前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用

Summary

私たちは、特注のガルバノタキシスチャンバー内で移動し、不死化された前立腺細胞に生理的な電場を適用する方法を提示します。この方法を使用して、2つの系統の非腫瘍形成性前立腺細胞が、フィールド内で異なる程度の移動方向性を示すことを示します。

Abstract

生理学的な電場は、胚発生、神経突起成長および上皮創傷治癒における細胞移動を導くような特定の生物学的機能を提供しています。 in vitroで培養細胞に直流電界を印加すると、方向性細胞遊走、または電気走を引き起こす。ここで実証する2次元電気走法は、カスタムメイドのポリ（塩化ビニル）（PVC）チャンバ、ガラス表面、白金電極と細胞が撮像された電動ステージを用いて修飾される。 PVC室と白金電極は、低い細胞毒性を示し、手頃な価格の、再使用可能である。ガラス表面と電動顕微鏡ステージは、画像の品質を改善し、細胞へのガラス表面や治療への可能な修飾を可能にする。我々は2つ​​の非腫瘍形成、SV40不死化前立腺細胞株、PRNS-1-1とPNT2の電気走を撮影。これら2つの細胞株は、同様の移行速度を示し、両方の側に移動カソードが、彼らは電気走における方向性の異なる程度を示します。このプロトコルを使用して得られた結果は、PRNは、1-1 PNT2細胞株は、それらの方向性遊走応答を支配する異なる固有の機能を有することができることを示唆している。

Introduction

内因性の電界は、皮膚^{1、32、33、2、}脳のような種々の組織で検出される。生理学的な電界が神経突起^5,6の伸長を案内し、上皮および角膜創傷閉鎖^1,7を促進導く胚発生^3,4を含む特定の生物学的機能を提供しています。 インビトロ 、培養細胞に直流電界を印加する模倣生理電界指向性細胞遊走、または電気走を引き起こす。電気走線維芽細胞^8、魚ケラチノサイト^9、ヒト上皮および角膜ケラチノサイト^10-12に検討されている、神経芽^2、および神経前駆細胞^{14,13リンパ}球。 （ - ）極印加磁界にさらされたときに、研究された細胞の大部分は、陰極に向かって一方向に移行する。しかし、高転移を含むいくつかの癌細胞ヒト乳癌細胞およびヒト前立腺癌細胞株PC-3Mは、陽極（+）極^15、16に移動する。いくつかの機構が電気走を媒介するか、活性化を含む電界を感知する細胞の能力を説明するために提案されているEGFは^、12を受容と、上皮ナトリウムチャネル^17は 、PI3KおよびPTEN ^18、及びカルシウムの放出メカニズムはまだ完全には理解されていない^{。15、19の}イオンとは、複数のシグナル伝達経路が電気走に関与している可能性がある。

Protocol

1.培養前立腺細胞

1. 培養PRNS-1-1、5％CO _2、37℃で、10％FBSおよび抗生物質-抗真菌を補充したRPMI 1640培地中で100mm培養皿上とPNT2前立腺細胞。細胞が電気走実験のために80％の集密度に達するまで、毎日の培地をリフレッシュします。

2.組立電気走チェンバース

1. 下部チャンバーの組み立て
   1. 2-プロパノールでプラスチックの電気走室を拭きます。注射器でチャンバーの底側に円形の開口部周りのマリングレードのシリコンシーラーを適用し、大規模なカバーガラス（ 図1）を取り付け。カバーガラスを押し下げると綿棒で余分な接着剤をふき取るために綿棒の裏側を使用してください。円形の開口部は、媒体と、電流が2インナーメディア貯水池の間に位置し、細胞の上に流れるようになります。
   2. 6ミリメートル×2を作るために小さなカバーガラスをカットダイヤモンドポイントマーカーと5ミリメートルスペーサー。
   3. チャンバーを裏返し。注射器および/または下部ガラス上の2の円形開口部の間の細胞接着10ミリメートル×25mmのチャネル表面を作成するための金属スパチュラでシリコン接着剤の2ストライプを適用する。 2円形の開口部との間にガラススペーサの2枚を接着。スペーサーを押し下げると綿棒および/または爪楊枝で余分な接着剤をふき取るために綿のアプ....

Results

前立腺細胞（PRNS-1-1とPNT2）の2行は、この方法で調査した。両方のライン中の細胞は、2時（ 図5A）の過程で1.0 +/- 0.3ミクロン/分の同じような速度で移動する。しかし、電場の方向性はPNT2ライン（ 図5B）のためPRNS-1-1ラインの0.7 +/- 0.3、および0.2 +/- 0.8である。結果は、それらが位置手がかりに異なる指向性応答を生じる種々の細胞シグナル伝達機構を有していることを示唆し、これら2つの細胞株に（p <0.01、100細胞を追跡した）の電気走の有意差を示す。

Discussion

セルの電気走応答の分析は、多くの細胞の遊走又は増殖^27,28を処理するための重要な機能の指標となっている。ここでは二つの前立腺細胞株をフィルムにガラス表面にカスタムメイドのチャンバーを用いる。これらの細胞株は、電気走の異なる程度を実証し、我々は、細胞内局在または電気走媒介タンパク質の活性化は、電気走応答において観察された差が生じる、不死化細胞株を生成するプロセスの間に干渉されるかもしれないと推測している。

培養皿^27,28で作ら他の電気走室の設計に比べて、現在の設計にはいくつかの利点がある。まず、ガラス表面は、イメージングのために適しており、細胞を有するカバーガラスを、免疫染色のために電気走後に取り出すことができる。本研究では、セルのグループを監視するために10倍の対物レンズの低倍率を使用する。しかし、THESとeはガラス光学素子の改善には、セル¹⁷の前縁にラメリポディアの高速伸縮を追跡する、または蛍光タンパク質で標識した細胞を追跡するために、60倍のオイル対物を有する高倍率での単一細胞を撮影することが可能である。第.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee, et al. (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	ウォームアップ 37 °C;Cは、
胎児ウシ血清 - プレミアム	アトランタバイオロジカル	S11150	PBSで10%、37>までウォームアップする前に。C 使用前に
抗生物質-抗真菌薬 (100x)	Life Technologies	15240	、5 ml から 500 ml の培地
2-プロパノール	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-	-	137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na2HPO4および 1.5 mM KH2PO4 を 1,000 ml の H2O、pH 7.4 までオートクレーブ滅菌、37°C まで温めます。使用前のC
0.25%トリプシン-EDTA	Invitrogen	25200-056	ウォームアップ 37 °C;C使用前に、細胞を37°Cで3〜5分間処理します。C
Galvanotaxisデバイス
GalvanotaxisチャンバーPrecision	Plastics Inc、CA		カスタム設計(1/4 "x 2" x 3.5")、無毒、透明なPVCチャンバー。設計仕様については、著者にお問い合わせください。
ガルバノタキシス電極	UCD電気工場		プラチナコイル電極、フレキシブルコード付き
ガルバノタキシス電源ボックス	基板エンジニアリング、CA		電圧計付きカスタム設計のDC電源出力
顕微鏡カバーガラス、大、45 x 50 mm、No. 1.5	Fisher	12-544-F
顕微鏡カバーガラス、小、25 x 25 mm、No. 1	ThermoScientific	3307
ダイヤモンドポイントマーカー	ThermoScientific	750
マリングレードシリコンシーラー、クリア	3M	051135-08019
高真空グリース	ダウコーニング	2021846-0807
6 mlシリンジ	フィッシャーサイエンティフィック	05-561-64
日菱シリンジ、1.5 ml	日菱	SG-M
コットンアプリケーター	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	ジョンソン&Johnson	729389
Nalgene 180 PVCチューブ	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% 寒天溶液
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	自動T4
セロメータ計数室	Nexcelom	CHT4-SD100-002	負荷20 μl カル
チャーテンプウォーミングプレート	Bel-Art Scienceware	370150000	ガルバノタキシスチャンバーを 37 >C
電動ステージと環境チャンバーを備えたEclipse TE-2000顕微鏡	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 対物	Nikon
Retiga EX CCDカメラ	Qimaging		冷却CCDカメラ、単色、12ビット
圧縮空気、5%CO2	Airgas		特別注文
Volocity6.3PerkinElmer			画像取得ソフトウェア
Improvision OpenLab 5.5.2PerkinElmer			セル追跡ソフトウェアと移行角度を測定するためにカスタマイズ
FileMaker Pro Advanced、8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	マイクロソフト