胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

サマリー

このプロトコルでは、マウスとヒトの胚性幹細胞の両方からの心前駆細胞の誘導が説明されます。このプロトコールの主な戦略は、胚性幹細胞株に改変された蛍光レポーターを使用して、フローサイトメトリーで心前駆細胞を濃縮することです。

要約

心筋細胞(CPC)は、心筋細胞、平滑筋細胞(SMC)、内皮細胞に分化する能力を持ち、心臓病に対する細胞治療に大きな期待を寄せています。CPCを単離する様々な方法の中でも、ESCは無限の細胞源を提供できるため、胚性幹細胞(ESC)のCPCへの分化は現場で大きな注目を集めています。その結果、ESCからCPCを導出するための多くの戦略が開発されてきました。このプロトコルでは、マウスとヒトの両方のESCからの胚性CPCの分化と精製について説明します。細胞表面マーカーを使用して胚性CPCを単離することは困難であるため、ESCはCPC特異的なcreリコンビナーゼ発現によって活性化される蛍光レポーターを使用して操作されます。したがって、CPCは蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって濃縮できます。このプロトコルは、CPCの仕様と濃縮のためにESCから胚様体(EB)を形成する手順を示しています。単離されたCPCは、その後、心臓系譜の分化やその他の生物学的アッセイのために培養することができます。このプロトコルは、マウスとヒトの両方のESCからCPCを堅牢かつ効率的に導出するために最適化されています。

概要

心臓疾患は、今日の世界で主要な原因のままであり、死亡率は、過去20年間（米国心臓協会）に事実上変わっていない。効果的に、心不全を予防または逆転するための新規な治療戦略を開発するための重要な必要性がある。一つの有望な戦略は、幹細胞生物学¹の急速な発展以下の細胞ベースの治療である。この点では、多能性のCPCは増殖だけ心臓系統への分化にコミットする能力のために、治療のための優れた細胞源である可能性があります。したがって、クリック単価を生成し、単離するための効率的かつロバストな方法は、心臓の細胞療法の研究のために非常に重要である。

このプロトコルは、初期胚発生とどのように彼らの世代のESCからの間に識別胚のCPCに焦点を当てています。各種のCPCにも骨髄²から、胚および成体の心臓から単離されている。胚発生時には、骨のmorphoge電磁タンパク質（BMP）、ウィングレス型MMTV組込み部位ファミリーメンバー（のWnt）と節点の信号がMesp1 ⁺多分化中胚葉³のコミットメントを誘導する。 Mesp1 ⁺細胞はその後、胚のCPC ⁴に分化する。これらのCPCは、一般的にHCN4でマーク、NK2ホメオボックス5（Nkx2-5）、カルチのLIMホメオボックス1（ISL1）、T-ボックス5（TBX5）、及び筋細胞エンハンサー因子2C（MEF2C）、一次および第二の心臓フィールドを形成されており、心臓発生^5-10の間に心臓の主要な部分に貢献しています。 Nkx2-5 ⁺及びISL1 ⁺ / MEF2C ⁺両方のCPCは、心筋細胞に分化することができる、平滑筋細胞（SMC）、および内皮細胞^5-8。したがって、これらのCPCは、心臓血管系、ならびに心臓組織を生じさせると細胞ベースの心臓療法のための理想的な細胞源であるであろう。その結果、in vitroでのCPCを生成する心血管研究における主要な研究の焦点となっている。 ESCは、無制限の拡張容量aを有しているのでND胚盤胞段階でICM細胞を表し、自然の胚発生以下の胚のCPCへのESCの分化は、クリック単価を取得するために論理的かつ効果的なアプローチと考えられている。

ESCのからのCPCを得るための1つの広く適用のアプローチは、EBを¹¹にESCのを集約することです。分化効率を向上させるために、心臓の開発の知識に基づいて定義された化学的および成長因子は^12-14使用されてきた。しかし、広く分野で受け入れられている明確なCPCマーカー、特に無細胞表面マーカーは、存在しない。この問題に対処するために、ESCのはISL1 ⁺またはMEF2C ⁺クリック単価とのCre / loxPシステムを用いた蛍光レポーターとその誘導体をマークするために設計されている。 CreリコンビナーゼはISL1 / MEF2Cプロモーター/エンハンサーの制御下で落札された。構成的プロモーターによって駆動される修正された蛍光タンパク質RFPまたはYFP遺伝子のcreリコンビナーゼでFLOX停止コドンの切除により活性化され得る（ISL1：CRE;-のpCAG-FLOX-STOP-FLOX GFPまたはRFP / ISL1-CRE。Rosa26YFP / ^{MEF2C-CRE。Rosa26YFP）5,6。} ESCは第二の心臓フィールドのCPCに分化されると、ISL1 / MEF2Cプロモーター/エンハンサー駆動CREは蛍光レポーターを活性化するとのCPCをFACS-精製によって濃縮することができる。簡単に説明すると、EB凝集法は、ESCの分化を開始するために使用される。分化効率を高めるために、分化した細胞は、アスコルビン酸（AA）およびBMP4、アクチビンAとのVegf ^13,15などの増殖因子で処理される。このプロトコルは、マウスおよびヒトESCの両方を使用して、堅牢で効率的なCPCの分化を可能にする。

プロトコル

マウスのESCからマウス胚性CPCの1導出

1. マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層を準備します。
   1. 暖かいMEF培地を37℃まで（DMEM中10％FBS）。
   2. ゼラチンでコーティングしたプレートを準備します。
      1. 10cmディッシュに6ウェルプレートのウェルまたは5中への水の0.1％ゼラチンを1ml加える。
      2. 少なくとも30分間37°Cまたは室温でプレートや食器のままにしておきます。使用前にゼラチンを熱望。
   3. 融解は、穏やかに振盪しながら、37℃の水浴中で迅速にMEFを照射。
   4. 15ミリリットルまたは50ミリリットルコニカルチューブに静かに細胞を移す。予め温めMEF培地5mlを追加します。ゆっくり細胞を旋回し、5分間200×gで遠心する。
   5. MEF培地中の細胞を再懸濁し、生存細胞を数える。 6ウェルプレートからウェルあたりの細胞のための2ミリリットルと10cmディッシュから細胞について10ミリリットル：MEF培地の以下のボリュームを使用してください。
   6. 1-2で6ウェルプレートまたは10cmの皿にプレート細胞プレート/皿当たり×10 ^6。
   7. 37℃でのMEFプレート/皿をインキュベートし、5％CO ₂の少なくとも24時間前に使用する。
      注：週より古いMEFプレート/皿を捨てる。
2. マウスのESCを準備
   1. 文化ISL1-CRE。 Rosa26YFP / MEF2C-CRE。 90％のコンフルエントまでMEF上Rosa26YFPマウスのESC。使用ES細胞培地は、410ミリリットルDMEM、75ミリリットルのFBS、0.1mMのMEM NEAA、2mMのL-グルタミン、0.1mMのピルビン酸、100 Uペニシリン/ストレプトマイシン、および0.1mMのβメルカプトエタノールからなる。
   2. 1.1.2で説明したように、ゼラチンコーティングした6ウェルプレートを準備します。
   3. プレートから培地を吸引し、DPBSで細胞をすすいでください。
      1. 吸引しDPBSと6ウェルプレートの1ウェルに0.4ミリリットル0.25％トリプシンを追加します。 5分間37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートする。トリプシン反応を停止するために1ミリリットル予め温めたES培地を追加します。
   4. 200 XGと吸引媒体での収穫細胞と遠心細胞。 1ミリリットルのES細胞培地中で細胞を再懸濁し、細胞をカウントします。
   5. 3×10 ⁴ / cm ²の密度でゼラチンコートプレート上プレートのESC。 ESCは約90％コンフルエントに達したときに、約2日間、37℃、5％CO ₂でインキュベートする。メディア毎日を変更します。
   6. ESCは、90％コンフルエントである場合には、完全にMEFフィーダーを削除する手順1.2.2-1.2.5を繰り返します。
3. EB形成によってCPCの分化を誘導する
   1. 続くように分化培地を準備します36ミリリットルIMDM、12ミリリットルハムF12、2mMのL-グルタミン、0.34ミリリットルBSA（7.5％）、0.25ミリリットルN2、0.5ミリリットルのB27、50μg/ mlのAA、および0.45 mMの1-チオグリセロールを。
   2. 吸引し細胞からの培地およびDPBSですすぐ。吸引しDPBSと6ウェルプレートの1ウェルに0.4ミリリットル0.25％トリプシンを追加します。 5分間37℃でインキュベートする。
   3. 単一細胞に細胞クラスターを分散させるために上下に反応し、ピペットを中止する1ミリリットルの分化培地を追加します。
   4. 200×gで遠心したESC 5分間、中を捨てる。
      1. 再懸 ​​濁し、1×10 ^{6 <}/商標> 1ミリリットル分化培地中のESC。第EBの凝集のための細胞、培養37℃で分化培地中で1×10 ⁵細胞/ mlの濃度の低い剥離ペトリ皿で細胞を数える。
   5. 二日EB形成した後、50ミリリットルチューブに皿からのEBを転送する。 1分間200×gでスピン。培地を除去およびCa ²⁺およびMg ²⁺なしで10ミリリットルのDPBSでのEBをすすぐ。
   6. 吸引しDPBSと1ミリリットル0.25％トリプシンを追加します。 5分間37℃でインキュベートする。反応を停止する4.5ミリリットル分化培地を加える。上下にピペットで単一細胞にしたEBを解離する。
   7. 5分間200×gで細胞を遠心します。 1ミリリットルの分化培地で培地を吸引し、細胞を再懸濁。
   8. 細胞をカウントし、分化培地中で1×10 ⁵細胞/ mlに2×10 ⁶個の細胞を希釈する。それぞれ5 / mlの、0.8 ng / mlであり、5 / mlの、の最終濃度で培地にVEGF、BMP4とアクチビンAを追加する。 Cultu37℃での第EB形成のためのペトリ皿で​​細胞を再。
   9. 第二EB形成後に40時間、50ミリリットルチューブにEBを転送します。 5分間37℃で1ミリリットル0.25％トリプシンでのEBを解離、DPBSで一度すすぎます。上下にピペットで単一細胞にしたEBを解離する。
   10. 5 / mlのVEGF、10ng / mlのbFGFおよび12.5 / mlのFGF10とStempro-34培地中の細胞を懸濁します。ゼラチンコートプレートに2×10 ⁵ / cm ²の細胞をプレート。 CPCの分離前に約32時間、37℃のインキュベーターで培養。
4. mCPCsを分離
   1. 培地を吸引し、DPBSですすぐ。 5分間37℃で培養プレートに0.5ミリリットルの0.25％トリプシンを加える。反応を停止する4.5ミリリットル分化培地を加える。上下にピペットで単一細胞にしたEBを解離する。 FACS-精製のために、2％FBS / PBSで遠心分離し、再懸濁細胞によって細胞を回収します。
   2. 陰性対照として選別機に未分化のESCを実行します。スキャットを楽しみに調整する変更電圧TER（FSC）および側方散乱（SSC）は、所望の人口を選択します。破片とダブレットを排除するために側方散乱と幅対前方散乱の高さ対飛散楽しみにしてください。選択されたサブ集団において、ESCコントロールの分布に応じて、細胞の自家蛍光を排除するためにヒストグラムに正のYFPのゲートを描く。 YFP ^+ゲーティングからYFP ⁺のCPCを収集します。
   3. 分化培地（1.3.1）を6ウェルプレート中で精製したクリック単価（YFP ⁺細胞）プレート。心筋細胞および平滑筋細胞へのCPCの分化のために、37℃で培養追加の3〜5日。

ヒトESCからのヒト胚性CPCの2導出

1. フィーダを準備
   1. 2×10 ^4個 / cm ²の密度で、上記のように、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層を準備します。
2. ヒトESCを維持
   1. CRE; M上の日常のpCAG-FLOX-STOP-FLOX-GFPまたはRFPのESC：人間ISL1を維持正規のhESC培地を用いてEF（ノックアウトDMEM / F-12 385ミリリットル、ノックアウトSR 100mlの2mMのL-グルタミン、0.1mMのNEAA、0.1mMのβメルカプトエタノール、10ng / mlの塩基性FGF）。心臓分化する前に、少なくとも2継代のフィーダーフリーの状態でヒトESCを転送する。
3. フィーダーフリーの状態でヒトESCを準備
   1. ヒトESC培養のためのコーティングされたプレートを準備します。
      1. 4℃で一晩マトリゲルを解凍する。氷上で50ミリリットルチューブを入れ、チューブに30ミリリットルの冷DMEM / F12培地を追加。
      2. 冷たい培地に1ミリリットルマトリゲルを加え、よく混ぜる。 10cmディッシュに6ウェルプレートのウェルまたは5ミリリットルに1ミリリットルの冷マトリゲル-DMEM / 12培地を追加します。
      3. 2時間4℃で一晩または室温でプレート/皿のままにしておきます。使用前に培地を吸引。
   2. MEFプレートから培地を吸引し、DPBSでヒトESCをすすぎ：人間のプレート上のESCを分割。その後、6ウェルプレートのウェルに1ミリリットルのディスパーゼ（1mg / ml）を加える。 37℃で細胞をインキュベートインキュベータは、コロニーの縁が剥離し始めるまで。
   3. ディスパーゼ溶液を除去。 DPBSで2回すすぎ、その後プレートによくmTeSR培地またはMEF馴化培地あたり2.5ミリリットルを追加/。
   4. セルスクレーパーを用いて細胞をこすり、慎重にピペッティング上下小さな塊に人間のESCコロニーを破る。
   5. ESC塊を移し、1を希釈：3をコーティングしたプレートに。
   6. 2ミリリットル/ウェルmTeSR培地またはMEF馴化培地を追加し、毎日培地交換。
   7. mTeSR媒体または少なくとも2継代のためにコーティングされたプレート上のMEF馴化培地中での培養ヒトESC。
4. ヒトESCからのCPCの分化を誘導
   1. 細胞が約90％コンフルエントである場合には、培地を吸引し、DPBSですすぐ。その後、20分間、37℃で0.5 mg / mlのディスパーゼでのhESCを培養する。
   2. セルリフターでプレートから細胞を除去し、DPBSで2回のhESCをすすぎ、その後DMEM / F12は、18％のFBS、0.1 mMのNEAA、2 mMのを含む（分化培地中の細胞クランプを再懸濁L-グルタミン、0.1mMのβメルカプトエタノールおよび50μg/ mlのアスコルビン酸）。
   3. EB形成のために、6ウェルの超低付着性プレートに細胞を移す。
   4. 翌日分化培地を変更します。
   5. 3日ごとに培地を交換し、懸濁培養でのEBを維持する。
5. HCPCSを分離
   1. 遅くとも人間CPC分離のための分化の9日目よりのEBを収集しません。
   2. 培地を吸引し、DPBSで2回のEBをすすぐ。 5分間37℃で6ウェル培養プレートの各ウェルに0.5ミリリットルの0.25％トリプシンを加える。
   3. 反応を停止し、分化培地の等量を加える。上下にピペットで単一細胞にしたEBを解離する。 2％FBS / DPBS中で5分間再懸濁細胞を200×gで遠心分離して細胞を回収します。 40μmのセルストレーナーおよび1.4.3に記載のようにFACS精製RFP ⁺ CPC細胞とフィルタセル。
   4. プレートはgeltin被覆プレート上にHCPCSを選別した。 7のための分化培地で培養HCPCS-9心筋細胞および平滑筋細胞に分化する日数。 7日めっき後、培養物は、DMEM / F12培地中で5％のノックアウトSRで細胞を分化した。

結果

プロトコルは、いくつかのES細胞株からのCPCの導出を示す。 ESCのは、CPCのに分化するのEBを形成するために集約されます。 ESCは、日常的MEFフィーダー（ 図1A、F）に維持され、フィーダは、分化前に削除されます。分化培地中のEB（ 図1B、G）へのESCの凝集の際に、第二形成EBをマウス細胞株（ 図1C）における中胚葉分化を増強するために、BMP4とアクチビンAで処理した。蛍光タンパク質YFP / RFP（ 図1D）によって識別されるのESCは、心臓系統に分化されている。クリック単価（ 図1H）FACS精製し、心筋細胞および平滑筋細胞に分化するようにさらに培養した。 cTnTのおよびSM-MHCの染色は、心筋細胞および平滑筋細胞（ 図1. E、I、J）へのCPCの分化能を示した。一般的に、80〜90％のCPCは、マウスのESC分化PROTから取得されるocolおよび0.5〜5％のCPCを、ヒトESCの分化プロトコールから得ら...

ディスカッション

このプロトコルは、成長因子を使用してmESCの分化とヒトESCのCPCへの自発的分化を誘導する方法を組み合わせたものです。蛍光レポーターでマークされたCPC系統は、FACSによってCPCを効率的に同定および単離するために使用されます。FACS精製CPCは、心筋細胞、平滑筋、および内皮細胞に分化する能力を保持し、in vivo細胞と同等の発現プロファイルを持っています。したがって、これらの CPC は、心筋と血管構造の両方を形成する能力があるため、細胞ベースの心臓治療の優れたリソースとして役立ちます。

このプロトコルの重要なステップの1つは、in vitro分化中のCPCの高純度と量に関連する正しいタイミングを特定することです。多能性幹細胞のCPCへの分化に影響を与える可能性のある多くの条件(血清 ロット番号、細胞株 など)があります。分化の最適化とCPCの単離のための適切な時間枠の決定のためのパイロット実験を強くお勧めします。

このプロトコルにおけるCPCの精製は、組織特異的creリコンビ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
FBS	サーモフレッシフィック	SH30070.03E
ノックアウトSR	ライフテクノロジー	10828028
ノックアウトDMEM	ライフテクノロジー	10829018
DMEM	ライフテクノロジー	11965118
NEAA	ライフテクノロジー	11140050
GlutaMAX	ライフテクノロジー	35050061
N2	ライフテクノロジー	17502048
B27	ライフテクノロジー	12587010
ハムs F12	Lifeテクノロジー	11765062
IMDM	Lifeテクノロジー	12440061
Pen/Strep	Lifeテクノロジー	15140122
Pyruvate	Lifeテクノロジー	11360070
Dispase	Lifeテクノロジー	17105041
Stempro-34	Lifeテクノロジー	10639011
DMEM/F12	Life technology	11330032
BSA	トリ	15260037
	ライフサイエンス	25200056
アスコビック酸	Σ	A5960
1-チオグリセロール	Σ	M1753
2-メルカプトエタノール	Σ	M3148
VEGF	R&D	293-VE
BMP4	R&D	314-BP
アクティビンA	R&D	338-AC
bFgf	R&D	233-FB
Fgf10	R&D	345-FG
mTeSR	Stemcell technologies	5850
マトリゲル	BD バイオサイエンス	354277

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