ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

Summary

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。

Abstract

骨格筋の修復および再生は、常駐筋肉幹細胞である、衛星細胞の作用を必要とする。これらは、酵素消化を用いてヒト筋肉生検試料から単離することができ、それらの筋原性性質は、培養で研究。定量的には、酵素消化から得られた二つの主要な接着細胞型がある：CD56 ⁺として最初に同定された（i）の衛星細胞は、（筋原細胞又は筋前駆細胞とも呼ばれる）、およびそれ以降のCD56 ⁺ /デスミン⁺細胞など、および（ii）muscle-とTE-7 ^{+ -} CD56として識別由来の線維芽細胞、。線維芽細胞は培養液中で非常に効率的に増殖し、混合細胞集団においてこれらの細胞は、培養を支配する筋原細胞をオーバーランすることができる。培養中の細胞型のいずれかの生来の挙動を調査しようとしたときに、人間の筋肉とは異なる細胞型の単離および精製は、このように重要な方法論的な考慮事項である。ここでは、非難される両方の高純度（> 95％筋原細胞）および良好な収率（〜を与えるコラゲナーゼを用いて細胞の穏やかな酵素消化に基づいて並べ替えや磁気活性化細胞選別（MACS）が続くディスパーゼのシステムをIBE 2.8×10 ^6±8.87培養での実験のためのin vitroでの 7日後に×10 ⁵細胞/ g組織）。このアプローチは、CD56に対する抗体にコンジュゲートした磁気ビーズのビーズと混合筋肉由来細胞集団をインキュベートした後、磁場も細胞を通過させるに基づいている。細胞カラムを通過妨げられずに通過する^- CD56が、一方、マイクロビーズに結合されたCD56 ⁺細胞は、フィールドによって保持されている。選別プロセスの任意の段階からの細胞懸濁液を播種し、培養することができる。所与の介入、細胞の形態以下、核転写因子を含むタンパク質の発現および局在を免疫特異的な抗体で標識し、画像のpを用いて定量することができるrocessingと解析パッケージ。

Introduction

骨格筋の修復および再生は^2,3筋原幹細胞、衛星細胞¹の作用を必要とする。 インビボでこれらの細胞はあらゆるmyofibreの筋細胞膜と基底膜の間に位置して可逆的に静止状態で存在するが、増殖するように活性化され、ヒューズ及び筋肉組織として分化するが、損傷を受けた修理および^3を再生する。衛星細胞は、酵素消化^4を用いて、若年および高齢のヒト筋肉生検試料から単離することができ、それらの筋形成特性は、その後、初代培養⁵に研究することができる。細胞集団の両方の収率および純度に関して、この分離プロセスの効率は、使用される方法に依存し、サンプル間で変化し得る。酵素消化から得られた二つの主要な接着細胞型は、CD56 ⁺ /デスミン細胞、およびμとして最初に同定された衛 ​​星細胞（現在称される筋原細胞又は筋前駆細胞）、あるCD56として識別SCLE由来線維芽細胞、 ^-とTE7 ⁺細胞^5。線維芽細胞は、急速な増殖率を持っており、筋原細胞のような細胞間接触の際に不可逆的な増殖停止および最終分化を受けない。したがって、混合集団に、線維芽細胞は、文化を支配する筋原細胞をオーバーランすることができる。

線維芽細胞は、多くの場合、しかし、それ自体で研究の価値がある細胞のような線維芽細胞への関心....

Protocol

注：私たちの研究室で行われた研究では、すべての被験者が参加する彼らの書かれた、インフォームドコンセントを与え、すべての実験は、英国国民保健サービス倫理委員会の承認を得て実施した（ロンドン研究倫理委員会;参照：10 / H0718 / 10）とに従い、ヒト組織法およびヘルシンキ宣言。

1.初期準備筋生検の前に（15分）

1. ヒト骨格筋成長培地を行います。メス、滅菌50mlコニカルチューブに次に骨格筋の基底で50mlにチューブを埋めるサプリメントミックス2.5mlを10mlの適切な最終濃度のウシ胎児血清、抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）およびグルタミン（ 表1）を追加メディア。
2. 無菌の20ミリリットルコニカルチューブに骨格筋基礎培地の15ミリリットルを入れて、それの重量を量る。一度このチューブは氷の上で行われ、秤量。ヒト筋肉サンプルを受け取るために使用します。
3. 別の20ミリリットルチューブでは10メートルを準備骨格筋基礎培地中でこれらの酵素のストックのアリコートを溶解して2mg / mlのそれぞれの最終濃度をコラゲナーゼDおよびディスパーゼII酵素溶液のリットル。 0.22μmのフィルターを通すことにより、このソリューションを濾過滅菌する。ウォームアップする15分間37℃のインキュベーターや水水浴中でこの無菌の酵素ミックスを置きます。
   注：この酵素の混合物は、トリプシンよ....

Results

精製された筋原細胞及び線維芽細胞は、脂肪生成のためのそれらの可能性を評価するための任意の場所の間で7〜30日間の脂肪生成栄養培地、続いて三日間脂肪細胞分化培地で培養することができる。脂肪生成および筋原性系統マーカーのための免疫染色と組み合わせて、精製された細胞集団を用いて、オイルレッドO染色のみ線維芽細胞画分は、脂肪細胞への分化が可能であったことを示した（ 図2）。線維芽細胞による脂肪の大量の蓄積は、肉眼（パネルA）に表示されており、それらの完全な分化は、核PPARγ（ 図2のパネルB＆Cおよび図3）の非常に強い発現によって示されている。 15日間の処置により、これらの細胞は、それらの基質（パネルD）に残っているTE-7（結合組織抗原）をリリースしている。これとは対照的に、筋原細胞がデスミンとミオシン重の発現を含む彼らの正常な表現型を維持チェーン（ 図2のパネルE＆F）および核PPARγ（ 図3C）をアップレギュレートしないでください。

Discussion

我々は、筋生検材料の少量の試料からのヒト筋肉由来前駆体の選択的濃縮のためimmunomagentic選別手順を記載している。この手法は、線維芽細胞にヒト筋肉由来の文化の損失を克服するための、だけでなく、筋肉由来前駆細胞の異なる集団のユニークな振る舞いを理解するための私たちの研究室では非常に貴重なてきた。精製した後筋原細胞は、タンパク質および/または遺伝子発現の変化を調べ、または下流の実験のために使用することができる。

我々はまた、詳細蛍光顕微鏡の顕微鏡写真に関心の特定の領域を分析する迅速かつ簡単な方法で細胞精製に加えて。蛍光顕微鏡からデジタル画像は細胞生物学者を抽出するための情報が豊富に含まれています。実際の画素は必ずしも人間の目には識別できないデータを保持する。この技術では定量的なデータは、多数の周りを得ることができる集団における個々の細胞の。フローサイトメトリーと比較した場合、画像解析のユニークな特徴は、細胞形状orcell - 細胞相互作用の変化を用いたタンパク質発現の変化を相関させる能力である。さらに、最適化された代表的な選択マスクを作成して保存する能力は、迅.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
コラゲナーゼ D	ロシュ
Dispase II	Sigma	D4693-1G	使用前にフィルター滅菌する必要があります
Trypsin/EDTA(	Gibco) Invitrogen	15400-054
100 μm細胞ストレーナーBD	Biosciences	352360
溶液(0.1%酢酸に3mg / ml)	シグマ、ドーセット、英国	C8919
Minisart SRP15 シリンジフィルター (0.2 μm)	ザルトリウス	17573ACK	ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜
CD56ヒトマイクロビーズ	Miltenyi	バイオテクノロジー130-050-401	マイクロビーズの限られた貯蔵寿命に注意してください
線維芽細胞マイクロビーズ、ヒト	Miltenyi	バイオテクノロジー130-050-601
40 μm プレセパレーションフィルター	Miltenyi Biotech	130-041-407
ラージセルカラム	Miltenyi Biotech	130-042-202	これらのカラムにはフロー抵抗器が付属しています。ここで説明する高い筋原性純度を得るために、フロー抵抗器を使用する必要はありません。
LSカラム	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Seperator	Miltenyi Biotech	130-042-102	このセパレーターは、大きなセルカラムには適合しますが、LSカラムには適合しません。
MidiMACS	ミルテニー・バイオテック	130-042-302
MACSマルチスタンド	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	シグマ		使用前にフィルター滅菌する必要があります
オイルレッドO	シグマ	O0625
リン酸トリエチル	グマ	538728
Whatman ペーパー	シグ	マ Z241121-1PAK	No.42、アッシュレス。フィルターを準備するには、円形の濾紙を折りたたんで半円を作り、次に半円を再度半分に折りたたんで円錐形にします。コーンを濾過用の漏斗に取り付けます。
ProLong Gold Antifade Reagent	Molecular Probes, Invitrogen	P36930	DAPIの有無にかかわらず購入でき、初期蛍光を消光しません。
AxioVision	Carl Zeiss	Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended	Adobe(Pugh Computersから購入)	ADPH16982*