温めたLB寒天プレート上に形質転換混合物からの100μlの150μLを広げ、プレートを反転させ、37℃で一晩インキュベートする。
9. コロニーが見えるようにした後、100μg/ mlのアンピシリンを含む5mlのLB培地を含む15ml容の培養チューブに各プレートからの単一コロニーを接種する。文化が遅れてログまたは定常期になるまで、300 rpmで振盪しながら37℃で一晩、それらをインキュベートする。
10. 形質転換されたE.の長期保存のためにコリ、ピペットクライオバイアルへの100％のグリセロール75μlの。細菌培養（冷凍ストックは25％グリセロールを含有するであろう）の225μl加え、よく混ぜ、-80℃で凍結バイアルを格納します。
11. 製造元の説明書に従って、プラスミド精製キットを使用して必要なCDSを含むプラスミドを単離する。
12. 分光光度計を用いてプラスミド濃度を決定する。
13. 20μlの一定分量を準備し、長時間-20℃で保管してください。

_title "> 2。プラスミドインサートの増幅およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、ポリTテールを追加する

1. NOTE：in vitro転写 （IVT）用のDNA鋳型を得るために、関心のCDSは、ここでeGFPを、PCRを用いて増幅される。同時に、120チミジン（T）のポリTテールはT ₁₂₀拡張子を持つリバースプライマーを用いてインサートに加えられる。これにより、生成されたmRNAは、IVTの後に定義された長さを持つポリAテールを得る。
2. 表1に詳述するようにPCR混合物を準備します。
3. 徹底的に反応ミックスを混ぜる。注：PCR産物が4-5 IVT反応に使用することができる。 IVTのためのDNAテンプレートの量を増加させるために、PCR混合物の全体積を増加させることができる。いくつかのPCRチューブはそれぞれ含む100μlのPCR混合物をPCR産物の十分な収量を得るために使用することができる。
4. サーモPCRチューブを配置し、PCRサイクリング·プロトコル（ 表2）を用いたPCRを実行します。
5. Pは、クリ​​ーンアップCR反応は、製造業者の説明書に従ってPCR精製キットを使用し、20μlのヌクレアーゼフリー水を用いてDNAを溶出する。
6. 分光光度計を用いてDNAの濃度を測定する。注記：検出されたDNAの濃度は、約300μgの/ mlである。このように、予想される合計金額は、〜6μgのでなければなりません。他のタンパク質のためのDNAの量は、CDS、PCR、プライマーのアニーリング温度のために使用されるプラスミドの量は、サイクル数の長さに応じて異なり得る。
7. 長い間、-20℃でDNAを凍結またはIVTのためにそれを直接使用しています。

3.コントロールステップ：PCR産物の品質

1. DNAゲル電気泳動によってPCR産物の品質を確認する。
2. フラスコ内の1x TBEアガロース所望の量を混ぜる。 1％アガロースゲルは、1×TBE 50mlにアガロースを0.5g加える。
3. アガロースまでマイクロ波が溶解する。それは沸騰させないでください。アガロースが完全に溶液中にあることを確認してください。
4. 50ミリリットルのアガロースゲルに5μlの核酸ゲル染色を追加します。
5. アガロースゲルボックスにゲルを注ぎ、コームを設定し、ゲルが固化するまで約1時間待ち。
6. コー​​ムを取り外し、ゲルトレイにゲルボックスを配置します。
7. 12μlの総容量2μlの6Xローディングバッファーと80-10,000 bpのDNA-ラダー2μlの（200 ng）をPCR産物200ngの各を混ぜる。
8. 慎重にアガロースゲルのウェルにDNAサンプルをロードします。
9. ランニングバッファーとして1×TBEを使用して、1時間、100Vでアガロースゲルを実行します。
10. 画像化システム（ 図2）上のDNAのバンドを可視化。

4. in vitro転写 （IVT）

1. 注：PCRの後、プラスミドインサートを増幅されたポリTテールが付加される。 IVTの間に、遺伝情報はDNAからRNAに転写される。生成されたmRNA転写物は、細胞内でタンパク質を産生するために使用される。
2. アーゼdで作業領域とピペットをきれいにecontaminationソリューション。使用のRNaseと混合反応の汚染を最小限に抑えるために手袋を変更し、PCRクリーンで滅菌デュアルフィルターピペットチップと頻繁に。
3. 表3に記載したように、NTP /キャップアナログ混合物を準備します。
4. ボルテックスで徹底的にNTP /キャップアナログの混合物を混合し、手短にスピンダウン。
5. 表4に記載するようにIVT反応混合物を組み立てる。
6. 優しくピペッティングにより完全にIVT反応混合物を混ぜる。次に、チューブの底に混合物を収集するために簡単にPCRチューブを遠心する。
7. サーモで3時間、37℃でインキュベートする。
   注：最適なインキュベーション時間は、指定されたテンプレートの挿入や転写効率の長さに依存する。短いインサート（<500塩基）については、より長いインキュベーション時間は、有利であり得る。時間経過実験は、最大収率のための最適なインキュベーション時間を決定するために行うことができる。したがって、examplため、IVT反応をセットアップする電子、1、2、3、4、6時間、および一晩のインキュベーションのためにおよびmRNAの量を決定する。 eGFPのmRNAの生成のためのインビトロ転写の動態は、 図3に示されている。
8. 、テンプレートDNAを除去IVT反応混合物にDNアーゼを1μl（2U /μl）を追加するには、よく混ぜ、37℃で15分間インキュベートする。
9. manufacturer's指示に従ってRNA精製キットを用いて反応混合物を精製する。 40μlのヌクレアーゼフリー水で二回スピンカラム膜から修正されたmRNAを溶出する。注記：検出RNA濃度は約1,500μg/ mlのである。このように、予想される総量は〜120μgのでなければなりません。他のタンパク質のために合成されたmRNAの量は、CDSの長さとIVTに使用されるPCR産物の量に応じて異なることができる。

南極ホスファターゼで精製mRNAの5。治療

1. 注：生成されたmRNAは、5 'トリ除去するホスファターゼで処理さ免疫活性化にRIG-Iによって認識され、リードすることができるリン酸塩、。さらに、ホスファターゼ処理は、セルフライゲーション反応で再環状化を防止する。
2. 精製mRNA溶液を79μlに10倍南極ホスファターゼ反応バッファーの9を添加する。その後、南極ホスファターゼ（5U /μl）を2μlのを追加して、静かにサンプルを混ぜる。 30分間37℃で反応混合物をインキュベートする。
3. manufacturer's指示に従ってRNA精製キットを用いて反応混合物を精製する。 50μlのヌクレアーゼフリー水で二回スピンカラム膜から修正されたmRNAを溶出する。
4. 分光光度計を使用して修正するmRNAの濃度を測定する。チェックを260nm / 280nmでの吸光度の比_{（280分の260）が} ≥1.8と₂₆₀の比率/ _230は純度を示し、これ2.0であること。
   注：予想される総収量はsufficie約90μgの、あるべきNT約36 mRNAのトランスフェクションのために。
5. ヌクレアーゼフリー水を添加して100 ng /μLでのmRNAの濃度を調整します。
6. -80℃でのトランスフェクションや店舗に必要な使い捨てのアリコートに変更されたmRNAを分注し。複数の凍結融解サイクルを避ける。適切に準備し、mRNAは、長年にわたって安定して保存され。作業中は、常に氷上に変更されたmRNAを保つ。

6.コントロールステップ：合成修正mRNAの品質

1. RNAゲル電気泳動によって変更されたmRNAの品質を確認してください。
2. フラスコ内の1x TBEアガロース所望の量を混ぜる。 1％アガロースゲルは、1×TBE 50mlにアガロースを0.5g加える。
3. アガロースまでマイクロ波が溶解する。それは沸騰させないでください。アガロースが完全に溶液中にあることを確認してください。
4. 50ミリリットルのアガロースゲルに5μlの核酸ゲル染色を追加します。
5. アガロースゲルボックスにゲルを注ぎ、コームを設定し、ゲルがソリになるまで約1時間を待つdified。
6. コー​​ムを取り外し、ゲルトレイにゲルボックスを配置します。
7. 0.5〜10キロバイトセンスRNAラダーと10μlの総体積で7μlのローディングバッファーを用いて合成されたmRNA修正200ngの各3μlの（3μgの）を混ぜる。ローディング緩衝液の組成を表5に記載されている。
8. 70℃で10分間ラダーおよびmRNA試料を変性。
9. 丁寧に1％アガロースゲル上でラダーとmRNAサンプルをロードします。
10. ランニングバッファーとして1×TBEを使用して1時間、100Vで電気泳動を行います。
11. ゲルドキュメンテーションシステム（ 図4）を使用して、UVトランスイルミネーターと写真にはしごやmRNAのバンドを可視化。

7.トランスフェクションのための細胞の準備

1. 12ウェルプレートのウェル当たりプレート2×10 ⁵細胞（HEK293細胞）。
2. 細胞インキュベーター中で37℃で一晩細胞をインキュベートする。注：トランスフェクションの日に、細胞は、REACを持つべき80〜90％のコンフルエンスにHED。

細胞のmRNAのトランスフェクションの実行8.

1. 修正されたmRNAを解凍する。
2. トランスフェクションのためのリポプレックスを生成します。
3. 修正されたmRNAの25μlの（2.5μgの）を追加し、473μlののOpti-MEM（最小必須培地）へのカチオン性脂質トランスフェクション試薬2μlの私は12ウェルプレートの1ウェルのトランスフェクションのために、トランスフェクション混合物を生成するために、血清培地を減少させた。トランスフェクトされる井戸の数に応じてボリュームをスケールアップ。陰性対照として、mRNAをすることなく、トランスフェクション混合物を準備します。
4. ピペッティングにより穏やかに成分を混合。トランスフェクションのためのリポプレックスを生成するために20分間室温でトランスフェクション混合物をインキュベートする。
   注：トランスフェクション混合物には抗生物質が含まれていません。このように、細胞の処理中に無菌性を確保するために注意してください。
5. /ウェル500μlのDPBSで細胞を洗浄する。
6. 12ウェルPLAの1つのウェルに500μlのトランスフェクション混合物を追加します。TE。
7. 37℃で4時間、細胞をインキュベートし、5％CO _2。
8. トランスフェクション混合物を吸引し、細胞を1ミリリットルの完全な細胞培養培地を加える。
9. 細胞インキュベーター中で24時間細胞をインキュベートする。
10. 蛍光顕微鏡を実行すると、蛍光顕微鏡（ 図5）を使用して分析します。注：eGFPの他のmRNAは、mRNAをコードするトランスフェクションによって産生される細胞中の他のタンパク質の発現を調べるために、細胞をカバーガラス上で培養することができる。次いで、トランスフェクションを行うことができ、細胞を適切な抗体で染色し、蛍光顕微鏡によって分析することができる。

細胞におけるEGFP発現9.フローサイトメトリー解析

1. 井戸からの細胞培養培地を除去し、1mlのDPBS（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で各ウェルを洗う。細胞培養プレートの表面から細胞を剥離するために、ウェル当たり500μlのトリプシン/ EDTAを追加します。その後、500を追加トリプシンを不活性化するウェルあたりμlのTNS。
2. 室温で300×gで5分間分離した細胞を遠心します。唯一のペレットを残して上清を取り除きます。 150μlの細胞固定液中に細胞ペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーチューブに細胞懸濁液を移す。
3. eGFPを発現する細胞の割合およびジオ平均（蛍光強度の幾何平均）（ 図6）を用いて蛍光強度を分析する。

タンパク質発現の10測定時間オーバー

1. 更に、ステップ8で説明したように、12ウェルプレートの3ウェル中の細胞のmRNAのトランスフェクションを行うのmRNAを添加せずに、トランスフェクション混合物を有するHEK293細胞の3つのウェルをインキュベートする。
2. eGFPの1,2の発現を測定し、トランスフェクションの3日後、タンパク質発現（ 図7）の持続時間を評価する。

結果

eGFPのCDSを含むのpcDNA 3.3プラスミドを用いて、修正されたeGFPのmRNAの合成（ 図1）が設立された。 PCRによるインサートの増幅およびポリT-テーリングの後、約1100塩基対の長さの明確なバンド（ 図2）が検出される。 IVT時間を増加させると、mRNAの収率（ 図3）を増補。 IVTの後、約1100塩基対の長さを有する透明なmRNAのバンドが製造されるのeGFP mRNAの長さ（ 図4）に対応する検出された。

生成されたeGFP mRNAの機能は、HEK293細胞のトランスフェクションによって試験した。この目的のために、トランスフェクション複合体（リポプレックス）は、カチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用して生成された。トランスフェクションは、12ウェルプレートのウェルあたり2×10 ^5個の細胞を用いて行った。細胞におけるeGFPの製造はFigu（蛍光顕微鏡を用...

ディスカッション

mRNAの治療は、再生医療の分野では、疾患及びワクチン接種の治療において大きな可能性を有している。このビデオでは、細胞におけるタンパク質発現の誘導のための安定化された、修飾されたmRNAの産生を実証する。このプロトコルを使用して、他の所望のmRNAを生成することができる。修飾されたmRNAのインビトロ合成は、所望のmRNAの細胞のトランスフェクションは、標的タンパク質の発現を誘導することができる。外的にデリバリーmRNAが完全に分解されるまで、それによって、所望のタンパク質は、生理的条件下で一過的に発現されている。

このビデオでは、eGFPの発現は、eGFPのmRNAとHEK293細胞の単一トランスフェクション後3日間、示された。他のタンパク質をコードするmRNA分子は、短いタンパク質発現期間につながる可能性がある。タンパク質の発現は、外因的に送達されたmRNAの分解を減少させる。 SOMのためのこの技術のため、制限電子メールアプリケーションは、タンパク質発現の一過性誘導かもしれない。したがって、より長い期間、細胞中のタンパク質発現を維持するために、mRNAの再...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養
DMEM、高グルコース	PAA	E15-009
FBS	Life Technologies	10500
ニシリン/ストレプトマイシン	PAA	P11-010	100x
L-グルタミン	PAA	M11-004	200 mM
DPBS	PAA	E15-002
0.04% トリプシン / 0.03% EDTA	プロモセル	C-41020
TNS	プロモセル	C-41120	トリプシン中和液、0.1%BSA HEK-293細胞中の0.05%トリプシン阻害剤
	ATCC	CRL-1573
Consumables
Tissue culture plates, 12-well	Corning	3512
細胞培養フラスコ (75 cm2)	Corning	430641
DNaseおよびRNaseフリー1.5 ml滅菌微量遠心チューブ	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml コニカルチューブ	greiner bio-one	188271
PCR クリーンで滅菌済みの epT.I.P.S. デュアルフィルター ピペット チップ	エッペンドルフ	10 & マイクロ;L:022491202;100 & マイクロ;L:022491237;1,000 & マイクロ;l:022491253
Cryovial	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
細菌培養用14mlポリプロピレン丸底チューブ	BDファルコン	352059
プラスミド増幅および精製
pcDNA 3.3_eGFPプラスミド	Addgene	26822
ワンショット Top10 化学成分 大腸菌	Invitrogen	C4040-10
滅菌水 (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB medium (Luria/Miller)	Carl Roth	X968.1	25 g L-1 滅菌水に溶解します。
LB寒天培地(Luria/Miller)	Carl Roth	X969.1	L-1 40 g 滅菌水に溶解します。
アンピシリン レディメイド ソリューション	シグマ アルドリッチ	A5354	100 mg/ml
グリセロール	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
mRNA production
HotStar HiFidelity ポリメラーゼキット	Qiagen	202602
QIAquick PCR精製キット	Qiagen	28106
MEGAscript T7 キット	ライフテクノロジー	AM1334
5-メチルシチジン-5´-triphosphate	Trilink	N1014	5-Methyl-CTP
シュードウリジン-5´-triphosphate	Trilink	N1019	擬似UTP
3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNAキャップ構造アナログ	ニューイングランドバイオラボ	S1411L
リボロックRNase阻害剤	モサイエンティフィック	EO0381	40 U/µl
ターボDNase	Life Technologies	AM1334	2 U/µl (MEGAscript T7 Kitより)
南極ホスファターゼ	ニューイングランドバイオラボ	MO289S
RNeasyミニキット	Qiagen	74104
RNaseZap ソリューション	ライフテクノロジー	AM9780
Transfection
>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668-019	カチオン性脂質トランスフェクション試薬
Opti-MEM I 還元型血清培地	Invitrogen	11058-021	改良型ミニマルエッセンシャルメディウム(MEM)により、ウシ胎児血清(FBS)の補充を減らすことができます
Gel electrophoresis
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
ゲル化核酸ゲル染色	Biotium	41003	10,000x in water
peqGOLDシリーズミックス DNA-ラダー	Peqlab	25-2210
Flow cytometry analyses
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x concentrate
インサート増幅およびポリ(T)テールPCR用プライマー
Forward Primer(HPLCグレード)10 µM	エラ バイオテック		5´-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3´
リバースプライマー(HPLCグレード)10 µM	エラ バイオテック		5´- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3´
Equipment
Cellインキュベータ	バインダーCO		2(5%)およびO2(20%)
CASYセルカウンター	Schärfeシステム
滅菌ワークベンチ	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
バクテリアインキュベーター	Incutec
ウォーターバス
ScanDrop分光光度計	分析用イエナ
PCRサーモサイクラー	エッペンドルフ
微量遠心機	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixer	Eppendorf
電気泳動用ゲル装置	バイオ・ラッド
Gel ドキュメンテーションシステム	バイオ・ラッド
FACScan システム	BD Biosciences
蛍光顕微鏡	ニコン
位相差顕微鏡	ツァイス