マウスにおけるローカルアナフィラキシーの測定

サマリー

肥満細胞および好塩基球の活性化によって特徴付けられるアレルギー反応は、IgEの架橋および前炎症性メディエーターの放出によって駆動される。アレルギー反応の定量的評価は、アレルゲンチャレンジ後の血管透過性の変化を監視するためにエバンスブルー色素を用いることによって達成することができる。

要約

アレルギー反応は、肥満細胞および好塩基球、および血管作用性のその後の放出および炎症誘発性メディエーターの活性化の結果である。感作された個体におけるアレルゲンへの暴露は、生命​​を脅かすアナフィラキシーにマイナー紅斑によって異なる臨床症状をもたらす可能性がある。研究室では、さまざまな動物モデルは、アレルギー反応を駆動するメカニズムを理解するために開発されている。本明細書では、局所的なアレルギー反応を定量化するために、血管透過性の変化を測定するための詳細な方法を記載している。ローカルアナフィラキシーアッセイは、最初に1920年代に報告された、と小島らによって公表さテクニックから適応されています。 2007年に^1。このアッセイでは、OVAに感作したマウスは、車両と左耳にし、OVAでの右耳にチャレンジする。これは、エバンスブルー色素の静脈内注射が続く。十分エバンスブルーを注入した後、動物を中に浸出している染料を安楽死させている耳にホルムアミド中で一晩抽出した。抽出された色素の吸光度を分光光度計で定量化される。この方法は、確実に地元のアレルギー反応の視覚的および定量化可能な症状をもたらす。

概要

I型過敏症は、肥満細胞および好塩基球の表面上のIgE抗原によって誘発される架橋によって媒介される。これは、細胞の脱顆粒およびヒスタミン、トリプターゼ、および血小板活性化因子²のような血管作動および炎症誘発性メディエーターの放出をもたらす。脱顆粒中に予め形成されたメディエータの放出に続いて、肥満細胞を合成し、プロスタグランジンおよびロイコトリエンを放出し、さらに血管透過^3を増加させる。初期臨床反応が急速に発生し、「即時反応」と呼ばれている。皮膚では、膨疹·アンド·フレア応答は、抗原チャレンジの数分以内に容易に見ることができる。チャレンジの用量に応じて、それは数時間後に「後期応答」を観察することができる。後期相腫れ、組織²への局部的な浮腫および白血球動員によるものである。ヒスタミン、一般的に参加している主要なメディエーターであると考えられて即時アレルギー反応は、ヒスタミン受容体1（HR1）に作用して血管やヒスタミン受容体2（HR2）上で発現平滑筋上に発現する。複合効果は、炎症⁴の部位で血流および血管透過性を増加させる。

アレルギーの動物モデルのさまざまなアレルギー性​​喘息、全身性アナフィラキシーおよびアナフィラキシーの局所モデルを含むアレルギー性​​炎症に関与する機構を研究するために開発されてきた。静脈内の色素投与が出版物は1920年代⁵に戻って、この技術の出会い系を....

プロトコル

1感作マウス

1. 20ミリグラム/ mlの最終濃度になるように1×PBS中のOVAを希釈することによってOVAストック溶液を調製する。クリオバイアル中にアリコートを下に凍結し、将来の使用のために-80℃で保存してください。
2. 室温に20 mg / mlのOVA株の一つ以上の分量を持参してください。キャップ5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに1 mg / mlでの最終濃度になるように1×PBS中OVAを希釈する。ボルテックスを簡単に混合する。
3. 1の比率：中速に設定したボルテックスで1 mg / mlのOVAを含むポリスチレンチューブを押さえながら1を生成するために、チューブをボルテックスを続けながら、十分に均質化Imjectミョウバン（40 mg / ml）を滴下して、等量のを追加免疫原に対するミョウバン。
4. 渦にチューブ、テープ、チューブのキャップを置きます。最も低い設定で渦をオンにして、OVAを30分間ミョウバンに吸着することができます。
   1. 多くの時間は、OVA /ミョウバンを用意し、マウスを感作の間を通過させないようにしてください。感作は、OVA /ミョウバンpreparat直後に完了できない場合室温でのイオン、店舗OVA /ミョウバン。使用する前に1分間ボルテックスする。
5. OVA /ミョウバン混合物で1ミリリットルのインスリン注射器をロードします。 27ゲージの針を注射器に蓋を。

結果

成功した検定を受けた動物は、青色に見える皮膚や目を持つことになります。 PBS感作動物は、したがって、両方の耳が（ 図1A）白のままべきで、PBSまたはOVAチャレンジのいずれかに反応すべきではない。 OVA感作動物では、PBSチャレンジを受け取っ耳（左）は、注射部位の局所的な方法で完全に白か軽く青のどちらかである必要があります。 OVAチャレンジを受けた耳（右）は染料の管理（ 図1B）の後に10分の間に次第に暗く青いなるはずである。

PBS感作動物は、PBSとOVAチャレンジ（ 図2A）の両方に無視できる吸光度の読み取りを持つことになります。 OVA感作動物では、PBS注射は一般的に0.13の平均吸光度読み取りと0.04の標準偏差になる。逆に、0.58の平均吸光度読み取りと0.18の標準偏差が50μgのOVAチャレンジの結果（FIグレ2B）。必要であれば、チャレンジのために使用されるOVAの量は、個別の実験のために調整することができる。例えば、.......

ディスカッション

アレルギー性​​疾患の多数のマーカーが気道チャレンジの設定における気管支肺胞洗浄液中へ循環させるヒスタミン、Th2サイ​​トカインの産生、および細胞動員のレベルの変化を含む、アレルゲン攻撃後のアレルギー反応の強度を評価するために使用される。これらのパラメータの変化をモニタリングすること、アレルギー反応を研究するために重要であるが、生物学的マーカーは、常に臨床アレルギー性​​疾患と相関しない。このプロトコルで説明ローカルアナフィラキシーアッセイは、ローカライズされたアレルギー性​​疾患の相関としてローカライズされた血管透過性の再現性のある測定を提供する。ブルー色素血管外漏出を使用することにより、このプロトコルは、可視化およびローカライズされたアレルギー反応の相対的な定量化の両方を可能にします。臨床スコアリングに依存するアレルギーアッセイとは対照的に、（分光光度吸光度によって測定される青色色素の血管外遊出）このアッセイの一次結果は、簡単に観察者バイアスを受けない。もう一つのアドバntage動物が潜在的アレルゲンチャレンジと色素投与によって引き起こされる不快感を制限し、すぐに攻撃後に安楽死させていることである。 ら

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BALB/c マウス	ジャクソン研究所	651
PBS pH 7.4	品質 生物学的製剤	114-058-101
オボアルブミン	Σ	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	使用前によく混ぜる
エバンス ブルー ダイ	シグマ	E2129
ホルムアミド	シグマ	295876	99%+ 分光光度グレード
イソフルラン、USP	フェニックス	NDC 57319-474-06
1cc インスリン注射器	BD	329654
3/10 cc インスリン注射器 31 G 針付き	テルモ	NDC 100861
27 G 針	BD	305109
鉗子	F.S.T.	11000-12
外科用ハサミ	F.S.T.14070-12
5 ml ポリスチレン丸底チューブ	BD ファルコン	352058
1.5 ml マイクロ遠心チューブ	医療用サプライパートナー	15-1151
15 ml コニカルチューブ	BD ファルコン	352097
平底 96 ウェルプレート	Costar	3590
スコッチテープ
RC2< / sup>げっ歯類麻酔システム	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	エンティフィックインダストリーズ	SI-0236	モデルG560、3インチプラットフォーム付き

サイ