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方法論記事

マラリア蚊の開発、産卵および生存者にエピジェネティック薬の試験に及ぼす影響のために毒物学的アッセイ

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DOI:

10.3791/52041

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2015年1月16日

 ,  , 
1Department of Entomology, Virginia Tech

この記事について

サマリー

蚊の発生、繁殖力、生存率に対するエピジェネティックな薬DZNepの効果を調べるためのプロトコルが開発されました。 ここでは、未成熟の蚊へのDZNepの水性曝露と、SAH加水分解酵素阻害の測定に加えて、成虫の蚊へのDZNepの血液ベースの曝露の手順について説明します。

要約

殺虫剤耐性マラリア制御プログラムの主要な問題を提起する。蚊はマラリアは熱帯諸国で遍在する問題を制御すること、すぐに環境の変化の広い範囲に適応させる。殺虫剤抵抗性の集団の出現は、媒介蚊の制御のための新規薬剤標的経路及び化合物の探索を保証します。エピジェネティック薬はよくしかし多くの昆虫への影響について知られていない、がん研究に確立されている。この研究は、マラリア媒介、 ハマダラカに、3-デアザネプラノシンA（DZNep）、癌治療のための実験的なエピジェネティック薬の毒性効果を調べるための単純なプロトコルを提供します。化合物は、治療を制御するために相対的な成体の蚊の繁殖を減少に対し、死亡率およびサイズ​​の減少の濃度依存的増加が、DZNepに露出未熟蚊で観察された。また、S中の薬物依存的な減少があった-治療を制御するためDZNepの相対への曝露後に蚊におけるアデノシル（SAH）加水分解酵素活性。これらのプロトコルは、順番に、水溶性のエピジェネティック薬または化合物の毒性効果を探索するためのユニークな多面的なアプローチを実証し、実験的な薬剤に対して複数の毒性学的エンドポイントを評価するためのシンプルな、ステップバイステップの手順で研究者を提供し、媒介蚊や他の昆虫に対する関心。

概要

マラリアは世界で昆虫関連死亡の最大数を担当しています。推定2.19億例は、主にアフリカ1において約66万人が死亡、その結果、世界中で毎年起こる。協調した努力にもかかわらず、マラリアプログラムはいくつかの課題に直面しています。殺虫扱わ蚊帳とプログラムの屋内残留噴霧フォームキーコンポーネントが、地元住民の殺虫剤抵抗性は、これらの取り組み2を妨げる。殺虫剤抵抗性の蚊の個体数の急速な増加は、主に彼らの環境の変化に迅速に適応し、異なるニッチ3,4,5を悪用するマラリア蚊の能力に起因する。殺虫剤抵抗性の既存のメカニズムを克服するために、新規殺虫剤の目標と次の世代の化合物の探索が保証されています。マラリアmの様々なライフステージに実験的な殺虫剤の有効性を決定するための簡単​​な、ステップバイステップのプロトコルosquitoesが大幅にこれらの取り組みを強化するだろう。

細胞株および動物モデルでの薬物作用の薬理学的研究は、細胞および生物の遺伝学と生理学を調節するために有用なツールとしてのエピジェネティックな薬の使用を確立している。 DNAメチル化およびヒストン修飾は、基礎となるDNA配列6を変更することなく、多細胞生物における遺伝子発現に影響を与える2つのエピジェネティックなメカニズムである。メチル化などの翻訳後修飾は、細胞の完全性および遺伝子発現を維持する上で重要な役割を果たし、7,8,9、いくつかの基本的なプロセスに影響を与え得る。いくつかの昆虫種の研究は、卵形成を含むプロセスにおいてエピジェネティクスの重要性を強調し、細胞維持10と同様に、投与量補償11幹いる。しかし、病気のベクターにおけるそのような態様は、まだ調査されるべきである。蚊にこのシステムを調節する化合物を使用することで私たちを提供することができ新規殺虫剤のターゲット経路にスポット。 3-デアザネプラノシンA（DZNep）は、種々のタイプの癌への影響が12,13,14,15,16が研究されている既知のヒストンメチル化阻害剤である。 DZNepは間接的に、ヒストンのリジンのN -メチルトランスフェラーゼを阻害する安定な水溶性エピジェネティック薬（EZH2）、哺乳動物細胞におけるポリコーム抑制複合体2（PRC2）のコンポーネントです。 PRC2は、多細胞生物における幹細胞の増殖の調節において重要な役割を果たし、ヒストンメチル化はPRC2媒介遺伝子サイレンシングの重要な側面である。免疫不全マウスでは、DZNepで前処理した細胞は、17以下で腫瘍形成性であることが示されている。この薬剤は、EZH2が18関与する非アルコール性脂肪肝疾患などの他の疾患を研究するために使用されるようになっている。 DZNep、確立されたのS -adenosylhomocysteine（SAH）加水分解酵素阻害剤19、20である。におけるSAH加水分解酵素の阻害SAHの蓄積と、今度は、利用可能なメチル供与基を制限することにより、メチルトランスフェラーゼ活性の阻害をもたらす。 SAHは、その代謝経路において昆虫を含む多くの生物によって利用されるアミノ酸誘導体である。最近の研究では、低用量でDZNepは休眠に影響を与え、昆虫21での開発を遅らせる可能性があることを示している。

ここで、蚊の様々なライフステージ上の水溶性化合物の効果を調査するための堅牢なプロトコルが開発されている。このプロトコルの3つの部分が未熟蚊、成人の血液供給用メス、および成体雄および雌の蚊の酵素活性に対する水溶性化合物の効果を検査するための命令を含む。まず、DZNep未熟蚊の発達および生存を研究するために水に溶解する。これは、薬物曝露の10倍の増加から生じる差異を比較するためつの濃度で行われる。大人のメスの蚊に対する薬物の効果を調べるために、DZNep除細動ヒツジ血液に添加し、雌に人工的に血液が供給される。続いて、繁​​殖力に対する薬物の結果を検討する。最終的に、酵素活性アッセイは、成体雄および雌の蚊におけるSAH加水分解酵素阻害に対するDZNepの効果を決定する指標として、5,5'-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）を使用して実行される。このプロトコルは、マラリア蚊、 ハマダラカで開発されているが、それは容易に蚊や他の昆虫の任意の種における目的の化合物の効果を研究に適合させることができる。このプロトコルで詳述の技術は、効率的に水または水性媒体中で限られた、または全く溶解度を有する薬剤に適用されない場合があります。

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プロトコル

注：プロトコルの3つの部分幼虫蚊、繁殖力の効果を研究するための雌成虫に対するDZNepの血液ベース露光DZNep薬物の水性曝露を記述し、DZNepによるSAH加水分解酵素の阻害は、単純な比色法を用いて測定。これらのアッセイの概略図を図1に示されている。

1.未熟モスキート開発·サバイバーシップアッセイ

注：このセクションでは、蚊の幼虫の発達と生存に影響を与える水溶性薬物の使用を説明しています。

  1. ハッチA. 28℃でのハマダラカの卵蒸留水（DH 2 O）で2 回目の幼虫にリアそれらを。
  2. 6ウェルDNアーゼ、RNアーゼを含まない細胞培養プレートを取り、各ウェルに10ミリリットルのdH 2 Oに注ぐ。
  3. 2 番目の齢で蚊の幼虫を選択して、ウェル当たり15の幼虫を追加します。プレートに第 2齢幼虫を追加する前に、P過剰の水を除去するために2-3秒間ペーパータオル上にUT。
  4. 実験をランダム化するために色分けされたテープでラベルの井戸。各プレート上の試験濃度につきラベル2のウェル（ 図2）。
  5. のdH 2 O 1ml中に0.3mgのDZNepを溶解して1mMのDZNep塩酸塩（MW = 298.73）ストック溶液を調製し0.5μMおよび5.0μMの最終濃度を達成するために標識ウェルにDZNep.HClの原液を追加します。
    注：ストック溶液は4で保存することができる °短期間のためのC（月に1日）または-20 長期（1ヶ月より長い）のため°C。
    注：上記の濃度原液の添加はかなり井戸の水の体積を変更しません。しかし、より高い濃度の場合には、化合物の任意の不必要な希釈を避けるために、幼虫の培地中で化合物を溶解することが望ましい。
  6. 各ウェルにフレーク魚の餌を等量加える。プレートカバーsおよび28でそれらをインキュベートする インキュベーター内のC°。
  7. 24時間の曝露期間後のDZNep処理および未処理幼虫蚊の死亡を記録します。デッド幼虫を削除し、捨てる。すべての幼虫が死ぬか、蛹になると大人として浮上するまで、毎日この録音を繰り返します。それらは蛹化まで、幼虫のサイズ二日毎、 すなわち、0日目、2、4、6、8を記録する。
  8. 十分な統計分析ソフトウェアを使用して幼虫の発育と死亡率のデータを分析します。
    注：棒グラフは、Microsoft Excelの死亡率データを表すために使用することができる。多変量分散分析（MANOVA）は、JMPやSPSSなどのソフトウェアを用いて行っ蚊の幼虫の有意差が生存中の薬物の結果、異なる用量の場合、明らかになります。

メスの蚊に人工フィーダーを通して薬物を投与2.産卵検定

注：このセクションでは、血液aに薬物を添加詳細ndは人工フィーダシステムを使用して、成体雌の蚊に給餌。

  1. 対照および試験ケージのためのオスとメスの蚊の数と同じ数を持つ大人の蚊のケージを設定します。メスまで両方のケージにコットンボールに浸し、10％の糖液を提供する（3〜5日はハマダラカのために最適です）供給するための準備ができている。
  2. 血液供給に先立って2時間、女性は空腹であることを確認するためにコットンボールを削除します。
  3. 反転した幅広の底ガラス漏斗（直径= 50ミリメートル、長さ= 70ミリメートル）と産業接着剤で密封し、周囲のプラスチックで構成されて2つの人工血液フィーダーを組み立てます。流入と水の流出用のコネクタを介して2つのフィーダ「アウトレット（直径= 10ミリメートル）にプラスチックチューブ（直径= 7 mm）を取り付けます。 「コントロール」と、2つのフィーダをラベル「5μMDZNep。」
  4. 市販の発熱体を使用すると、給餌のためのプログラムを設定。 「メニュー」の「設定」に進みます。と「セットポイント」を選択します。プリロード·プログラムが表示されます。 「SP1」を選択し、37のための温度を設定する °C。
    注：発熱体を投与血液が一定の温度に維持されることを保証する。追加プログラムの設定は、別の蚊や虫の種のために使用することができる。
  5. 水でバケツを記入し、水の中に発熱体を浸す。
  6. パラフィルムの正方形の一枚（50ミリメートル×50 mm）をカットし、薄い膜状のフィルムを作ってそれを伸ばす。パラフィルム人工フィーダの下部をカバーしています。パラフィルム（50ミリメートル×10ミリメートル）の別の部分をカット、それを伸ばし、フィーダのエッジをシールする。
  7. 管によってフィーダと発熱体を接続し、システムを組み立てます。完了すると、システムのスイッチを入れると、「SP1」を選択します。プレスシステムを起動するために "Enter"を。
    注：水が37に加熱した取得します C°、その温度で維持した。
  8. 目のモニター水バケツで温度計を用いて水の電子温度。
    注：コネクタおよびチューブは、血液の温度は37のままであるように、システムを通る水の一定の循環を維持するのを助ける °C。
  9. すべての血液の流出を除染するために使用される10％の漂白剤溶液との平底トレイを記入してください。
  10. マイクロ遠心チューブに除細動羊の血液の2ミリリットルを追加します。 「コントロール」としてラベルを付けます。静かにそれを数回反転させることにより、血液や薬剤を混ぜて "5μMDZNep」と記された実験的なチューブに（ステップ1.5を参照）" 5μMDZNep「DZNep原液の.Add 6μLとしてラベル実験的なチューブのためのプロセスを繰り返します。 RTでチューブ10分間インキュベート。
  11. ピペットを用いて、それに応じてラベルフィーダの先頭に制御し、試験血液を2ミリリットルを追加します。漂白剤溶液中にピペットを捨てる。暗い袋でケージをカバーし、Fを奨励するために定期的にケージに空気を吸う供給のためemales。
  12. 蚊が約30分間食べてみましょう。送りが完了すると、フィーダを取り出し、加熱素子のスイッチを切り、パラフィルムストリップ。約5分間漂白溶液中でフィーダーを浸し、脱イオン水で十分にすすぐ。
  13. フィーダを取り外し、48時間ケージに砂糖水でコットンボールを置く。産卵を促進するために一晩ケージ内で水とろ紙を含む卵料理を置きます。それぞれの試験または対照濃度の各卵料理にラベルを付けます。
  14. 翌日卵料理を取り外し、ステレオ顕微鏡下で卵の数と構造を調べる。 Q-colors5ソフトウェアを使用して画像を得る。卵の数を数えます。試験および対照ケージから得た卵の数の差を分析します。
    注：対応のないt検定は、卵の数は、（ページ≤0.05）有意に異なるかどうかを決定するために使用することができる。

モスキート酵素阻害3.生化学分析薬物による

注：このセクションでは、成人男性と女性の蚊におけるSAH加水分解酵素阻害に対するDZNepの効果を測定するための指標としてDTNBを用いた酵素活性アッセイを説明しています。

  1. のdH 2 Oを1Lにし、Na 2 HPO 4の14.19グラムを添加することによって、0.1MのNa 2 HPO 4（二塩基性リン酸ナトリウム）溶液を調製次に、のdH 2 Oを1LにのNaH 2 PO 4の13.79グラムを添加することによって、0.1MのNaH 2 PO 4（一塩基性リン酸ナトリウム）溶液を調製
  2. pHを8.5に0.1 MのNaH 2 PO 4溶液を用いて、0.1MのNa 2 HPO 4溶液を滴定する。
    注：これは、0.1MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中のワーキングストック溶液になります。
  3. 0.3％トリトンX-100を添加することにより、0.1MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の均質溶液を調製する。
    NOTE：均質化溶液は、4℃。で保存することができる。
  4. PRepare 0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の10ミリリットルでSAHの6.15ミリグラムを溶解することによって、1.6 mMのSAH（MW = 384.4）ソリューション。
  5. 0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中の10ミリリットルでDTNBの6.3 mgの溶解して1.6 mMのDTNB（MW = 396.4）溶液を調製する。使用するまで氷上で新鮮なDTNBソリューションを保管してください。
  6. 1ミリリットルのdH 2 OにDZNepの0.3 mgの溶解して1mMのDZNep.HCl（MW = 298.73）溶液を調製次に、のdH 2 Oで0.002μM、1,000μMから一連の濃度に1mMのDZNep溶液を希釈
  7. DZNepによってSAH加水分解酵素の阻害を測定するために、蚊の粗酵素抽出液を調製し、0.3％トリトンX-を含む、氷冷した0.1 MのNaH 2 PO 4（pH8.5）中の1mlの10非血液給電成体の蚊をホモジナイズ100、ガラス組織ホモジナイザーを使用して。 1.5ミリリットルの微量遠心チューブにホモジネートを転送します。
  8. 4℃で万×gで5分間ホモジネートを遠心。クリーンに上清を移し1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ。 SAH生化学分析のための酵素源として上清を使用してください。
  9. 空白の治療（ すなわち 、DZNep、酵素なし）の場合、50μlの1.6 mMのSAH、96ウェルの個々のウェルに50μlの1.6 mMのDTNB、および100μlの0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5の）を追加、平底マイクロプレート。
  10. コントロール（ すなわち 、DZNep）のために、個々に50μlの1.6 mMのSAH、50μlの1.6 mMのDTNB、50μlの0.1 MのNa 2 HPO 4（pH8.5）中と50μlの酵素（粗抽出物から得SAH加水分解酵素）を追加井戸。
  11. DZNepトリートメントには、50μlの1.6 mMのSAH、50μlの1.6 mMのDTNB、50μlの酵素と個々のウェルにDZNep濃度選択した50μlを添加する。治療群と対照あたり4回の反復を準備します。
  12. 96ウェルマイクロプレートリーダーを用いて20秒間隔で5分間、405nmでSAH酵素サンプルの光学密度（OD）を読み取る。
  13. 制御AからブランクODを引きND治療ODは各ウェルから得た。以下の式を用いてSAH加水分解酵素活性の残存率の計算：％残留活性=（処置OD /対照OD）×100。

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結果

図1は、アッセイの略図である。それはこの資料に記載されている手順のさまざまな手順について説明します。プロトコルは蚊の異なるライフステージに基づいているように、ここで詳細な実験のために、次にすべき特定のシーケンスはありません。ユーザは、サンプルの可用性に依存して、同時に、1つ又は複数のアッセイを実施することを選択することができる。

図2は、未成熟な蚊の開発と生存アッセイのためにセットアップするプレートを示しています。試験濃度及び反復の数は、ユーザの要件および薬物のアベイラビリティに応じて変更することができる。未熟蚊アッセイのために、DZNepの1mMストック溶液は、0.5μMおよび薬物を含まない集団を含有するウェルを有する対照パンと一緒に5μMの最終濃度を達成するために蚊を含む水に添加した。実験は、その多くの幼虫と蛹survを実証したDZNep処理したウェルにおけるよりも対照ウェルにived。

図3は、

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ディスカッション

このプロトコルの適用が成功に不可欠ないくつかのステップがあります。幼虫のアッセイのために、注意が正しくラベルを付け、各試験濃度を複製するために注意が必要です。試験サンプルをランダム化し、それぞれの試験ウェルに薬物の所定量を添加して設定し、この実験の重要な部分である。 96ウェルマイクロプレートに第 2齢蚊の幼虫を追加する前に、それぞれの幼虫は、過剰の水を除去するために2-3秒間ペーパータオルを置くことができる。乾燥を防ぐために、幼虫はすぐに鉗子の鈍ペアを使用してマイクロプレートウェルに転送する必要があります。これは、各ウェルマイクロプレート中の水の体積を確保し、意図したように、薬物の濃度が残る。自分の体の長さを測定するために、幼虫を転送する場合には、静止して維持するために、数分間氷上で幼虫を置くことが推奨される。異なる化合物は、このプロトコルを適応させる際に、注意が各々に加えストック溶液の量を決定するために注意が必要うまく。このような場合には、直前に各ウェルマイクロプレートに幼虫を添加する水の中の化合物の計算された量を溶解するのに良いかもしれない。

吸血アッセ...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

DZNep.HClを提供してくださったVictor Marquezさんと、血液送り装置を製造してくださったScotty Bollingさんに感謝します。An. gambiaeのMopti株とSUA2La株は、Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4)から入手しました。この研究は、フラリン生命科学研究所と国立衛生研究所1R21AI094289からIgor V. Sharakhovへの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェルマイクロプレートフィッシャーサイエンティフィック12565561
細胞培養プレートCytoOneCC7682-7506
遠心分離機Sorvall Fresco76003758異なる遠心分離機を使用することができます
カラーテープロールフィッシャーS68134
解剖顕微鏡オリンパスSZ
DTNBシグマ アルドリッチD8130
DZNep.HClシグマ アルドリッチSMLO305
卵皿 カップ
濾紙フィッシャー09-795E
ガラスフィーダーバージニア工科大学
ガラス組織ホモジナイザー
発熱体フィッシャー サイエンティフィックNC0520091
インキュベーターパーシバル科学I36VLC8別のインキュベーターを使用することができます
マイクロ遠心チューブ、2 mlAxygen22-283
微量遠心チューブ、1.5 mlAxygenMCT-150-C
マイクロピペットエッペンドルフ4910 000.069
Na2HPO4Fisher ScientificM-3154
NaH2PO4Fisher ScientificM-8643
pH meter メトラー・トレド 7easyS20
プレート リーダーSpectramaxM2
SAHSigma AldrichA9384ストア -20 °C
トリトン X-100シグマ アルドリッチT8787

参考文献

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