マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

Summary

エキソサイトーシスの後、融合した原形質膜はエンドサイトーシスとして知られるプロセスを通じて回収されます。このメカニズムは、次の放出ラウンドのために新しいシナプス小胞を再構築します。個々のエンドサイトーシスイベントは、マウス副腎クロム親和性細胞の細胞付着容量記録を使用して捕捉および分析されます。

Abstract

ニューロンの伝達は、脳内の細胞コミュニケーションの不可欠な部分です。シナプス前膜の脱分極は、シナプス伝達を媒介するエキソサイトーシスとして知られる小胞融合につながります。その後のシナプス小胞の回収は、エンドサイトーシスとして同定されたプロセスで新しい神経伝達物質で満たされた小胞を生成するために必要です。エキソサイトーシス中、小胞膜を融合すると表面積が増加し、その後のエンドサイトーシスでは表面積が減少します。ここでは、私たちの研究室では、マウス副腎クロム親和性細胞における単一のエンドサイトーシスイベントの細胞付着容量記録の基本的な紹介を示しています。このタイプの電気記録は、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスを単一小胞レベルで高解像度で記録するのに役立ちます。この手法は小胞エキソサイトーシスとエンドサイトーシスの両方を検出できますが、私たちの研究室の焦点は小胞エンドサイトーシスです。さらに、この技術により、単一のエンドサイトーシスイベントの動力学を分析できます。ここでは、マウス副腎組織解剖の方法、クロム親和性細胞培養、基本的な細胞付着技術、およびその後の特異なエンドサイトーシスイベントを測定する個々のトレースの例について説明します。

Introduction

シナプス伝達は、神経伝達物質を含むシナプス小胞のエキソサイトーシスによって媒介され、これらの小胞は、長期的にはニューロンの通信を維持する神経末端内のローカルエンドサイトーシスのリサイクルを受けなければならない。脳内のシナプス伝達の重要な役割を考えると、シナプス小胞サイクルを構成している分子機構を理解することは、全体としてセルラ通信でより良い理解に向けて不可欠な基盤である。細胞モデル系の中では、副腎髄質細胞は、シナプス小胞のリサイクルの根底にある分子機構に最も決定的な洞察のいくつかを提供してきました。エキソサイトーシス、神経伝達物質放出の最終段階は、非常に学び、副腎クロマフィン細胞^1,2を使用することによって検討されている。実際には、分泌顆粒の形成、ターゲティング、ドッキングおよび融合を調整する分子の選手のほとんどが原因のdivの適用に同定されているクロマフィン細胞¹におけるERSEテクニック。さらに、エキソサイトーシスに関与するタンパク質合成機構の単一小胞の解決を可能にする機会を提供することにより、クロム親和性細胞は、小胞融合³の問題に対処するための強力なモデルのままです。

細胞結合型の静電容量の測定は、第³エキソサイトーシスの間に単一小胞の融合を解決に利用した。直径60nmのセル接続構成^4-7のパッチクランプ技術を用いて細胞膜アドミタンス測定によって検出されることが....

Protocol

注：イリノイ大学シカゴ校の動物実験委員会によって承認された全体の手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施した。

1。ソリューションおよび培養培地の準備

1. 6ヶ月までのために-20℃で、すべてのソリューションにしてください。 3ヶ月まで4℃で培養培地にしてく​​ださい。
2. DMEM中で100mlにITSX（インスリン - トランスフェリン - セレンサプリメント）1ペン連鎖球菌溶液および1ミリリットルを混合することにより、培養培地100mlのを準備します。
3. 100のCaCl _2、および50mM EDTAを2.5ミリリットルの2.5ミリリットル、250ミリリットルのDMEMを混合して酵素溶液を調製します。
4. DMEMを225ミリリットル、FBSを25ミリリットル、アルブミン625 mg及び625 mgのトリプシン阻害剤を混合して不活性化溶液を調製する。
5. 154のNaCl、5.6のKCl、5.0mMのHEPES、3.6 mMの炭酸水素ナトリウム、5.6 mMグルコースのロックのソリューションを準備します。 NaOHで7.3にpHを調整する。
6. 50 mg / mlののポリ-D-リジン（PDL）溶液を調製する。被覆カバースリップに1mg / mlの最終濃度を使用する。
7. 140mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl ....

Results

細胞生存率およびギガオームのシールの質は、細胞結合型静電容量記録の品質を決定する上で重要である。したがって、前の電気生理学的記録に効果的かつ効率的な細胞培養を調達することが重要であり、典型的な生細胞は、 図1に示されている。練習時間が高品質でギガオームのシールを達成するのに役立つであろう。プロトコルステップ5.3で説明したようにパッチピペットが細胞に近づいたときに一つは、明らかに、細胞の変形を見ることができれば、高品質のシールを得るための良いチャンスがある。 図3は、関連する複数の下向きステップで膜キャパシタンスの典型的な記録を実証単一小胞エンドサイトーシス。

実行可能なマウスの副腎髄質細胞の図1の例細胞培養24時間後。3の生クロマフィン細胞に矢印ポイント。

Discussion

セルに接続された静電容量測定に成功し、高品質での録音を得るためには、いくつかの重要なステップが必要です：副腎から調製1）生存し、健康な細胞;カバースリップの2）、PDLコーティング; 3）ギガオームシール形成; 4）システムのノイズレベル;および5）位相補正。

動物を手術のために、一つは、潜在的な修正は、最も適した器用に外科的アプローチを調整し、解剖時の損傷を防止することである。電気生理学的記録のために利用される細胞は、副腎髄質からのみ来るように加えて、検索および副腎の除去に十分な練習が不可欠です。酵素消化のためには、5％のCO ₂ + 95％O ₂で溶液をバブリングして酵素溶液を平衡化することが重要である。シリンダに接続チューブは漏れで十分とタイトであることを確信すること。また、必ずその目的の私n個の溶液を適切に全体の15分バブリング時間の間に置かれる。これは、適切に空気流を向けるようにチューブの端部で平滑化された20 G針先端を配置することで達成することができる。また、このステップの追加の時間があれば、空気の流れがチューブ内の溶液をオ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ポリ-D-リジン	シグマ	P0899
DMEM		15066024	紫外線ダル
ベッコを防げます修正イーグルミディアム	ライフテクノロジー
カバーガラス	カロライナバイオロ	カル633029	12mm
ペニシリンストレプトマイシン	ライフサイエンステクノロジー	15140122	100ml
インスリントランスセルX	ライフテクノロジー	51500056	ICEでのみ解凍!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus パッチアンプ	HEKA
BNC-2090 データ収集ボード	National Instruments
Igor データ収集ソフトウェア	Wavemetrics
P-97 ピペットプーラー	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
ホウケイ酸ガラス毛細管Sutter	器械	B150-110-10	外径:1.5 mm 内径:1.10 mm 長さ: 10 cm