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方法論記事

マウスにおける全身および肝血行動態パラメータの監視

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DOI：

10.3791/51955

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2014年10月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Institute of Pathology, Jena University Hospital, 3Reproductive Medicine Center, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

この記事について

サマリー

このフィルムは、マウスにおける全身および肝臓の血行動態を取得する方法を示します。全体の監視は重要なパラメータは、全身血圧、中心静脈圧、総肝動脈流量、および門脈の圧力、ならびにマウスにおけるポータル流量の取得を含む。

要約

実験的研究のマウスモデルを使用することは肝生理学および病態生理学的障害の研究のために莫大な重要なものである。しかし、マウスの小さなサイズのために、マウスに適した術中監視手順の技術的な詳細はほとんど記載されなかった。以前私達はラットの血行動態パラメータを取得するために監視手順を報告している。今、私たちは、ラットより10倍小さい種を、マウスにおける全身および肝臓の血行動態パラメータを取得するための手順を適合される。この映画は、動物の計装だけでなく、マウスでの全身および肝臓の血行動態を評価するために必要なデータ取得処理を示しています。体温、呼吸数および心拍数などのバイタルパラメータは、手順全体を通して記録した。全身の血行動態パラメータは、頸動脈圧（CAP）および中心静脈圧（CVP）で構成されています。肝灌流パラメータは、ポータルのVを含むアイン圧力（PVP）、ポータル流量ならびに肝動脈（表1）の流量。正常値を記録する計測機器とデータ取得は、1.5時間以内に完了した。全身および肝臓の血行動態パラメータは、この手順の間、正常範囲内であった。

この手順では、困難なく実現可能である。我々はすでにだけでなく、70％部分肝切除中および肝葉クランプ実験で、正常なマウスでは肝血行動態を評価するために、この手順を適用している。切除回（n = 20）、切除（6.87±2.39 CMH 2 O）前よりも有意に高かったCMH 2 O（P <0.05）11.41±2.94であった後にPVPを意味する。肝葉クランプ実験の結果は、この監視手順は、機密と門脈圧とポータル流量の小さな変化を検出するのに適していることが示された。結論として、この手順は、経験豊富なマイクロ外科医の手の中に信頼性があるが、EXPに制限する必要がありますマウスは絶対的に必要とされているeriments。

概要

このビデオの全体的な目標は、全身および肝臓の血行動態パラメータを取得するためのリアルタイム監視手順を実証することであった。この手順を開発するための理論的根拠は、全身および肝臓の血行動態パラメータを取得する必要とするマウスでの実験的介入のための大きな価値である。手順は、ナイーブ動物に、そのような部分肝切除などの与えられた肝胆実験的外科的介入、門脈結紮と肝移植の間または後に適用することができる。

げっ歯類における肝血行動態データの取得は、提案された侵襲的な処置を必要とします。肝灌流は非侵襲的に得ることができない。しかし、全身血圧を取得するための選択肢がある。このような尾カフ技法8として監視技術は、ラットとマウスの両方で血圧を取得するために利用されている。尾カフ技術はconsciで適用することができるOUの動物。血圧を測定する場合、動物は特定の不快な位置に配置して固定する必要がある。テールカフデバイスのマニュアルでは、製造業者は、マウスが神経質になって、尾部に循環を減少させる可能性があると強調してもよいと述べている。そのような状況下では、尾部で取得された末梢血圧は、中心血圧よりもはるかに低くてもよい。

完全な監視手順は、データ取得のための一連のセンサを使用して統合されたマルチチャネルモニタを用いて行った。血圧は、顕微鏡下で注意深く顕微解剖し、露光後のそれぞれの血管にカテーテルを挿入した。流量は、各容器の周囲に遷音速流プローブを配置することによって測定した。

すでにSINGLに匹敵する生理学的な血行動態データを総合的に直列に生じたラットでは、同様の術中監視手順を報告した他のグループ7から通知の電子データ。そこで私たちは、マウス、ラットよりも小さい10倍種にそれを適応させるための良い基盤を表現するには、次の手順を検討した。ラットの手順との重要な違いは、血圧データの代わりに、流体ベースのカテーテルシステムを取得するためのMillarカテーテルの使用である。フローデータは、遷音速流プローブを、対応するラットの血管よりもわずかはるかに小さいものと取得した。

による動物の小さなサイズのために、マウスの計測は、技術的に難しいが、実行可能である。インスツルメンテーションが完了すると、事前定義された設定ファイルを使用することができるので、データ取得および一次寿命データ解析は、簡単である。設定ファイルは、一連の実験の初めに一度定義されると、すべてのその後の実験のために保存して使用することができる有する。

今まで私たちは、急性実験で肝血行動態の影響を評価するには、この手順を適用した。私たちは、CAを測定し前と直後に70％部分肝切除（PH）後、および/デクランプ実験をクランプ中のPとPVP。私たちは、肝臓質量の完全90％に相当質量中央の短い（5分）、クランプと左側葉に続く肝臓の20％を代表する右葉の肝十二指腸靭帯をクランプ。デクランは中央値と左側葉を解放に続いて右葉からクランプを解除する作業を始めています。最大クランプ時間は10分未満であった。

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プロトコル

住宅·実施し、すべての手順は、ドイツの動物保護法制に従った。

1。センサーキャリブレーション（校正用センサメーカーの指示に従ってください）

1.1）ミラーカテーテル校正。 30分前にバランスをとる（ゼロ）とキャリブレーション用滅菌水または生理食塩水でカテーテルの先端を事前に浸します。

  1. ブリッジ·アンプのmillar1チャンネルにミラーセンサーを接続し、水柱にミラーセンサーチップを挿入します。
  2. 0 CMH 2 Oに水柱値を設定データ解析ソフトウェアのウィンドウでは、ブリッジは、それを増幅し、ゼロを選択します。ベースライン値0 CMH 2 Oを設定することができる。
  3. 20 CMH 2 Oに水柱値を設定データ解析ソフトウェアのウィンドウの進捗を実行し、停止します。増幅するブリッジの窓に「単位」を選択し、それに応じて0〜20 ​​CMH 2 Oのベースラインを設定。 2 O
  4. 同じように、CAPを測定するためのmillar2のキャリブレーション（2ベースライン90,110 CMH 2 Oを設定します）。

1.2）血流プローブ較正

  1. 脱イオン水にプローブを入れてください。遷音速流量プローブシステムとプローブを接続します。
  2. データ解析ソフトウェア]ウィンドウで、フロープローブをゼロに増幅する入力を選択します。単位を調整します。
  3. 信号を収集するために「テストチャンネル」のボタンを押します。信号が3-4の棒を持っている場合は、信号が良好であることを意味します。良好な信号が取得された場合には、手順を継続することができる。
  4. 値がキャリブレーションされているか否かを見るために「ゼロチャンネル」にあるボタンとスケールチャネルを押します。
  5. 後で測定のための「測定チャネル」のボタンを押します。

2外科的処置のためのマウスを準備

  1. 誘導チャンバ内にマウスを置き、2％イソフルランでマウスを麻酔し、0.3ml /分の酸素。マウスの足指ピンチ引っ込め反射が存在しない場合に動作を行うことができる。
  2. 左首と腹部を含む外科領域の毛皮を剃る。
  3. 動作テーブルの上でマウスを置き、テープを使用して固定します。動作期間中の乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
  4. 首のオペレーションフィールドの最適な露光のために首の下にガーゼクッションを配置します。
  5. 演算フィールドを消毒し、唯一のオープン手術野を残して、マウスをカバーするために滅菌ガーゼを置きます。

3バイタルパラメータ測定

  1. マウスの足に皮下心電図の針を挿入します。
  2. マウスの背中の下で呼吸センサーを配置します。
  3. マウスの直腸内に温度プローブを配置します。
  4. レコード温度、ECGおよびデータ解析ソフトウェアでのマウスの呼吸数。

Sに対する4。ネック運用ystemic心臓血管モニタリング

4.1）船舶郭清

  1. 首の真ん中のライン、鎖骨の中間点、下顎の角度を特定します。
  2. 中央の線の左側に0.5センチメートルで鎖骨の中間点に、下顎の角度から2センチメートル縦切開を加えます。
  3. 顎下腺を解剖、それを裏返しし、生理食塩水に浸したガーゼでそれをカバーしています。
  4. 頸静脈を特定し、それを分析し、それ以降の連結および固定のために静脈の下で3 6-0絹縫合糸を配置します。
  5. 二腹筋の肩甲舌骨と後の腹の優れた腹から分離、胸鎖乳突筋を特定し、頸動脈を簡単に露出するためのリトラクターでそれを引き出します。
  6. 頸動脈を解剖し、後で連結および固定のために動脈の下に3 6-0絹縫合糸を配置します。

4.2）頸動脈の血流測定

  1. 遷音速を配置、頸動脈を中心に探る安定し、それを維持し、超音波ゲルまた​​は生理食塩水を使用して連絡先を最適化します。
  2. データ分析ソフトウェアを用いて遷音速装置の小さな画面上に示されるように、頸動脈のレコード血流速度
  3. 測定が完了した後にプローブを削除

4.3）頸動脈動脈圧測定（CAP）

  1. 頸動脈の遠位端部を連結し、その近位端部をクランプする。
  2. 頸動脈の周囲2の固定縫合糸を配置します。滞在縫合のために10-0プロレンを使用してください。
  3. 血管の前壁に小切開を加えます。
  4. ミラーカテーテルを挿入し、事前に配置された縫合糸で固定します。
  5. データ解析ソフトウェアで、CAPを記録します。

4.4）頚静脈血流測定を

  1. 頸静脈を持ち上げ、流量を測定するために、遷音速流量プローブを配置します。
  2. データ分析ソフトウェア内の流量を記録する。

4.5）中心静脈圧測定（CVP）

  1. 頸静脈の近位端をクランプと遠位端とを連結する。
  2. 血管の前壁にmicroscissorsを使って小さな切開をカット。
  3. 液体で満たされたカテーテルを挿入し、前に置か縫合線で固定します。
  4. データ解析ソフトウェアでCVPを記録します。

肝血行動態の取得のために5。開腹手術

5.1）船舶識別

  1. 腹部に横切開を加えます。
  2. 左側に腸をEventerateとウェットガーゼでカバーしています。
  3. 下大静脈、門脈、肝動脈と固有肝動脈を識別します。
  4. 全体監視手順の間、5分毎に腹部や腸の表面にいくつかの温かい生理食塩水をドロップします。

5.2）門脈血流量の測定を

  1. 門脈を解剖。
  2. フロープローブを配置するとき、容器の持ち上げを容易にするために、門脈の下に6-0絹を置きます。
  3. 門脈の周り遷音速流量プローブを配置し、その血流量を測定します。
  4. 門脈の血流量を記録します。

一般的な肝動脈の流れの5.3）測定

  1. 慎重に総肝動脈を解剖。
  2. 容器の持ち上げを容易にするために、容器の周りに1 6-0絹縫合糸を配置します。
  3. 動脈周囲のフロープローブを配置します。
  4. その血流を測定し、データを取得する。

門脈圧力の5.4）測定（PVP）

  1. ストレート門脈に排出する、いくつかの側枝と腸間膜静脈、のいずれかのブランチを選択してください。
  2. 選択した腸間膜静脈の遠位端部を連結する。ライゲーションは、腸管に近いことを確認してください。その小さな枝を結紮
  3. 2 Fを配置静脈の周りに6-0プロレンを使用して縫合糸をixing。この手順の重要な点は、静脈を結紮する際腸間膜動脈に触れないようにすることです。
  4. 門脈の近位端を固定します。
  5. 10-0プロレンを使用して2ステー縫合糸を配置します。ステー縫合糸が細い腸間膜静脈の血管壁を貫通必要があるため、一部の出血が発生します。
  6. 45度の角度で斜めにmicroscissorを使用して静脈に小さな切開を行います。
  7. 門脈に腸間膜静脈ミラーカテーテルを挿入し、それを修正
  8. 門脈圧を記録します。手順の最後に、麻酔下で放血によってマウスを生け贄に捧げる。

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結果

このような呼吸数及び心拍数のようなマウスのバイタルパラメータは明らかにラットにおけるよりもはるかに高い。平均全身血圧および頚静脈圧は、ラット値に類似しており、ヒトのデータにでも同様である。

肝血行動態データは明らかに異なっている。私たちは、8匹のマウスから正常値を得た。正常マウスにおける門脈血流が1.6〜2.3ミリリットル/分の範囲であった。総肝動脈内の流れは、0.10〜0.35 ml /分の範囲であった。正常な動物での門脈圧が8.09±2.47の平均値CMH 2 O（表1）、O CMH 2 4.4から11.2の広い範囲であった。正常な動物の小グループの平均値を比較するときに、この広い範囲は小さいが有意でない差異をもたらし得る。

私たちは、特にポータル圧力にかなりの個体間の違いを観察しているので、私たちは、小さな内の個人差が、この技術を用いて検出することができるかどうかを試験しNIQUE。部分肝切除と肝葉クランプ/デクラン：私たちは、2つの異なる実験の設定では、この手順を評価した。ポ...

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ディスカッション

肝血行動態のモニタリングは、肝臓学及び肝胆道外科における重要な研究ツールである。肝血行動態データの取得は、循環系に肝胆手続きの効果を特徴づけるために役立ちます。血管作用薬を評価する研究では、必要に応じて肝血行動態データの取得はまた、 例えば、門脈圧とポータルの流れに影響を与える薬剤の効果を研究するために必要とされる。

小さなサイズにもかかわらず、全身性の重要なパラメータ、および肝臓の血行動態は、マウスにおいてモニターすることができる。次のようにプロトコル内の重要なステップであった：第一に、それは循環器機能障害につながる可能性が低体温症を避けるために、全体の手順の間、温暖化パッドの上に動物を配置することが重要です。マウスの血管壁は非常に壊れやすいと薄いため第二に、それは、マウスの血管を切開する際に非常に慎重であることが重要です。それは、目の上のいくつかの脂肪組織をつかんによって血管壁を固定するのが最善と思われる代わりに、血管壁自体をつかん者の電子面。第三に、腸間膜静脈の周りに固定縫合糸を配置するときに動脈供給を損なわないための腸間膜動脈を誤って結紮を回避することが重...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、「仮想肝ネットワーク」の資金教育研究ドイツ連邦Ministery（BMBF）によってサポートされていました。私はビデオを生成すると音声を記録するためのアニメーションとイザベル素早く方向を変えるの作成に彼らの助けのためのイエナ大学病院のメディアセンターからフランクシューベルトとルネグンペルトに感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
パワーラボ 16/30 ADInstrumentsPL3516
クワッド・ブリッジ・アンプADInstrumentsFE224ブリッジ・アンプ 
動物バイオアンプADInstrumentsFE136
電極FE136(3個入り)ADInstrumentsMLA1213
血管周囲流量計モジュールTransonicTS420
Flowprobe MA0.5PSB / MA1PSBTransonicMA0.5PSB / MA1PSB
SPR-1000マウス圧力カテーテルミラー機器841-0001
液体充填カテーテル テルモSR+DU2619PX26G、0.64倍;19mm
マイクロハサミF·S&ミッドドット;LNo. 14058-09
マイクロ serrefineF·S&ミッドドット;LNo.18055-05
マイクロクランプアプリケーターF·S&ミッドドット;LNo. 18057-14
ストレートマイクロ鉗子F·S&ミッドドット;LNo. 00632-11
湾曲したマイクロ鉗子F·S&ミッドドット;LNo. 00649-11
ニードルホルダーF·S&ミッドドット;LNo. 12061-01
6-0 silkethicon
6-0 proleneethicon
7-0 proleneethicon
10-0 proleneethicon
テールカットオフ装置 Kent Scientificwww.kentscientific.com
LabChart7ADInstrumentsデータ  解析ソフトウェア 
針

参考文献

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