メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

Summary

DNA及びタンパク質は、配列特異的親和性またはDNAまたはタンパク質トランスフェラーゼおよび合成補因子類似体を用いた蛍光レポーター基で標識される。酵素の補因子特異​​性に応じて、アジリジンまたは二活性化補助因子アナログは、一次元または二段階標識のために用いられる。

Abstract

S -Adenosyl -1-メチオニンメチオニン（AdoMetまたはSAM）依存性メチルトランスフェラーゼ（MTアーゼ）、DNA、RNA、タンパク質および小生体分子の特定の位置にあるAdoMetから活性化メチル基の転移を触媒する。この天然のメチル化反応は、補因子の合成類似体を用いてアルキル化反応の多種多様に拡張することができる。アジリジン環とのAdoMetの反応性のスルホニウム中心の交換は、様々なDNAメチルトランスフェラーゼによって、DNAと結合することができる補因子につながる。これらのアジリジン補助因子は、アデニン部分の異なる位置にレポーター基を搭載し、 私は DNA（笑顔DNA） のLアベルのINGを nduced ethyltransferase- のS equence固有のMのために使用することができる。典型的な例として、我々は、DNA MTアーゼM.BseCIとアジリジン補助因子6BAzのある5'-ATCG A T-3 '配列でpBR322プラスミドDNAのビオチン化のためのプロトコルを与える1ステップ。 ctivated Gの roups（MTAG） のm個のethyltransferase指向Tの ransferのために使用されるのAdoMet類似体の別のクラスの不飽和アルキル基の結果と活性化されたメチル基の拡張。拡張された側鎖はスルホニウム中心と不飽和結合によって活性化されるので、これらの補因子は、二重活性化のAdoMet類似体と呼ばれる。これらの類似体アジリジン補因子のようなDNAメチルトランスフェラーゼのための補因子としての機能だけでなく、RNA、タンパク質および小分子MTアーゼのみならず。これらは、典型的には、第2の化学工程でレポーター基で標識されているユニークな官能基を有するMTアーゼ基質の酵素的修飾に使用される。これは、ヒストンH3タンパク質の蛍光標識のためのプロトコルに例示されている。小さなプロパルギル基はのクリックラベルに続いてヒストンH3リジン4（H3K4）MTアーゼSET7 / 9によってタンパク質に補因子アナログSeAdoYnから転送されるTAMRAアジドとアルキニル化ヒストンH3。補因子類縁体とMTアーゼ媒介ラベリングは、識別とMTアーゼ基質の機能的研究ならびにDNAジェノタイピングとメチル化検出を含む多くのエキサイティングなアプリケーションを可能にする技術である。

Introduction

核酸^、1,2およびタンパク質^3,4の特異的な標識は、機能の特徴付け、医療診断及び（ナノ）バイオテクノロジーのための主要な関心事である。ここでは、S -adenosyl-L-メチオニン（AdoMetをまたはSAM）依存性メチルトランスフェラーゼ（MTアーゼ）に基づいており、これらの生体高分子のための酵素標識法を提示する。このクラスの酵素（EC 2.1.1。）は、核酸およびタンパク質の特定の残基の中の個々の求核位置（窒素、酸素、硫黄および炭素原子）を標的と自然補因子のAdoMet（ 図^1A）5の活性化メチル基を転移する。また、MTアーゼは、親和性タグ、蛍光団又は他の標識（ 図^1B）6との特異的標識のための合成補因子類縁体を利用することができます。のAdoMet類似体の2つのクラスが開発されてきた：Sの equence固有のM ethyltransferase-ためのアジリジン補助因子を私が Lのアベルる （笑顔^）7とctivated のG roups のM ethyltransferase指向性T ransf....

Protocol

1.一般手順

1. ストアアジリジン補助因子（DMSO中）6BAzとタンパク質MTアーゼ-80℃でSET7 / 9と二重活性化補助因子SeAdoYnとDNA MTアーゼM.BseCI -20℃（50％グリセロール）を含むすべての他の試薬。
2. 脱イオン水に吸光係数_ε269nmで （6BAz）= 16000センチメートル^-1 M ^-1および_ε260nmの （SeAdoYn）= 15400センチメートル^-1 M ^-1用いたUV /可視分光法を経由して 6BAzとSeAdoYnの濃度を決定する。吸光係数は、280nmでの直接吸収を介して利用可能である場合には、ブラッドフォードアッセイによってMTアーゼの濃度を決定するか。
3. 酵素活性の損失を防ぐために、集中的なペッティングまたはボルテックスにより気泡を作成しないようにしてください。その代わりに、優しく上下にピペッティングにより混合します。
4. DMSO中のストック溶液からアジリジン補助因子を追加する場合はアッセイにおける最終DMSO濃度は低いことを確認してください5％未満。常にDNAとの非特異的反応を防止するアッセイ緩​​衝液中の10mMのマグネシウムイオンが挙げられる。
5. 酸性のストック溶液から二重に活性化補助因子を追加する場合はpH変化を回避し....

Results

アジリジン補因子を介したDNAのワンステップラベリング

この例では、反応は、二本鎖の5'-ATCG A T-3 '配列内の第2のアデニン残基を変更し、pBR322プラスミド（ 図4A）上の1つの認識部位を持つDNA MTアーゼM.BseCI、を用いて行われる。プラスミド標識をテストするために、pBR322の制限エンドヌクレアーゼ（REase）R.TaqI（5'-TCGA-3 '）を用いてチャレンジされる。 R.TaqIはM.BseCIサイトに含まれているそのうちの一つのpBR322に7拠点を持っています。ラベリングが発生した場合は、M.BseCIサイトが切断および683塩基対（bp）との新しいフラグメントから保護される2つの他のフラグメントが消えている間（315と368 bp）を形成することになる。もちろん、対応する認識配列を有する他のDNAメチルトランスフェラーゼ異なるREasesにDNA標識を分析する際に使用すべきである。

Discussion

のDNA MTアーゼおよびアジリジン補助因子（笑顔DNA）を用いたDNAのワンステップ標識は堅牢な方法であるが、実験を計画する際にいくつかの側面を考慮すべきである。

アジリジン補助因子：M.BseCIとDNA標識用6BAz濃度は60であった。他のDNAメチルトランスフェラーゼを使用する場合は補因子の濃度は、20μMのがDNA MTアーゼM.TaqI ¹⁹で採用されていると低い例えば濃度を最適化する必要があります。低6BAz濃度は、ストレプトアビジン4倍過剰（アッセイにおけるビオチンの全体量に対する結合部位）を直接EMSAにより分析を妨害することなくREaseとのインキュベーション後に添加することができるという利点を有する。そうでない場合は、ビオチン化DNAを過剰補因子を除去し、アガロースゲル電気泳動の間にDNAの汚れを避けるために、精製されるべきである。 DMSO中のストック溶液からアジリジン補助因子を追加する場合ていることを確認し番目の最終DMSO濃度電子アッセイは、5％未満である。あまりにも多くのDMSOの酵素を不活性.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6BAz			Weinhold et al.、特許番号US 8,129,106、2012年3月6日公開に従って合成。
β-メルカプトエタノール	Serva	28625
酢酸	Fisher Scientific	10304980
アクリルアミド/Bis Solution, 37.5:1	Serva	10688
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100
Ammonium Persulfate (APS)	Serva	13375
Bis-Tris	Gerbu	1304
ホウ酸	Gerbu	1115
ブロモフェノールブルー Na塩	Serva	15375
硫酸銅(II)	Aldrich	C1297
クロロホル	ム フィッシャー サイエンティフィック	10020090
クーマシー ブリリアントブルー	Serva	17525
EDTA二ナトリウム塩	Gerbu	1034
エタノール	メルク	100983
ゲルレッド (10,000x 水)	ビオチウム	41003
グリセロール (99.5%)	Gerbu	2006
FastRuler Low Range DNA Ladder	Thermo Scientific	SM1103
Histone H3			Philipp Voigt博士とDanny Reinberg教授から得られた発現プラスミド。T. J. Richmondら、J. Mol. Biol. 1997、272、301-311による発現および単離。
M.BseCI			Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	10675112
塩化マグネシウム  六水和物	J.T. Baker	4003
MOPS	Gerbu	1081
塩化ナトリウム	Gerbu	1112
pHストリップ (中性)	メルク	1,095,330,001
pBR322	Thermo Scientific	SD0041
R.TaqI (10 u/µl)	Willnow	ER0671
SeAdoYn			。
Set7/9			ダニー・ラインバーグ教授から得られた発現プラスミド、D. Reinbergらによる発現と単離、Genes Dev.2002、16、479-489。
ストレプトアビジン	Gerbu	3058
(+)-ナトリウム L-アスコルビン酸	Sigma Life Science	A7631
SDS 粒状	Gerbu	1833
二-リン酸水素ナトリウム	Merck	106,586
TAMRA アジド			参考文献30に従って合成: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.
TaqI バッファー (10x)	Thermo Scientific	B28
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Acros Organics	42058
Tris-HCl	Gerbu	1028
Tris-X (TRIS-base)	Gerbu	1018
Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)	Sigma-Aldrich	762342