マウスにおけるローカルアナフィラキシーの測定

サマリー

肥満細胞および好塩基球の活性化によって特徴付けられるアレルギー反応は、IgEの架橋および前炎症性メディエーターの放出によって駆動される。アレルギー反応の定量的評価は、アレルゲンチャレンジ後の血管透過性の変化を監視するためにエバンスブルー色素を用いることによって達成することができる。

要約

アレルギー反応は、肥満細胞および好塩基球、および血管作用性のその後の放出および炎症誘発性メディエーターの活性化の結果である。感作された個体におけるアレルゲンへの暴露は、生命​​を脅かすアナフィラキシーにマイナー紅斑によって異なる臨床症状をもたらす可能性がある。研究室では、さまざまな動物モデルは、アレルギー反応を駆動するメカニズムを理解するために開発されている。本明細書では、局所的なアレルギー反応を定量化するために、血管透過性の変化を測定するための詳細な方法を記載している。ローカルアナフィラキシーアッセイは、最初に1920年代に報告された、と小島らによって公表さテクニックから適応されています。 2007年に^1。このアッセイでは、OVAに感作したマウスは、車両と左耳にし、OVAでの右耳にチャレンジする。これは、エバンスブルー色素の静脈内注射が続く。十分エバンスブルーを注入した後、動物を中に浸出している染料を安楽死させている耳にホルムアミド中で一晩抽出した。抽出された色素の吸光度を分光光度計で定量化される。この方法は、確実に地元のアレルギー反応の視覚的および定量化可能な症状をもたらす。

概要

I型過敏症は、肥満細胞および好塩基球の表面上のIgE抗原によって誘発される架橋によって媒介される。これは、細胞の脱顆粒およびヒスタミン、トリプターゼ、および血小板活性化因子²のような血管作動および炎症誘発性メディエーターの放出をもたらす。脱顆粒中に予め形成されたメディエータの放出に続いて、肥満細胞を合成し、プロスタグランジンおよびロイコトリエンを放出し、さらに血管透過^3を増加させる。初期臨床反応が急速に発生し、「即時反応」と呼ばれている。皮膚では、膨疹·アンド·フレア応答は、抗原チャレンジの数分以内に容易に見ることができる。チャレンジの用量に応じて、それは数時間後に「後期応答」を観察することができる。後期相腫れ、組織²への局部的な浮腫および白血球動員によるものである。ヒスタミン、一般的に参加している主要なメディエーターであると考えられて即時アレルギー反応は、ヒスタミン受容体1（HR1）に作用して血管やヒスタミン受容体2（HR2）上で発現平滑筋上に発現する。複合効果は、炎症⁴の部位で血流および血管透過性を増加させる。

アレルギーの動物モデルのさまざまなアレルギー性​​喘息、全身性アナフィラキシーおよびアナフィラキシーの局所モデルを含むアレルギー性​​炎症に関与する機構を研究するために開発されてきた。静脈内の色素投与が出版物は1920年代⁵に戻って、この技術の出会い系を記述すると、ほぼ一世紀のための動物モデルでのローカライズされたアレルギー反応を測定するために使用されています。ウサギおよびモルモットは、即時型過敏反応をテストするために使用される第一の動物モデルであった、そして最も敏感な応答は、一般に、耳^5,6で見出された。アッセイは、後に、ラット⁷およびマウス⁸で使用するために検証された。

歴史的に、実験方法のさまざまな前の色素の注入は、染料の注入に先立っての抗原の注射への抗原の注射、及び染料と抗原の同時注射を含む、使用されている。アレルギー反応を測定するための手段としての静脈内投与の染料は、それが受動的、能動測定するために使用され、受動的な反応^5,9を逆にすることができるように汎用性の高いアッセイである。数多くの染料は、トリパンブルー、ポンタミンスカイブルー、エバンスブルー、チバガイギーブルー536、インドインク^5,6,9を含むアレルギー反応を評価するために利用されてきた。 0.5％エバンスブルー溶液は、現在、皮膚にアレルギー反応を測定するために使用される標準的な染料である。

チャレンジに対するアナフィラキシー反応は一過性である。最大強度は10内に到達する-染料注入の15分であり、染料に関係なく⁹に使用される動物種の、チャレンジ後30分以上を投与された場合も反応は見られない。色素血管外遊出の定量化は、元あったLY青色色素^7-9で示されるように膨疹の大きさを測定した。さらに、脱顆粒したマスト細胞の数は、反応部位から皮膚組織を切除し^、7トルイジンブルーで染色することにより定量することができる。肥満細胞は、高親和性IgE受容体FcεRIとを発現している主ローカルな細胞集団であるように、マスト細胞脱顆粒は、多くの場合、皮膚、IgE媒介アレルギー応答のためのマーカーとして使用される。組織への色素血管外遊出を測定するための分光光度技術は1990年代にラット¹⁰およびマウス¹¹における受動皮膚アナフィラキシー（PCA）のために開発された。

次のローカルアナフィラキシーアッセイプロトコルは^、1。小島らから適応し、アレルギー反応を誘発するための抗原として鶏卵卵白アルブミン（OVA）を利用した。しかしながら、所望であれば、OVA以外の抗原を使用してもよい。アッセイは、その後、血管permeabilitの変化を監視するためにエバンスブルー色素を使用する細胞のIgE架橋およびヒスタミン放出をマストに起因し発生するyの。

プロトコル

1感作マウス

1. 20ミリグラム/ mlの最終濃度になるように1×PBS中のOVAを希釈することによってOVAストック溶液を調製する。クリオバイアル中にアリコートを下に凍結し、将来の使用のために-80℃で保存してください。
2. 室温に20 mg / mlのOVA株の一つ以上の分量を持参してください。キャップ5ミリリットルのポリスチレン丸底チューブに1 mg / mlでの最終濃度になるように1×PBS中OVAを希釈する。ボルテックスを簡単に混合する。
3. 1の比率：中速に設定したボルテックスで1 mg / mlのOVAを含むポリスチレンチューブを押さえながら1を生成するために、チューブをボルテックスを続けながら、十分に均質化Imjectミョウバン（40 mg / ml）を滴下して、等量のを追加免疫原に対するミョウバン。
4. 渦にチューブ、テープ、チューブのキャップを置きます。最も低い設定で渦をオンにして、OVAを30分間ミョウバンに吸着することができます。
   1. 多くの時間は、OVA /ミョウバンを用意し、マウスを感作の間を通過させないようにしてください。感作は、OVA /ミョウバンpreparat直後に完了できない場合室温でのイオン、店舗OVA /ミョウバン。使用する前に1分間ボルテックスする。
5. OVA /ミョウバン混合物で1ミリリットルのインスリン注射器をロードします。 27ゲージの針を注射器に蓋を。
6. OVA50μgのマウス当たりの用量及びミョウバン2mgのためのBALB / cマウスの腹腔にOVA /ミョウバンを100μlを注入。
7. ネガティブ対照として、PBSに対するマウスの別のグループを感作。 OVAを省略して、上記と同様に、ミョウバンとPBSの1：1混合物を準備します。
8. 3回の注射で合計3週間、週に一度、すべてのマウス（OVAおよびPBS対照）を感作する。最後の注射の後、地元のアナフィラキシーアッセイを行う前に少なくとも2週間待ちます。

2ローカルアナフィラキシーアッセイ

1. 室温にOVA原液を持参してください。 （：1×PBS中のOVAの4希釈1）を1.5 mlマイクロチューブでは、PBSで5ミリグラム/ mlの最終濃度に20 mg / mlのOVAストックを希釈する。ボルテックスを簡単に混合する。
2. ^{使用して、マウスを麻酔/ SUP>齧歯類麻酔システム（または同等の気化したデリバリーシステム）。イソフルランでリザーバを入力し、O ₂気流をオンにします。誘導チャンバ内にマウスを置き、麻酔を開始するために、5％イソフルランコントロールダイヤルを調整します。マウスが完全に麻酔をかけた後、移動性の欠如によって示される、深い麻酔を維持するために、3％イソフルランコントロールダイヤルを調整します。この手順の麻酔の目的は、動物を固定化することです。耳と尾静脈注射は動物に重大な痛みや苦痛を引き起こさない。
   注：イソフルランは、人間の生殖系に悪影響を及ぼす可能性があります。廃ガスを中和するために換気の良い部屋で使用し、誘導室に掃気キャニスターを取り付けてください。イソフルランの使用中に妊娠している場合は、露出を最小限にするために、炭素フィルターマスクを着用してください。}
3. 31 G針でキャップされた3月10日のccインスリン注射器にロード5 mg / mlのOVAを10μlの。 10μlの別の3月10日のccインスリン注射器をロード1倍のPBS。
4. 解剖顕微鏡を使用して、OVA50μgののチャレンジ用量のために、麻酔したマウスの右耳にOVAを10μlを注入する。このよう20μgのような他の用量もまた、許容可能である。
   1. 15ミリリットルコニカルチューブの周りにスコッチテープ（粘着面を上に）ラップ、注射のために耳を安定させるために。テープに右耳の背側を固定します。耳の二枚の葉の間に針のベベル側を上に挿入します。ゆっくりあらゆる血管をヒットしないように注意しながら、耳組織の中心にOVAを注入。
5. 上記と同じ方法を使用して、陰性対照として左耳にPBS10μlを注入する。
6. 3分待ちます。
   1. この時間の間に、拘束具にマウスを配置し、血管を拡張するために加熱ランプ下または1分間の温水浴中で尾を保持する。
7. 27 G針でキャップされた1ミリリットルのインスリン注射器を使用して、ゆっくりとテールVに0.5％エバンスブルー色素を200μl注入マウスのEIN。全体を200μlのが投与される前に、急速な注入は、血管構造を破壊することができる。この場合は、尾の反対側に静脈内に染料の残りの容積を注入しようとする。
8. 10分待ちます。
9. マウスを安楽死させると、鉗子や外科用ハサミを使用して、両耳を削除します。
   1. に圧力が耳の中央に注射部位に適用されていないことを確認して、鉗子で耳の端をつかむ。近くにカットして、できるだけ多くの耳組織を削除ではなくを通じて、耳の付け根で軟骨に存在する尾根。毛皮少量の切除された耳の上に存在してもよい。これは、アッセイには影響しません。
10. 一定分量1.5mlのマイクロチューブにホルムアミド700μlの。耳ごとに1つのチューブ（マウスあたり2の管）を準備します。
    注：ホルムアミドは、催奇形性、変異原性、および刺激物である。手袋、眼の保護、保護面を着用すること。取り扱いには妊娠中の女性は注意が必要ですsのホルムアミドは胎児毒性があります。
11. 、ホルムアミド、チューブにキャップをし、63℃に設定し、ドライ熱浴中で一晩インキュベートし、耳を追加します。耳はまだインキュベーション後に、わずかに青い表示される場合があります。しかし、染料の大部分は、ホルムアミド中に抽出されます。
12. 96ウェルプレートに、二重に、各サンプルを300μlを追加。それが試料中に存在する場合に毛皮を転送避ける。彼らは吸光度の読み取りに影響を与えるように、ウェル中に存在気泡がないことを確認します。
13. 96ウェルプレートに、二重に、ホルムアミドを300μlを追加。これらのウェルはブランクとして使用されます。
14. 620 nmの吸光度を測定するための分光光度計を使用してください。各サンプル読みからホルムアミド井戸を引きます。
    注：すべての実験は制服サービス大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。

結果

成功した検定を受けた動物は、青色に見える皮膚や目を持つことになります。 PBS感作動物は、したがって、両方の耳が（ 図1A）白のままべきで、PBSまたはOVAチャレンジのいずれかに反応すべきではない。 OVA感作動物では、PBSチャレンジを受け取っ耳（左）は、注射部位の局所的な方法で完全に白か軽く青のどちらかである必要があります。 OVAチャレンジを受けた耳（右）は染料の管理（ 図1B）の後に10分の間に次第に暗く青いなるはずである。

PBS感作動物は、PBSとOVAチャレンジ（ 図2A）の両方に無視できる吸光度の読み取りを持つことになります。 OVA感作動物では、PBS注射は一般的に0.13の平均吸光度読み取りと0.04の標準偏差になる。逆に、0.58の平均吸光度読み取りと0.18の標準偏差が50μgのOVAチャレンジの結果（FIグレ2B）。必要であれば、チャレンジのために使用されるOVAの量は、個別の実験のために調整することができる。例えば、...

ディスカッション

アレルギー性​​疾患の多数のマーカーが気道チャレンジの設定における気管支肺胞洗浄液中へ循環させるヒスタミン、Th2サイ​​トカインの産生、および細胞動員のレベルの変化を含む、アレルゲン攻撃後のアレルギー反応の強度を評価するために使用される。これらのパラメータの変化をモニタリングすること、アレルギー反応を研究するために重要であるが、生物学的マーカーは、常に臨床アレルギー性​​疾患と相関しない。このプロトコルで説明ローカルアナフィラキシーアッセイは、ローカライズされたアレルギー性​​疾患の相関としてローカライズされた血管透過性の再現性のある測定を提供する。ブルー色素血管外漏出を使用することにより、このプロトコルは、可視化およびローカライズされたアレルギー反応の相対的な定量化の両方を可能にします。臨床スコアリングに依存するアレルギーアッセイとは対照的に、（分光光度吸光度によって測定される青色色素の血管外遊出）このアッセイの一次結果は、簡単に観察者バイアスを受けない。もう一つのアドバntage動物が潜在的アレルゲンチャレンジと色素投与によって引き起こされる不快感を制限し、すぐに攻撃後に安楽死させていることである。 ら

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BALB/c マウス	ジャクソン研究所	651
PBS pH 7.4	品質 生物学的製剤	114-058-101
オボアルブミン	Σ	A5503-10G
Imject Alum	Thermo Scientific	77161	使用前によく混ぜる
エバンス ブルー ダイ	シグマ	E2129
ホルムアミド	シグマ	295876	99%+ 分光光度グレード
イソフルラン、USP	フェニックス	NDC 57319-474-06
1cc インスリン注射器	BD	329654
3/10 cc インスリン注射器 31 G 針付き	テルモ	NDC 100861
27 G 針	BD	305109
鉗子	F.S.T.	11000-12
外科用ハサミ	F.S.T.14070-12
5 ml ポリスチレン丸底チューブ	BD ファルコン	352058
1.5 ml マイクロ遠心チューブ	医療用サプライパートナー	15-1151
15 ml コニカルチューブ	BD ファルコン	352097
平底 96 ウェルプレート	Costar	3590
スコッチテープ
RC2< / sup>げっ歯類麻酔システム	VetEquip	922100
Vortex Genie 2	エンティフィックインダストリーズ	SI-0236	モデルG560、3インチプラットフォーム付き