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方法論記事

迅速な細菌同定および抗生物質感受性試験のための血液培養ペレットの調製

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DOI:

10.3791/51985

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2014年10月15日

 ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

この記事について

サマリー

陽性の血液培養からの急速な細菌ペレット製剤は、MALDI-TOFによる識別、グラム染色、抗生物質感受性試験およびPCRに基づく試験のような用途のための試料とすることができる。結果は、急速に血流感染症に罹患している患者の転帰を改善するために臨床医に伝えることができる。

要約

血流感染および敗血症は、罹患率および死亡率の主な原因である。菌血症を患っている患者の成功した結果は、最適な抗生物質治療を導くために、感染因子の迅速な同定に依存する。陽性の血液培養からのグラム染色の解析が急速に行われ、すでに大幅に抗生物質投与計画に影響を与えることができます。しかし、感染因子の正確な同定は、依然として最適な標的治療を確立するために必要とされる。ここでは、ディスク拡散アッセイまたは自動ASTシステムによるMALDI-TOF MSによる同定、抗生物質感受性試験（AST）などのいくつかの本質的なダウンストリームアプリケーションのための試料とすることができる陽性の血液培養から簡単かつ迅速に細菌ペレット製剤を提示自動化されたPCRベースの診断試験による。血液培養、細菌のペレットに直接適用これらの異なる識別およびASTシステムの性能は非常にSiである通常、寒天プレート上で増殖させた単離されたコロニーから得られた性能にmilar。従来のアプローチと比較して、細菌ペレットの迅速な取得が有意に識別およびASTの両方を報告する時間が短縮される。したがって、血液培養陽性以下、MALDI-TOFによって同定はそれぞれ8〜18時間内、自動ASTシステムやディスク拡散アッセイによりASTの結果に対し、1時間未満以内に報告することができる。同様に、迅速なPCRに基づくアッセイの結果は、菌血症の報告後2時間未満で臨床医に伝えることができる。まとめると、これらの結果は、血液培養細菌ペレットの迅速な調製が同定およびASTのターンアラウンド時間に、従って、血流感染に罹患している患者の成功した結果に大きな影響を与えることを示している。

概要

入院患者における血流感染および敗血症は、罹患率および死亡率の主な原因である。したがって、感染血流に関連した死亡率は、入院患者の37％に約14％で観察され、集中治療室に35％の患者1-3を増加させることができる。感染性病原体の迅速な同定は、最適な抗菌処理を案内すると、抗菌薬治療4,5の成功の結果を高めるために極めて重要である。陽性の血液培養からのグラム染色の迅速な分析がすでに抗菌療法6,7が、感染性因子の正確な同定の適応に重要な影響を持っている患者への最適な適応抗生物質治療を提供するために必要である。例えば、異なる抗生物質による治療レジメンは、グラム染色によって区別す​​ることが困難であり、腸球菌および連鎖球菌による菌血症以下に実装されなければならない。同様に、種での識別がLEVエルは、8ラクタムβに増加した抵抗性を付与する染色体がAmpC遺伝子をコードするグラム陰性腸内細菌を検出する必要がある。

血液培養陽性の場合、従来の診断アプローチは、生化学検査、異なる選択培地上での成長および自動化された微生物同定システムを含むさまざまなアプローチを有する追加のインキュベーションの前に識別の数時間を必要とする別の寒天プレート上の感染性病原体を、継代培養することである。従来の診断アプローチの結果までの時間は約1〜3日間である。

微生物の迅速な同定のためのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF）技術の出現は、迅速に陽性の血液から直接、また、寒天プレート上で増殖させたコロニーから微生物しかしを識別するための新しいツールを提供している培養物（ 図1）9-12。のTh血液培養から感染性病原体を識別するために、MALDI-TOFのEの使用は、数分の代わりに伝統的な方法が必要とする時間と曜日に、結果までの時間を削減しました。 Croxatto ら 13で説明したように、MALDI-TOF同定の効率は、微生物の純度と量など、さまざまなパラメータに依存しています。これらの2つの基準が簡単に寒天プレート上で増殖させた個別のコロニーから得られたが、MALDI-TOF識別を妨害する可能性が複数の細胞およびタンパク質の成分を含んでいてそのような血液培養などの複雑なサンプルからの細菌の濃縮および精製のための分析前処理が必要である。

血液培養から各種微生物'単離方法は、サポニンまたは細菌抽出9,14、血清分離方法10のための他の中性洗剤法を含む多くの研究が、溶解遠心分離方法12において使用されているなどsepsityperキットとして市販ソリューションを提供しています。当社の細菌学診断研究所は、MALDI-TOFによる細菌や酵母の迅速同定および自動識別システム（ 図2）15 を許可し 、塩化アンモニウム赤血球溶解に基づく簡単な血液培養細菌ペレット製剤を開発しました。この血液培養ペレット製剤はまた、グラム染色、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （MRSA）の迅速な検出、およびと抗生物質感受性試験用のPOCT-PCRのような自動化されたPCRベースの診断テストのような他の直接下流のアプリケーションのためのサンプルを提供自動化されたASTシステムおよび/ ​​または寒天プレート上のディスク拡散アッセイ（ 図3）による。

Prod'hom らが説明したように、本 ​​研究では、血液培養細菌ペレットを製造するための異なるステップを説明します。15（ 図4）。また、解除しますMALDI-TOF 15による同定、識別（ID）と、 腸内細菌やブドウ球菌および自動化されたPCR-のための自動化されたシステム16と抗生物質感受性試験（AST）：血液培養ペレット上で実行できる主なアプリケーションの3のためのプロトコルをスクライブMRSA 17の検出のためのベースの診断テスト。

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プロトコル

このプロトコルが開発され、日常的なツールとして実装される前に、当社の機関の研究開発プロセスや倫理的なルールに従う検証されています。

塩化アンモニウム赤血球溶解手順による血液培養細菌ペレットの調製

  1. その後の遠心分離のための血液培養陽性の調製。
    1. 血液培養キャップを滅菌する。ボトルのキャップ上に70％エタノールを追加し、それを燃やす。
      注：層流フードの下に、この手順を実行しないでください。
    2. 層流フードにボトルを移動します。 20のGシリンジで血液培養の5ミリリットルを収集します。
    3. 滅菌水（H 2 O）の45ミリリットルを含有する50 mlの遠心チューブに血液培養の5ミリリットルを加え、サンプルを混ぜる。
  2. 溶解遠心分離による血液培養細菌ペレットの調製。
    1. 室温で10分間、1,000×gでサンプルを遠心。
    2. レモ実験室の真空ポンプで（主にH 2 Oおよび血液細胞を含む）上清VEの。
    3. 溶液（0.15 M NH 4 Clを、1mMのKHCO 3）を溶解自家製塩化アンモニウム1mlにペレットを再懸濁する。削って、チューブをボルテックスでペレットを分解し、室温で10分間、140×gでサンプルを遠心する。
    4. 主に赤血球の破片が含まれている上澄みを捨てる。
      1. ペレットは、出血性のままでいる場合、さらに残留赤血球を溶解するために、ペレットを洗浄し、滅菌蒸留H 2 O 2ml中にペレットを再懸濁する。 RTで10分間、140×gでサンプルを遠心し、上清を捨てる。
    5. H 2 O200μlにペレットを再懸濁
  3. さまざまな選択的および非選択寒天培地上で血液培養のサブカルチャー。
    1. 20のGシリンジで血液培養の1ミリリットルを収集します。
    2. 血液培養intの1滴を接種血液寒天、チョコレート寒天、マッコンキー寒天とシェドラー寒天上の4つの象限O。
    3. 5％のCO 2雰囲気下で37℃で血液寒天、チョコレート寒天プレートをインキュベートし、通常の大気中のマッコンキー寒天および嫌気性条件のシェドラー寒天プレート。
    4. 異なるメディア上の細菌の増殖に従ってください。
    5. 細菌の純度を確認してください。

MALDI-TOF MSによる2識別

  1. 血液ペレットからの直接同定。
    1. 転送1 MALDIターゲットプレート上の血液ペレットμlの42℃の加熱プラットフォーム上それが乾燥させます。
    2. 1μlの70％ギ酸でサンプルをオーバーレイし、42℃の加熱プラットフォーム上それが乾燥させます。
    3. MALDIマトリックスを1μl（50％アセトニトリル-2.5％トリフルオロ酢酸中のα-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸の飽和溶液）を試料にオーバーレイし、42℃の加熱プラットフォーム上それが乾燥させます。
    4. MALに進んでください製造業者によって記載されるようにMALDI-TOF MSシステムとDI-TOF MS分析。
    5. 識別スコアは、種レベルで無効である場合（スコア<2を持つインスタンスの場合）、血液ペレットサンプルのタンパク質抽出を行う。
  2. 血液培養ペレットからのタンパク質抽出後の同定。
    1. RTで2分間13000×gで、70％エタノール及び遠心1mlでペレットを20μlを混ぜる。
    2. 上澄みを捨て、ペレットに70％のギ酸を25μlと100％アセトニトリル25μlのを追加。ペレットを再懸濁するために積極的に渦。ボルテックスの前にピペットチップでそれらを分解してタフなペレットを再懸濁。
    3. 室温で2分間13000×gで遠心分離する。転送1 MALDIターゲットプレート上の上清液（抽出されたタンパク質が含まれている）と、42℃の加熱プラットフォーム上それが乾燥させます。 2.1.2で説明したように進んでください。

3細菌Identificationと自動微生物系による抗生物質感受性試験

  1. 自動化された微生物のシステムとの細菌同定およびASTのための細菌懸濁液の調製。
    1. 自動化された微生物のシステムと互換性の無菌0.45％NaCl溶液3 mlを含有するプラスチックチューブを準備します。
    2. 0.6〜0.8のマクファーランド濁度に応じた細菌懸濁液を得るために、0.45％NaCl溶液中に血液培養ペレットの十分な量を加える。濃度計機を用いて濁度を測定します。
      注：血液培養細菌ペレットの容積が0.6から0.8のマクファーランド濁度を達成するために、50〜200μlのごとに異なります。
  2. 製造業者によって記載されるように識別のための自動化されたグラム陽性（GP）またはグラム陰性（GN）カードおよびグラム陽性球菌およびグラム陰性菌の抗菌薬感受性試験のための自動化されたASTカードを接種する。
    注：IdentificatioMALDI-TOF MSの識別スコア値が> 2であればnはGPまたはGNカードが適用されない。血液寒天培地（GPとGN）とマッコンキー寒天（GN）プレート上の細菌懸濁液を継代培養することにより、細菌懸濁液の純度を確認してください。

ディスク拡散アッセイによる4抗生物質感受性試験

ディスク拡散アッセイは、抗菌薬感受性試験（EUCAST、バージョン3.0、2013年4月、www.eucast.org）に関する欧州委員会によって記述されている。

  1. 細菌懸濁液の調製は、ディスク拡散アッセイによる抗菌薬感受性試験を実行する。
    1. 無菌の0.9％NaCl溶液3mlを含有するガラス管を準備する。
    2. 0.5のマクファーランド濁度に応じた細菌懸濁液を得るために0.9％NaCl溶液中の血液培養ペレットの十分な量を加える。濃度計機を用いて濁度を測定します。
      注：血液培養物の容量細菌ペレットを0.6から0.8のマクファーランド濁度を達成するために、50〜200μlに変化します。
    3. 細菌懸濁液をボルテックスする。
  2. ミューラーヒントン寒天（MH）またはミューラー·ヒントン寒天培養しにくい有機体寒天（MHF）への細菌懸濁液の接種は（MHが5％脱線維素ウマ血液および20mg、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド/ L添加）。
    1. 細菌懸濁液に滅菌綿棒を浸し、軽くガラス管の内壁に綿棒を回して余分な水分を取り除く。
    2. 三方向スワブによって、又は自動プレートローテーターを用いて、MH / MHF寒天プレートの表面全体に均一に細菌懸濁液を広げる。
  3. 接種した寒天プレート上の抗菌ディスクの応用。
    1. 手動で乾燥した接種した寒天プレートの表面上または感受性ディスクディスペンサーを使用して、密接にディスクを適用する。
    2. 適切なテンペでプレートをインキュベート抗菌薬感受性試験EUCASTディスク拡散法（バージョン3.0、2013年4月、www.eucast.org）に記載されているようratureと雰囲気。

5。MRSAの検出のための自動化されたPCRベースの診断テスト

  1. マイクロピペットを用いて、20秒の間、PCRベースの診断検査キットと渦を自動化されたMRSAに付属のサンプル用試薬バイアルに血液培養ペレットを50μlを移す。
  2. 1ミリリットルのマイクロピペットを使用して、カートリッジの試料ポートに試料を分注する。自動化されたPCRシステムにカートリッジを挿入し、製造業者によって記載されるようにアッセイを開始します。

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結果

Prod'hom ら 15による研究において、78人の患者から122血液培養陽性の塩化アンモニウム溶解遠心分離によって得られた細菌ペレットを、MALDI-TOF MSにより分析した。 122血液培養陽性のうち、95（77.9％）が正しく属レベルでの種レベル一つ（0.8％）で同定された。残りの26（21.3％）の血液培養ペレットMALDI-TOFによって信頼性の識別を与えなかった。このうち、21が13連鎖球菌と5コアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含むグラム陽性菌であった。重要なことは、13未確認の連鎖球菌のうち10は、しばしば困難な溶解カプセルを有し、Sの種からほとんど区別されている肺炎球菌であったMALDI-TOF MSを用いてミティスグループ 。五グラム陰性菌は、4つの難溶解二つ肺炎桿菌二Haemopを含む細菌種のカプセル化され、その中MALDI-TOFによって同定されなかった門インフルエンザ。このように、MALDI-TOFによる正確な同定は、寒天プレート11上に成長させた細菌コロニーの従...

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ディスカッション

従来の血液培養陽性診断アプローチと比較して、塩化アンモニウム溶解遠心分離法を用いて、細菌ペレットの迅速な取得が24時間と48時間と24によってASTを報告する時間（ 図1および 16による識別を報告するための時間を短縮3）。

適切な抗生物質治療の迅速な導入が血流感染に罹患している患者の転帰を改善するために極めて重要である。このようにして、約8から16時間で得られた急速なASTが続き、1時間内で感染性物質の早期発見は、敗血症患者の臨床管理において大きな影響を表しています。グラム染色の迅速な報告がすでに抗菌薬治療に大きな影響に関連付けられており、従って、患者の罹患率および死亡率6,7の減少にされています。血液培養細菌ペレットのグラム染色は、感度を高めるために行うことができるときBLのグラム染色OOD培養液を陰性または弱陽性（ 図4）。しかし、ネイティブの血液培養ブロス上で実行グラム染色は、鎖中のクラスタ内のブドウ球菌や連鎖球菌などの典型的な形態を観察することをお勧...

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開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

謝辞

私たちは、実験室での技術を実装するために彼らの助けのためにローザンヌ大学病院センターの細菌学研究室の技術者に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
20 G 針テルモ、ルーヴェン、ベルギーNN-2038R
50 ml ファルコン チューブBD、フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国35207050 ml 遠心分離管
アンモニウム クロリュールメルク、ダルムシュタット、ドイツ101145
炭酸カリウムフルカ、セントルイス、ミズーリ州、米国 60340
ギ酸Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F0507可燃性、腐食性
α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸フルカ、セントルイス、ミズーリ州、米国 70990急性毒性
アセトニトリルSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 271004可燃性、急性毒性
トリフルオロ酢酸Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス T6508腐食性、急性毒性
Vitek 2 60機器Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France27202自動微生物システム機器
Vitek 2 グラム陽性 (GP) カードBiomérieux, Marcy-l'Etoile, France21342automated GP  identification card
Vitek 2 AST-P580 cardBiomérieux, Marcy-l'Etoile, France22233自動微生物ASTシステム
Vitek 2 グラム陰性(GN)カードBiomérieux, Marcy-l'Etoile, France21341automated GN  identification card
Vitek 2 AST-N242 cardBiomérieux, Marcy-l'Etoile, France413391自動微生物ASTシステム
Xpert MRSACepheid, Sunnyvale, Ca, USA GXMRSA-100N-10核酸増幅技術 MRSA
GeneXpert IV 装置米国カリフォルニア州サニーベールのセファイドGXIV-4-D核酸増幅技術装置
Microflex LT MALDI-TOF MS 装置Bruker Daltonics, ブレーメン, ドイツBDAL microflex LT/SH
MSP 96 ターゲットスチール BCBruker Daltonics, ブレーメン, ドイツ280799MALDI ターゲットプレート
デンシトメーター デンシチェック装置Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France27208
MALDI Sepsityper kit 50Bruker Daltonics, Bremen, Germany8270170
Mac Conkey agarBiolife, Milano, Italy4016702
Mueller-Hinton agarOxoid, Hampshire, EnglandCM0337Mueller-Hinton agar (MH) 
MHF寒天培Biomérieux, Marcy-l'Etoile, France43901Mueller-Hinton agar-fastidious organisms agar (MHF)
BD columbia III agarBD, Franklin Lakes, NJ, USA254071blood agar
BD chocolate agarBD, Franklin Lakes, NJ, USA254089chocolate agar
BD schaedler agarBD, Franklin Lakes, NJ, USA254084Schaedler agar
地

参考文献

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