社会回避での定量化のための簡単​​なアッセイキイロショウジョウバエ

サマリー

ここでは、ストレスを受けた個人の回避を定量化するためのプロトコルを提示します。このパラダイムは強力でありながらユーザーフレンドリーであり、Drosophila melanogasterの1種類の社会的相互作用に対する遺伝子と環境の影響を評価するために使用できます。

要約

Drosophila melanogasterは、社会的相互作用のさまざまな側面を研究するための新しいモデルです。たとえば、ハエは、ショウジョウバエストレス臭物質(dSO)として知られるストレス中に放出される臭気物質のために、以前はストレスを受けた同種が占めていた領域を避けます。T迷路装置を使用することで、レスポンダーフライによるdSOの回避を非常に手頃な価格で堅牢なアッセイで定量化することができます。ここでは、強力なパフォーマンスを得るために必要な条件を示します。ハエがdSOを放出するにはストレスの多い経験が必要であり、dSOの存在に対して強力な回避反応を引き起こすのに十分なエミッターハエも必要です。遺伝的背景は、その集団規模ではなく、レスポンダーハエによるdSOの回避を強く変えました。Canton-SとElwoodは、オレゴン株とサマルカンド株よりもdSOの回避において高い性能を示します。この行動アッセイにより、この社会的行動の根底にあるメカニズムの特定が可能になり、dSOの放出と回避の両方に対する遺伝子と環境条件の影響の評価が可能になります。このようなアッセイは、突然変異体の社会的欠陥または関心のある環境条件を同定するために使用される単純な診断テストのバッテリーに含めることができる。

概要

この方法の目的は、容易に求愛と侵略から独立したキイロショウジョウバエにおける単純な社会的行動の新たな側面を定量化することである。

社会的相互作用は、社会の中の個人の適切な発達と健康に重要であるだけでなく、全体としての社会集団の機能性。これらの相互作用の複雑性の高い大規模なサンプルサイズおよび社会的行動の遺伝的及び神経塩基はまだよく理解されて動作の簡略化を可能にするシステムが必要となる。 キイロショウジョウバエの遺伝子を同定するために使用できる強力な遺伝モデルである社会的相互作用の神経基盤。実際、D.キイロは、複雑な社会的行動のレパートリーを持ち、社会のいくつかの直接測定は、すでに^1-7行われている。しかしながら、これらの努力のほとんどは、aggresのような比較的複雑な社会的行動に焦点を当ててきたSIVEの相互作用^3,6、求愛^3,8-12のさまざまな側面、そしてどのように社会的な経験は、学習、または概日リズム^13-17のような他の行動に影響を与えます。また、これらのアッセイの多くは、結果として生じるデータの存在量を分析するためにビデオトラッキングとコンピュータソフトウェアを使用して、ハエの群の複雑な相互作用のパターンを分析に依存する。このような分析は非常に貴重であり、そのようなグループ⁷のフライフライ相互作用の動的などの重要な新しい洞察をもたらす。一つの制限は、しかしながら、一般社会にこれらのアッセイの到達不能などの認識の基礎となるメカニズムの限られた知識である。つまり、一人の個人と他者によるその認識による信号の放射の基礎はまだよく理解されている^18。

D.：これとは対照的に、個人が離れてストレスをハエによって放出された信号から移動するシンプルな行動、社会的な回避を呈するもハエメランストレス匂いやDSO ¹⁹ ogaster。ハイスループットアッセイでは、この動作は、他のハエ、または社会的回避¹⁹によって放射されるストレスシグナルの回避のように定量化することができる。ハエをT迷路装置に入れ、DSOを含むバイアルを回避する選択肢を与えられている。このアッセイを用いて、CO _2は、DSOの成分、および₂ ^19を切開したCOに応答するのに必要な神経回路の一部であることが示された。

ここに提示され、社会的回避アッセイは、概念的に、複雑な振る舞い^20を解剖するために、研究者の世代を有効にシーモア·ベンザーの研究室で開発されたシンプルな行動アッセイに似ています。社会的回避の分析は、社会的行動のより広範な研究を可能にする、T迷路アッセイを用いてコスト効率よく行うことができる。例えば、このアッセイを使用して、我々は最近実証自閉症の異なる遺伝的リスクは、社会的なB内の対照的な効果を有することehaviorアッセイ。自閉症の候補遺伝子についての変異体- ^21,22 neurobeachin - （他の場所で²³を参照）の両方の社会的空間に存在する欠陥および社会的な回避^24。異常なドーパミン作動性シグナル伝達はまた、ヒト^25,26における自閉症の病因に役割を果たすことが提案されている。 neurobeachinで得られた結果とは対照的に、社会的空間を直接VMAT ²⁷のこれらのレベルと相関したが、社会的回避のパフォーマンスは、ドーパミン作動性細胞ショウジョウバエ胞性モノアミン輸送体（VMAT）の増加または減少したレベルによって影響されなかったことを見出した。 neurobeachinとVMATで得られた対照的な結果は、反社会的行動の様々な形態を識別するため、異なる基礎となる神経回路網が他の応答を調節する可能性を強調する。

プロトコル

社内で作成1.機器および試薬（他のためのマテリアルのリストを参照してください）

1. フライ作業を実行するために、ショウジョウバエ冷たい麻酔装置を準備します。
   1. 小さなプラスチックの箱（10.2センチ幅12.7センチ）、ピペットチップボックスの一般的に、トップカバー（3.8センチメートル深い10.2センチ幅12.7センチ）を覆うように多孔質ポリエチレンシートをカット。
   2. 砕いた氷の箱を埋める、多孔性ポリエチレンシートでカバーしています。
2. T-迷路装置を準備します。以前に詳細^28-31に記載された装置を適応させる。
3. ^32は説明したように、フライアスピレーターを準備します。
4. ストレスなくテストバイアルの内外ハエを変位させる走光性応答装置を準備します。
   1. ^29,33に記載されているように、向流装置を使用してください。

^NOTE：28によって記載されるようにT字型迷路はまた、他の目的に使用することができる。

5. HOMを確認してくださいogeneous照明条件は：白ベンチカバーで覆われたベンチに実験を行い、ホワイトボードの前に。
   注：これらの実験のために、使用されるフライ株はショウジョウバエた野生型をキイロ ：カントン-S、オレゴン州とサマルカンドは、私たちの研究室のストックから^34を飛ぶ。エルウッドハエはロングアイランド、ニューヨーク、米国で、ハンチントンのエルウッド周辺に秋2011年に収集した。

2.実験前にハエの準備

実験を行う前に1〜2日：

1. 12時間の明/暗サイクルで25℃における標準コーンミール寒天 - 糖蜜 - 酵母媒体上のハエを維持します。
2. 実験を行うことに1〜2日前に風邪麻酔下のレスポンダハエを収集
   1. 彼らは漏斗を用いて、50ミリリットルファルコンチューブに提起されている中でボトルからハエを転送します。
   2. に、氷のレベルの下のハエでファルコンチューブを置きます絶縁されたアイスバケット。
   3. 冷却するで-4℃、砕いた氷と冷たい麻酔装置を配置します。
   4. ハエは寒さ昏睡を入力するための5分待ちます。
   5. 冷たい麻酔装置の多孔質ポリエチレンシート上にハエを転送します。
   6. 冷たい麻酔装置上​​のレスポンダハエを収集します。 RTで、実体顕微鏡下で、女性のハエから3-7日歳の男性を分離し、40のグループでこれらのハエを維持する。
3. 実験を行うことに1〜2日前にエミッタハエを収集します。
   1. 静かにカントン-S混在セックスはその数をコントロールし、口の吸引器を使用して、彼らのボトルから飛ぶ集める。
   2. 彼らはエミッタであるように、60〜100のグループでこれらのハエを維持します。
   3. データ点は、必要に応じて発光体のように多くのサンプルを準備します。
4. 冷たい麻酔のいずれかの交絡影響を最小化するために、応答者およびエミッタの収集後の回復の少なくとも夜を許可する行動に、口アスピレーターコレクション。
5. 少なくとも1日実験前に、新鮮な空気に置き換えられるように袋に入れて古くなったプラスチック製の香りの空気を可能にするために、テスト用バイアルの袋を開きます。

実験を行う前に、2時間。

6. でも光で、実験が行われる室内の温度は約23-25​​℃であることを確認し、30％の上記の湿度。
7. これらのハエが飢えていないことを確実にするために生鮮食品バイアルに応答者およびエミッタショウジョウバエを転送します。
8. ショウジョウバエは、実験が実行される上のベンチに、2時間の環境に適応してみましょう。

3.ソーシャル回避実験を行うこと

1. Zeitgeber時間ZT5とZT9間午後3〜4時間の範囲で、一日の同じ時刻に、それぞれの実験を行います。
2. ドキドキパッド上でT-迷路を置き、およびtので、ネジクリップを締め彼はエレベーター安定している。
3. 新鮮な試験バイアルにレスポンダハエを転送します。 T-迷路の上部に、レスポンダハエを含むこのバイアルをスナップ。
4. T-迷路装置を傾斜し、ショウジョウバエがエレベーターに落ちるようにドキドキマットの上をタップします。
5. ハエは、T-迷路の上部と下部の間にあるので、ダウンエレベーターの上部に移動しますが、選択点以上のエレベーターを維持するために注意を払う - 逃げるのハエを防ぐために。
6. DSO（以前にハエによって占有されたDSOのないバイアルを生成するために、第5節を参照）のバイアルを取得します。
   1. 応答者のハエは、この新しい環境に適応しているが、試験バイアルにエミッタハエを配置。
   2. ミバエが逃げないように、バイアルを閉じるために綿の部分を置きます。
   3. 15秒間ボルテックスを5秒間ボルテックスからバイアルを取り外し、次のように機械的にミニ渦にこのバイアルを攪拌する。 55秒の合計3回繰り返します。
   4. レム食品バイアルに転送することによって - - エミッタOVE新鮮なバイアルから飛ぶとすぐにT-迷路装置の両側のいずれかにこのDSO満たされたバイアルを置く。
   5. それぞれの新しい目でDSO埋めバイアルの配置の側面を交互に。
7. T-迷路の反対側に新鮮な試験バイアルを置きます。
8. ショウジョウバエは、新鮮な試験バイアルとDSOで試験バイアルの間で選択することができるように、完全にダウンしてエレベーターを持参し、タイマーを開始。
9. 特に断りのない限り、ハエは、1分間、新鮮なバイアルとDSOバイアルのいずれかを選択しましょう​​。
10. 1分後、新鮮なバイアル、DSOバイアル、およびエレベーターの中で立ち往生ものでハエを分離するためにエレベーターを上に移動。
11. 各バイアルにハエの数をカウントし、エレベーターで。
12. 各遺伝子型/条件のためにこれを繰り返します。

4.ソーシャル回避データの分析

1. 各ジュノのための各バイアルにミバエの数を数えYPE、およびスプレッドシートにデータを転送。
2. 表計算プログラムを使用して、DSOのないバイアル中のハエの数からDSOバイアルにハエの数を減算し、その後、ハエの総数で割ることによって、各遺伝子型のための性能指数（PI）を計算する。
3. 結果の分析のための統計解析ソフトを用いてPIは「手段の比較。
   1. 理想的には、各実験のための2-3内部反復、および3つの独立した繰り返しの準備、別のボトルで、異なる日に行わまたは^30を横切る。
   2. データが正規分布に従うように、ガウス分布の統計的検定を使用してください。
   3. 1効果をテストするとき（ すなわち 、密度- 図2）、コントロールにそれぞれの結果を比較するために、（列ごと）の多重比較のための試験後、または単純なt検定で、一方向ANOVAを使用しています。
   4. グループ実験が行われた場合、条件および性別（空のバイアルの両方をテストし、強調Dの未強調したハエ。ジェンダー影響- 図1）は 、双方向ANOVAを使用して。

5.以前はストレスのないハエによって占有バイアルの生成 - その代わりに3.5から3.6の実行

1. コントロールとして、強調されていないハエが占有するバイアルを準備する走光性を使用してください。
2. 試験バイアルにハエを転送し、反対の場所で新鮮な空のバイアルで、向流装置にはめ込みます。
3. 15 W蛍光クール白色光の前で直接遠位バイアルで水平に装置を置き、そして黒の布でカバーしています。
4. ハエが優しく新鮮なバイアルに移動しましょう​​。これには数分かかることがあります。ハエのほとんどは遠位バイアル中の光に向かって歩いていると、1分間のタイマーを起動します。
5. 静かに、黒い布を削除する光の位置を切り替えて、黒い布で回復し、ハエが試験バイアルを残すことができます。
6. その時、私3.2から3.5のように選択肢実験をnitiate。 3.6と3.7をスキップします。
7. 他の側からの試験バイアルを空いたハエを分離するために、装置のスライダを移動します。
8. 3.7のように、選択肢の実験のためにすぐにT-迷路に空いた試験バイアルを使用してください。

結果

ソーシャル回避アッセイは、他のハエによって放出されるストレスシグナル（DSO）を認識するキイロショウジョウバエの能力を定量化する堅牢な試験であるため、社会的相互作用の一つの側面を評価する。このアッセイは、一般に、2つの異なるオプションの選択にハエを提示するT字型迷路、として知られている種々の行動アッセイで使用される装置を用いて行われる-左または右^19,28-31。この場合、ハエはDSOを避けるれる効率は、性能指数（PI）を計算し、比較することにより定​​量される。 100のPIは全てハエがDSOを避けたことを示すゼロのPIは、50-50配布またはまったく回避を示している。 -100のPIは全てハエがDSOバイアル中に入ったことを示すことになる。

ハエは、機械的に撹拌ハエによって放出されたDSO、および1新鮮（DSOフリー）バイアルを含むバイアルされています。代表的な結果は、ここに提示strengtを強調このアッセイの時間だけでなく、最良の結果を得るために必要ないくつかの公知の条件。

D...

ディスカッション

このプロトコルは、社会的な回避アッセイのための詳細な手順を説明します。カントン-Sのみが飛んでいるバイアルを避けることができます以前に機械的に強調されてきた、と応答者のその性別と数は、その社会的な回避性能には影響しません。しかし、応答者の遺伝的背景に大きな影響を有する。

以下では正常にこの実験を実施するためのいくつかの重要なステップです：1）常に実験前にハエの2時間を転送し、その環境を乱さないことを確認してください。 2）概日リズムと運​​動および活動レベルのことが可能で変動にリンク性能のばらつきを低減するために、理想的Zeitgeber時間ZT5（光の発症後の時間）ZT9の間、一日の同じ時間に常に実験を行う。実験を行うとき3）温度と湿度の条件を注意してください。 30パーセント以上の23-25​​℃で、湿度周辺の温度は最高です。 4）ではないからdを確認してくださいT-迷路装置isturbハエの判定時間の間に、 5）少なくとも24時間、それらを使用する前に、新鮮なバイアルを空気に確認してください。 6）実験中は常にT迷路の片側に嗜好を回避するために、T迷路装置における試験バイアル...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ステレオズーム顕微鏡	ニコン	SMZ-645	フライハンドリングのための他の標準的なスコープは動作します
小さなペイントブラシ			フライを押すための
多孔質ポリエチレン、12 "x 12"シート	フライスタッフ - Genesee	46-100	http://www.flystuff.com/ProductInfo.php?productID=46-100 冷たい麻酔ボックス用の多孔質プラスチックシート
ミニアラームタイマー/ストップウォッチ
シャーピーペン
粘着テープ
ミニボルテックス	フィ	ッシャー14-955-151	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail ハエの機械的攪拌には、どんな渦でも機能します。
Corning Life Sciences DL No.:352017, Falcon 試験管; 丸底; 使い捨て; クロージャーなし, 14 ml; 17 x 100 mm	Fisher	14-959-8	http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalogId=29104&productId=2771811&distype=0&highlightProductsItemsFlag=Y&fromSearch=1&searchType=PROD&hasPromo=0 これらは、実験後にバイアルを閉じるために、社内製のT迷路および向流装置(テキストを参照)
コットンボール
三つ折りボードと白いベンチカバー			で、白い背景と均質な光を提供します。
白いベンチカバー
ドキドキパッド			どんなマウスパッドでも機能します。
走光性応答で向流装置を覆う	大きな黒い布
クールな白色光	ホームデポ	1000516563	http://www.homedepot.ca/product/illume-26-fluorescent-plug-in-linear/911423 13-15 Wの蛍光灯電球のクールホワイトを備えた同様の線形ライトが機能します