細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

サマリー

抗体の中和を評価し、効果的なワクチン免疫原の設計を導くためには、ウイルス表面抗原のコンフォメーションを理解する必要があります。ここでは、トランスフェクションされた細胞の表面に発現する三量体HIV-1 Envを特異的な抗Env抗体によって認識する研究を可能にする細胞ベースのELISAアッセイについて説明します。

要約

HIV-1エンベロープ糖タンパク質（Env）は、標的細胞へのウイルスの侵入を媒介し、感染サイクルに不可欠です。これらの糖タンパク質が、その構造変化を通じて融合プロセスをどのように促進できるかを理解することは、ワクチン戦略のためのより優れた、より効果的な免疫原の設計につながる可能性があります。ここでは、モノクローナル抗体による三量体HIV-1 Envの認識を研究することができる細胞ベースのELISAアッセイについて説明します。トランスフェクションした細胞の表面でHIV-1三量体Envを発現させた後、コンフォメーション特異的抗Env抗体を細胞とインキュベートします。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体と単純な化学発光反応を使用して、結合した抗体を検出します。このシステムは柔軟性が高く、可溶性CD4または細胞タンパク質によって誘発されるEnvコンフォメーション変化を検出できます。最小限の材料で済み、高度に専門化された機器やノウハウは必要ありません。したがって、この手法は、新たに単離された抗体などの抗原および抗体の中スループットからハイスループットのスクリーニングに確立できます。

概要

三量体ウイルスエンベロープ糖タンパク質（Envの）によって媒介されるヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のエントリは、感染サイクルの第一段階である。ビリオンの表面に提示のみさらさウイルス抗原なので、Envの三量体は、中和および非中和抗体を誘発する。このように、ワクチンの免疫原の設計のための興味深い候補を表わす。しかし、可溶性または組換え形態におけるのEnvを用いたワクチン接種試験は最も主要なHIV-1に対する最小限の有効性応答を誘発し^1-3を分離^します。それにもかかわらず、RV144ワクチン臨床試験⁴で観察された部分的な有効性は、免疫原候補として、HIV-1のEnvに興味をリニューアルしました。これは、ワクチン誘発抗-ENV抗体はSIVとHIV ^5挑戦に対する保護のある程度を生成するのに十分であったことを記述した最近の研究によって確証された。

小胞体内で合成された後、Envのglycoprote前駆体のgp160に、ウィルス融合プロセスを燃料する能力にとって重要なさまざまな翻訳後修飾を受ける。のEnv前駆体は、gp120-gp41の ​​リエゾンを維持し非共有相互作用で、その細胞質外gp120およびgp41の ​​膜貫通サブユニット^6-10に切断される前に、三量体で適切に関連付ける倍なければなりません。感染した細胞の機構も大きく、その総質量^11,12の約​​50％を占めたEnvをグリコシル化する責任があります。良い異なるコンホメーションを理解することの重要性を強調し、Envのが適応し、それ以外の場合は^15〜19を暴露される特定の高度に免疫原性エピトープを非表示にすることを可能にすると考えられている準安定性を提供しながら、得られた複合体構造は、Envのは^13,14立体構造的に柔軟であることを可能にするネイティブのEnv三量体によってサンプリング。

今日までに、いくつかの技術が開発され、首尾よくEnvのコンホメーションchのを研究するために使用されているアンジェス。しかし、それらは多くの場合、特定のEnvコンテキストに限定されるものでは、その限界が異なります。例えば、表面プラズモン共鳴またはコンフォメーション特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降アッセイ（mAb）は、どちらかは、それらの三量体形態^20,21からの免疫遺伝学的に異なることが知られている単量体の可溶性または可溶化のEnv分子に依存している。最近の研究ではまた、切断は主に抗体^14,22,23を非中和により認識されるエピトープの露出をもたらしたEnvのコンフォメーションに影響を与えることを示唆している。

ここでは詳細にcellularly発現さのEnv三量体^18,24-26のコンフォメーションの迅速かつ容易な決定を可能にする方法が記載されている。ヒトの付着性細胞株におけるのEnvの一過性トランスフェクション後のEnv特異的抗体の結合は、単純な化学発光反応を用いて検出される。この技術は、コンフォメーションdepenの立体配座優先性を特徴付けるために使用することができる凹み抗体。したがって、このアッセイは、堅牢で柔軟性の高い検出方法を提供する。

プロトコル

1 1日目 - 細胞培養

1. プレート2×10 ⁴ヒト骨肉腫（HOS）発光読み取りに適した不透明な96ウェル細胞培養プレート中のウェルあたりの細胞。 10％ウシ胎児血清（FBS）および100 U / mlペニシリン - ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用する。 37°C、5％CO ₂で翌日までインキュベートする。

2 2日目 - ポリエチレンイミン（PEI）トランスフェクション

1. 以降の手順に従って、トランスフェクションミックスを調製する。同じのEnvでトランスフェクトされるべきである井戸の数に応じて試薬とDNAの量を調整します。
2. チューブA：25mMのHEPESを補充したDMEMμlの5に10ngのTatのコード（例えばPTAT-III ²⁷など）は、プラスミドと150ngのEnvのコードプラスミドを追加します。
3. などpSVIIIなどのTat依存のEnvをコードするプラスミドを使用した場合のTat-コードプラスミドにのみ必要です。
4. チューブB：1から（450 ngのPEIを追加5μlのDMEM中にμgの/μlの溶液）。
5. 徹底的に10秒間ボルテックスチューブA.ミックスにチューブBの内容を追加し、トランスフェクション混合物を室温（22℃）で10分間インキュベートする。
6. 96ウェルプレートのウェルあたりトランスフェクション混合物10μlを追加します。 37°C、5％CO ₂で48時間インキュベートする。

3。4日目 - ELISA

1. のEnv /抗体複合体の可能性エンドサイトーシスを最小限にするために、室温ですべての実験を行います。
2. 同時に使用されているプレートあたりの洗浄バッファー250ミリリットルを用意してください。洗浄緩衝液は、1×トリス緩衝食塩水（TBS）pH7.5である（50 mMトリス-Clを、pH7.5の、150mMのNaCl）、1mMのMgCl ₂および1.8mMのCaCl _2を補充した。
3. 1％脱脂粉乳および洗浄緩衝液に5 mMトリスpH8.0のを追加することによって、プレートあたりブロッキングバッファー125ミリリットルを用意します。
4. 96ウェルプレートから細胞培養培地およびトランスフェクション混合物（上清）を除去する。
5. 100μの追加;ウェルあたりブロッキングバッファーし、室温で20分間インキュベートリットル。
6. 上清を除去し、ブロッキング緩衝液で適当な濃度に希釈ウェル当たり抗体（または血清）を50μlを追加。一般的に、11μg/ mlの濃度を使用しています。室温で1時間インキュベートする。
7. 100μlのブロッキング緩衝液、その後、100μlの洗浄緩衝液で洗浄工程を3回繰り返すとウォッシュ3倍。
8. 上清を除去し、ブロッキング緩衝液を100μlを追加し、室温で5分間インキュベートする。
9. 上清を除去し、ブロッキング緩衝液中で1/3000に希釈した二次抗体を50μlを追加。メーカーの違いに応じた最適な抗体希釈を変更します。 RTで40分インキュベートします。
10. 100μlのブロッキング緩衝液、その後、100μlの洗浄緩衝液で洗浄工程を3回繰り返すとウォッシュ3倍。

4。データ収集

1. プレートから上清を除去し、ウェル当たり30μlの1×高感度化学発光（ECL）基板を追加します。
2. CHEMを取得1秒間iluminescence信号/ウェル上の製造者の指示に従って、適切なプレートリーダー。時間を読むことは、ハードウェアの違いにより異なる場合があります。

結果

上記した一般的手順を用いて、野生型（wt）又は変異EnvのいずれかでたCD4iエピトープの露出に対する可溶性CD4（sCD4を）と共発現細胞のCD4の影響をアッセイするためのプロトコルを適合^18,24前述したように^{、 25,28。} 図1は、一般的な手順とsCD4を持つまたは携帯CD4 ¹⁸の共発現による治療後のたCD4iエピトープの露出を表しています。 図2では、私たちは^18,24期待どおり外ドメインを認識するモノクローナル抗体2G12は、この処理によって影響を受けないのに対し、たCD4iモノクローナル抗体17b及びコレセプター結合部位^{24,29と重なる} 48dがエピトープを露出させたEnv立体構造変化を誘導するためのsCD4を使用していました。

図3に示すように、Envのコンホメーションにおける点変異の影響もまた、このアッセイを用いて評価することができる。ここでは減少を...

ディスカッション

このアッセイは、HIV-1 Envの三量体が細胞表面で発現を特異的mAbの相互作用を検出するために最適化される。プロトコルが確立されると、それは全体的に低い材料コストおよび抗体の少ない量で高いスループットを培地で使用することができる。このアッセイは、トランスフェクションに基づいているので、容易にEnvのコンホメーションに及ぼす影響を研究するために、CD4のような細胞タンパク質の同時発現に適合させることができる。

しかしながら、このプロトコルのトランスフェクションベースはまた、最も重要な落とし穴の一つであることを意味する。最初に、この技術を用いて研究されるべき抗原は、独立した発現ベクターで利用可能であることが要求される。このように、さまざまな臨床ソースまたはプロウイルス構築物からのEnv遺伝子は、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングされる必要がある。完全長のプロウイルス構築物（Veillette ら ^18を参照）、この技術においても使用することができるが、これはまた、行為を意味アイブウイルス粒子の産生は、このように適切な生物学的封じ込め施設で...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HOS cells	ATCC	CRL-1543
White Opaque Tissue Culture Plate, 96-well, Flat Bottom BD		353296
Polyethylenimine, linear, 25,000 MW	Polysciences	23966	Prepared in 1 mg/ml solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	11995
ヤギ Anti-human IgG, Peroxidase Conjugated	Pierce	31413
強化化学発光基質	PerkinElmer	NEL105001EA
TriStar LB 941、プレートリーダー	Berthold Technologies