ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

Summary

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生過程とモデルヒト疾患を研究するための優れた実験的な生物である。ここでは、読み出しをホールマウントin situハイブリダイゼーション （WISH）とゼブラフィッシュ胚で手動ハイスループット化学画面を実行する方法についてのプロトコルを記述します。

Abstract

ゼブラフィッシュは、人間との遺伝的保全の彼らはかなりの程度まで広く使用されているモデル生物発生生物学の基礎となるメカニズムを調査すると、ヒトの疾患の病理を研究するようになった。化学遺伝学、生物学的プロセスに小分子が有する効果を試験し、治療化合物を同定するための人気のあるトランスレーショナルリサーチ方法になってきていることを伴う。ゼブラフィッシュは、特にため、外部から受精された胚の透明の大きなクラッチを産生する能力の化学遺伝学のために使用することが魅力的。さらに、ゼブラフィッシュ胚は、簡単に胚メディアへの化合物の単純な加算によって治療薬することができます。 in situハイブリダイゼーション （WISH） でホールマウントを使用して、mRNA発現は、明らかにゼブラフィッシュ胚内で可視化することができる。一緒に、化学遺伝学およびWISHを使用して、ゼブラフィッシュは細胞および生理学を決定する中で強力な生物全体のコンテキストになり小分子の効果。革新的な進歩は、しかし、そのようなオプションにアクセスできないか、費用対法外残る多くのラボのために、マシンベースのスクリーニング法を利用しての技術で作られてきた。ここに記載されているプロトコルは、基本的なリソースを必要とし、時間の効率的な期間内に、単一の個人または少人数のチームによって達成することができる手動のハイスループット化学遺伝学的スクリーニングを実行する方法について説明します。したがって、このプロトコルは、発生過程、病気のメカニズムに根本的な洞察を得るために有用であることができ、医学的に関連の用途を有する新規化合物とシグナル伝達経路を同定するためにゼブラフィッシュの化学遺伝学を実行するための研究グループによって実施することができる実行可能な戦略を提供。

Introduction

人間の病気を治療する有効な治療薬の同定は、多くの生物医学研究者にとって大詰めです。臨床応用のための潜在的な薬理学的物質の同定および特徴は、医療用の明白な値を有しているが、それは重要な課題となってきた。最終的に、多くの治療化合物の開発は、開発または機能のいずれかを特定の細胞型の知識から来る。ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、発生生物学¹における主流のモデル生物となっているコイ科ファミリーの淡水硬骨魚である。ゼブラフィッシュは、遺伝的に維持し、科学的研究のために^2,3、操作が簡単で扱いやすい脊椎動物である。ゼブラフィッシュ胚は、外部から受精、透明であり、一週間に^2,3つの成人の交配対から数百により製造することができる。さらに、ゼブラフィッシュシェア主要な器官系と大きなDを所有ヒトを含む哺乳動物^4、との遺伝的類似性のegree。驚くべきことに、ヒト遺伝子の70％は、ゼブラフィッシュオルソログ^4を持っている。これにより類似性のために、ゼブラフィッシュは脊椎動物の発生および生理機能のメカニズムを研究するための非常に関連の実験系であった、そしてヒト疾患^5-7多数を再現するために使用されている。これらの理由は、とりわけ、遺伝的尋問を継続するためにゼブラフィッシュの理想的な候補を作ったし、生物医学研究^6,7におけるゼブラフィッシュの有用性のために着実に増加して感謝の意をもたらした。

過去数十年にわたり、遺伝子ツールの豊富さは、ゼブラフィッシュで開発されてきた。ゼブラフィッシュゲノムは、変異誘発および遺伝子導入³に従順である。現在までに、フォワードの過多および遺伝学的研究を逆に9,000を超える変異体³の生成につながる、行われている。さらに、数多くのトランスジェニック系統を持っていること作成し、その特定の細胞型³のラベリングおよび単離を可能にした専用。ゼブラフィッシュ国際リソースセンター^{（ZIRC）〜8}ではなく、低コストで研究室のためにアクセス可能である研究コミュニティへのこれらのリソースを、一元化し、配布するための重要な継続的な努力がなされてきた。さらに、生体情報およびシーケンスおよびプロトコルをモルホリノする遺伝子発現パターンに至るまで分子ツールの広範なリポジトリは、漸進的にゼブラフィッシュ情報ネットワーク^{（ZFIN）9-11}でアノテートされています。これらのゼブラフィッシュの研究インフラが重要なNIHのサポートと、この動物モデル⁸の擁護を通じて可能になってきた。ゼブラフィッシュ変異体、トランスジェニック系統、および関連情報のこのキャッシュは、大規模での生物学的な研究コミュニティへの例外的な価値があると続けている。ゼブラフィッシュは今、十分に確立し、卓越したモデル生物であるがしかし、それらはアラカルトを表す化学遺伝学的スクリーニングを使用して、発生生物学や病気を研究するrgely未開発の貯水池。

化学遺伝学は、生物系¹²内の生物学的プロセスに影響するような薬物または他の化合物などの小分子の使用である。化学遺伝学は、薬剤をその救助を特定したり、特定の遺伝的欠陥^12を悪化させるような、遺伝子機能の分子機構を理解するために実装することができる。さらに、化学遺伝学は、トランスレーショナルリサーチ^12を実施する一つの大きな道を表しています。動物モデルでの伝統的なフォワード遺伝子スクリーニングは疾患特異的遺伝子をリンクに途方もなく強力であったが、彼らはそれが困難またはできない場合が初期胚発生後に生じるであろう表現型を観察すること、時間次元を欠いている。さらに、遺伝子の冗長性は解釈が困難フォワード遺伝学から観察された結果を作ることができます。あるいは、化学遺伝学的スクリーニング微細な時間的制御を可能にし、同時に、創薬^12,13のための有用な出発点を提供する。

化学遺伝学は、生物体全体として（ 例えば、細胞株、タンパク質）は、インビトロ系を用いて 、またはin vivo系を用いて行うことができる。それは生物全体のシステムよりも単純であるため、化学遺伝学のためのin vitroの系を使用することは有益なことができ、大規模、低コスト、かつ少ない時間集約的で扱いやすい。その結果、in vitro系は、ハイスループットスクリーニング（HTS）およびハイコンテントスクリーニング（HCS）の両方を可能にする。化学遺伝学だけでなく、重大な限界に近づいたときに考慮されるべきであるin vitro系を使用する利点は多数ある。細胞株を使用する1つの主な制限は、小分子が特定の細胞系において有効かつ非毒性で、しかも生物全体に導入された場合に毒性になることができることである。このように、核心問題のin vitroでのシステムは生物の幅広い文脈を捕捉していないので、常に正確に生物全体で何が起こるかを模倣することができないということです。全生物中の化合物の試験は、これらの問題を回避できますが、哺乳動物の全生物モデルの使用は、物理的および倫理的な多くの制限をもたらす。例えば、マウスにおける薬物スクリーニングは、ロジスティック十分なサンプルサイズをテストするために必要なスペースや費用によって妨げられる。また、発達の質問は、哺乳動物は子宮内で発症するという事実のために、研究することは困難である。生物医学研究の行為は莫大な社会的価値を有している。最後に、強烈な研究を制限し、研究のために使用される動物の痛みや苦しみを緩和することにより、動物福祉を保護するための相当なニーズがあるにもかかわらず。ゼブラフィッシュは、哺乳類のような高等脊椎動物での作業に実行可能な代替を提供し、さらに、多くのトピックがで化学遺伝学を用いて研究することができます胚および幼虫期の神経学的処理は低レベル^12,13で存在しないか、動作可能である。

化合物の送達が関心^12-15の薬剤を含有する培地中で胚を浸漬することによって達成することができるように、現在までのところ、化学遺伝学的スクリーニング無数のは、特に、ゼブラフィッシュ胚を用いて行われてきた。さらに^、16-20可能かつ管理化学遺伝学的スクリーニングを行うための多数の科学技術の進歩があった。ピーターソンらは、2000年に化学遺伝学的スクリーニングでゼブラフィッシュを使用した最初の、そして後に2004年にゼブラフィッシュ^21,22における大動脈縮窄変異を抑制化合物を同定した。化学スクリーンは以来、いくつかの発展途上組織（ 例えば 、心臓、血液、血管^）23-25、生理的な機能（ 例えば、行動のための神経学的根拠^）26、大人の再生^27,28、およびdiseasを研究するために実施されてきた Eモデル（ 例えば、筋ジストロフィーおよび癌^）29,30。これらのゼブラフィッシュの化学スクリーンの中から、プロスタグランジンは、造血幹細胞を制御する発見は「ベッドサイドにタンク」から動かす力を発揮、ヒトでの臨床試験に連れて行かれました^{23,31-33（NIH、}臨床Trials.gov、NCT00890500。 NCT01627314）。これらは、臨床試験への移行には至っていないものの、最近では、有望な候補治療薬は、多発性嚢胞腎^（PKD）34および急性腎傷害^27,35における細胞病理を修復腎臓のような複雑な器官のために浮上している。これらの化学遺伝学的スクリーニングは、広く開発ゼブラフィッシュおよび成体組織の機能を調べるために、化学遺伝学を適用する能力の小さい化合物を試験の有用性を実証する。さらに、学術研究の¹⁹ために利用可能である市販の薬理学コレクションの成長のリストがあります。

ove_contentは">ここ数年では、自動化されたイメージング·システム^36〜38とともに、薬物分注および取り扱いのためのロボットの自動化システムの使用を含む化学遺伝学的スクリーニング技術における顕著な進歩がなされている。このようなシステムは、の可能性を考慮残念ながら、これらの革新的なロボットの企業との化学遺伝学的スクリーニングの事業は一般的にかなりのリソースを必要とします。両方のHTSおよびHCS ^36-38を達成するため^の化合物の多くは何千ものテスト。リソースのこれらのタイプは取得する資本を欠いている多くの機関にとって大きな障害であるプレートに配列するための胚の移植を含む化学ライブラリーのロボット処理のためのインフラを構築しながら、運用、およびそのような計装を維持します。、多くのラボで、自動化されたイメージングおよび分析のための法外なコストは一般的に、よりアクセス可能です残る^12。自動化された画像スクリーニングは、定量化が可能になり蛍光トランスジェニックReのポーターおよび特定の表現型分析^12,15を容易に^します。

自動化されたシステムは、便利な技術の進歩を表していますが、多くの質問は、このようなin situハイブリダイゼーション （WISH）読み出し³⁹ でホールマウントと発達過程に数千の生物学的に活性な化合物のクエリとして、より焦点を絞ったマニュアルスクリーンによって対処することができる。ラボが増えて研究課題を調査するためにゼブラフィッシュの化学スクリーンを呼び出さてきたが、さらに、少数の（もしあれば）の努力が飽和状態に達していると多くのトピックは、化学遺伝学を使用して破られるには至っていない。化学画面は、わずか数は、野生型またはトランスジェニックタンクからなる小さなゼブラフィッシュのコロニーを使用して実行することができる。したがって、遺伝的尋問のこの形式は、この分野に多様化/拡大に興味が最もゼブラフィッシュの研究グループによって達成可能である必要があります。様々なサイズの化学ライブラリは、商用ディストリビューターおよび/またはCOLから調達することができますlaborators。これらの理由から、化学遺伝学は、過酷な資金気候で経済的に実現可能であることができる。しかし、このようなスクリーンの物流の側面を計画する方法などの化学遺伝学の画面を開始するハードルが、あります。 例えば、正常な画面のために必要な人員の数、専用の時間配分と一緒に物理的なプロトコルを縫い合わせ、サンプルを手動で処理する数千数百からその番号。ここでは、詳細マニュアルハイスループットプロトコルは、読み出しとしてWISHでゼブラフィッシュ胚における化学遺伝学を実行する。この方法は、mRNA転写物のリボプローブを検出したゼブラフィッシュ胚の薬物治療を伴う。このプロトコル、小規模なチーム、あるいは1個体を用いて合理的にすることができます画面と9週間のスパンで約600の化合物をささやかな化学ライブラリを分析。

Protocol

ここで説明するゼブラフィッシュで作業するための手順は、ノートルダム大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。ゼブラフィッシュ本書の小分子スクリーンのための研究デザインへのガイド（ 図1）が設けられている。このプロトコルで説明される方法の概要は、フローチャート（ 図2）として提供される。パート4-10に記載されて胚処理ステップを計画する例ラベリングシステム（ 図3）をご参照ください。胚のステージングのために、ゼブラフィッシュステージングシリーズ⁴⁰を参照してください、および部品9-10で使用WISHアンチセンスリボプローブの製造のために、最近公表された方法⁴¹を参照してください。

ゼブラフィッシュ交尾チェンバースの調製

1. 成人男性ゼブラフィッシュとチャンバデバイダ、O / Nで区切られた交配室への成人女性ゼブラフィッシュを、置きます。
   注：ミサ交配、そのようなsの2-3人の女性と2-3人の男性のものを用いてのグループは、単一のペアの交配に比べてより多くの胚を生成することができ、かつ適切なサイズの交配室で行うことができる。
2. 繰り返し工程1.1ゼブラフィッシュの25ペアの合計が試験される小分子のすべての96ウェルプレートのためのセットアップであるようにする。

ゼブラフィッシュ胚の2コレクション

1. 次の日は、各魚のペアを区切る仕切りを削除し、1時間後に、細かいメッシュのストレーナーを使用してゼブラフィッシュ胚を収集およびE3胚培地を（レシピの材料リストを参照）を含むペトリ皿に置いてください。
   注：1時間は胚が同じような発達段階にあることを確実にした後の胚を収集する。
2. 破片（ 例えば、食品や固形廃棄物）を除去するためにプラスチック製トランスファーピペットを使用してください。次に、胚の各クラッチを観察し、あらゆる未受精卵を削除するには実体顕微鏡を使用しています。
3. E3胚メディアをデカントし、新鮮なE3と交換し、その後、各ディを置く28.5℃のインキュベーターで胚のSH。 2時間後、実体顕微鏡を用いて、胚の各クラッチを観察し、あらゆる未受精卵を取り除く。
   注：未受精卵は、他の胚をポイズニングでき、単一細胞期または不透明であることが表示されます。
4. 彼らは40％の被包に到達するまで、実体顕微鏡を用いて、胚の発達の進行状況を監視し続ける。 40％の被包ステージ⁴⁰で2つの別個の層からなるように見える胚の球体形状を観察します。

3.ケミカル希釈の準備

1. 、-80℃で貯蔵からの化学ライブラリープレートを取り外し、アルミホイルでそれをカバーし、RTでそれを解凍。
   注：別のライブラリが使用されている溶剤に主に依存して異なる速度で解凍します。一般的に、-80℃で凍結化学ライブラリーは完全にRTで約3時間で解凍される。適切な危険物のラベルを持つ安全な場所に保管して解凍プレート（複数可）。着るppropriateアイウェア、実験室のコート、手袋二組の化学薬品を取り扱う。
2. 列96ウェルプレートの2-12にE3の99μlを添加する8チャンネルマルチチャンネルピペットを使用してください。
   注： -現在のプロトコル³⁹で説明したように、また、50μM、と私たちの経験から、薬物の範囲を開始する適切なは、10μMの間にある。 1 mMの化学ライブラリーストックプレートを使用している場合ここでは、10μMの処置を示す。
3. E3とのそれぞれのウェルに各化合物1μlを追加して8チャンネルマルチチャンネルピペットを使用してください。
4. 制御列（ここでは、カラム12）に1のDMSO液（または適切な溶媒）をピペットP10を使用してください。
5. アルミ箔は、ライブラリ内の任意の感光性化合物を保護し、保存のために-80℃にストック·化学ライブラリープレートを返しますように、アルミホイルで化学希釈プレートをカバー。

4.アレイ構成ゼブラフィッシュ胚

1. ペトリ皿を選択40％被包の段階でゼブラフィッシュ胚を含む。トランスファーピペットを用いて、慎重に（1.1ミリリットル）の各ウェルの内部に約10の胚を置き、深い96ウェルプレート。深い96ウェルプレートのカラム2-12に胚を分注する。
   注：研究者が最高の彼らが尋問したい発達過程に合わせた薬物添加の時点を選択する必要があります。プラスチックトランスファーピペットの使用は、胚の損傷を最小限に抑えることができる。薬物治療の前に40％の被包が増加胚致死性をもたらすことができるので、後から発生過程が検討されている場合は特に、長い前に薬物暴露へのための胚を開発しています。各ウェル以上の15-20の胚を配置することにより、混雑して避けるべきであると発達遅延につながることができます。これは、胚を含む深い96ウェルプレートは、化学的希釈を、96ウェルプレートとは異なることに留意することが重要である。
2. に過剰E3を各ウェルから過剰E3を削除し、排出するためにガラスピペットを使用して、液体廃棄物容器。
   注：このプロセスは、典型的には、研究者の速度に応じて1時間30分がかかるので、胚が完了することにより、50％および60％の被包の間である、ここに記載された化学希釈液の添加のための目標の発達段階である。プレートは、ピペットの先端が過剰E3をオフに描画するためにウェルの底部に押し付けることができるように、胚はウェルの底に落下させるために45°の角度で傾斜させることができる。

化学処理5.追加

1. 配列されたゼブラフィッシュ胚を含む深い96ウェルプレートに、それぞれのウェルに100μlの化学希釈液を転送するために8チャンネルマルチチャンネルピペットを使用してください。
   注： 例えば 、化学希釈プレート内のB1ウェル位置が深いのB1井戸の場所にピペットで（化合物の元の井戸の場所が対応する深い96ウェルプレート中のウェルの位置と一致することを確認してください96ウェルプレート）。
2. ペーパータオルを湿らせ、96ウェルプレートを保持するのに十分な大きさの感光性の容器に入れてください。
   注意：湿ったペーパータオル化学希釈液の蒸発を防ぐことができます。
3. 次に、深い96ウェルプレートを密封する感光性の容器に入れてください、そして28.5℃でそれをインキュベートするシーリングマットを使用してください。
   注：ゼブラフィッシュ胚が翌朝まで開発してみましょう。代わりに、プロセスのための適切な発達段階は、分析されるまで、胚が発達してみましょう。

化学物質の除去6.

1. 薬剤処理したウェルの各行にE3の300μlのを追加して8チャンネルマルチチャンネルピペットを使用してください。オフ描画し、ウェルのそれぞれの行からE3 /化学希釈を捨てる。 E3の300μlの胚を3回洗浄する。
   注：のみ、この目的のために使用ラベル容器に薬剤廃棄物を捨てる。洗浄を容易にするために、MULTを使用するのに十分な幅E3を充填したガラス流域を使用ichannelピペット。

7.プロナーゼおよびゼブラフィッシュ胚を修正

1. 4 24ウェルプレートにプラスチック製トランスファーピペットを用いてゼブラフィッシュ胚を転送し、その後、デッド胚を取り除く。彼らは元​​薬井戸の場所に対応するように24ウェルプレートにラベルを付けます。ピペットで胚を可視化するために、胚井戸クロスオーバーを防ぐために、各ウェル転送後に暗い背景の前で、ピペットを置きます。
2. 胚はかろうじて液体中に浸漬されるように、E3をオフに描画するためにプラスチック製のピペットを使用してください。
3. 各ウェルにプロナーゼ株式の2滴​​（50 mg / mlの）を追加するガラスピペットを使用してください。胚が5分間プロナーゼ中でインキュベートした後、絨毛膜がばらばらにさせるために井戸を攪拌してみましょう。彼らは、分析のための所望の発達段階にある前に別の方法として、胚をプロナーゼ。
4. E3で二回胚を洗浄するためにプラスチック製のピペットを使用してください。
5. 胚は、分析の所望の段階でコンプしたらletelyオフ描き、残りのE3を捨てる。
6. 各ウェルに、新鮮な4％PFA / PBSを追加するためにプラスチック製のピペットを使用してください。修正するために4℃CO / Nで胚をインキュベートする。最初に胚を修正するために解凍したてのPFAを使用してください。
   注：興味のあるあなたのスクリーンアッセイを実行するために進んでください。セクション8-10にここで詳述することはWISHで画面プレートを処理するための手順です。代替の方法は、必要に応じて、その後のセクション11に進み、結果を評価置換することができる。

8.胚透過処理

1. PBST胚から4％PFA / PBSをオフ描き、1X（Tweenでリン酸緩衝生理食塩水）で2回、胚を洗浄するためにプラスチック製のピペットを使用してください。その後胚から1X PBSTをオフに描く、48ウェルプレートに胚を移す。深い96ウェルプレートの元の井戸の位置と一致するように48ウェルプレートにラベルを付けます。
2. それを描き、100％メタノを追加し、プラ​​スチックピペットを用いてウェルに100％メタノールを加えて洗浄する胚に再びリットル。
3. -20℃で胚を置き、少なくとも20分間インキュベートする。あるいはまた、長期保存のために-20℃で100％メタノールに胚を保持する。
4. 100％のメタノールを除去し、50％のMeOH / 1X PBST、その後30％のMeOH / 1xのPBSTで胚を洗浄し、最後に二回1X PBSTで。
   注：胚より古い24時間後に受精（HPF）は、色素沈着^39を削除するに^は 、この時点で漂白することができます。
5. プロテイナーゼK（5μg/ ml）を使用液を調製する1×PBST 50mlに解凍したプロテイナーゼKストック（10mg / ml）を15μl添加する。
6. 胚から1X PBSTを取り外し、プロテイナーゼKワーキング溶液を加える。 4分後にプロテイナーゼKを取り外します。
   注：実験者は胚の劣化を防止するために、このステップの間に急速に動作するはずです。プロテイナーゼKの濃度およびインキュベーション時間は^、41治療中の胚の年齢に応じて変化させる必要がある。ここで説明するパラメータは、胚に関係それは24 HPFです。
7. 1X PBSTで胚を洗浄し、その後、氷冷4％PFA / PBSを追加。胚をRTで20分間、4％PFA / PBS中でインキュベートしましょう​​。

9.ハイブリダイゼーションおよびプローブの取り外し

1. ガラスピペットを使用した4％PFA / PBSを除去し、1×PBSTで二回、胚を洗浄する。 HYB ^+500μlの1×PBSTを交換し、70℃で4時間胚をインキュベートする。
   注：プレハイブリダイゼーションは、わずか2時間行うことができますが、4時間が理想的です。また、異なるハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度は、そのような65℃などの特定のプローブのための理想的かもしれませんが、個別にテストする必要があります。
2. 関心⁴¹の遺伝子（群）に対応するジゴキシゲニン標識リボプローブを生成します。
3. HYB ⁺の16ミリリットルにリボプローブの16μgのを追加します。使用前に少なくとも20分間70℃でリボプローブ/ HYB ⁺ソリューションを事前に温める。複数のプローブを使用している場合は、同じHと各プローブの16μgのを追加YBの^+容積 （16）を加えた。
4. ガラスピペットを使用して、HYB ^+を削除し、リボプローブ/ HYB ⁺混合液200μlに追加するためにP1000を使用しています。各ウェルに混合物を添加する前に一度使用直前にピペット上下リボプローブ/ HYB ⁺カクテルを反転します。リボプローブ/ HYB ⁺ソリューションを追加するために、バリアピペットチップを使用し、これは、ピペットに入るの混合蒸気を防ぐことができます。
5. 70℃CO / Nでリボプローブ/ HYB ⁺カクテルで胚をインキュベートする。 O / Nプローブインキュベーションし、次のホット洗浄のすべてのためのプレートウェルを覆うように接着フィルムを使用する。
6. 70℃CO / Nで50％ホルムアミド/ 2X SSCT、2X SSCT、および0.2×SSCTおよびプレ暖かいを準備します。
7. P1000を使用して、リボプローブ/ HYB ^+を削除し、-20℃で混合物を保存する。必要に応じて、3回までリボプローブ/ HYB ⁺の混合物を再使用しています。各再利用する前に、元のriboprにリボプローブ3μgのに追加OBE / HYB ⁺混合物。
8. ガラスピペットを用いて、70℃で30分間、50％ホルムアミド/ 2×SSCTで二回、胚を洗浄する。 70℃で15分間2倍SSCTで一度胚を洗ってください。 70℃で30分間0.2×SSCTで二回の胚を洗ってください。 0.2×SSCTを取り外し、室温で2回MABTで胚を洗う。

10.アンチジゴキシゲニン抗体インキュベーションおよび検出

1. 各ウェルからMABTを除去するためにガラスピペットを使用してください。プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、各ウェルに、新鮮なブロッキング溶液を加える。胚を室温で4時間ブロックにインキュベートしましょう​​。ブロック溶液（5000倍希釈）40mlの抗ジゴキシゲニン抗体の8μlを添加する。
2. プラスチック製トランスファーピペットを用いて、抗体/ブロック溶液でブロック溶液を交換してください。完全に胚をカバーするのに十分な抗体/ブロック溶液を加える。
3. 光が胚に貫通しないことができるように、アルミホイルで48ウェルプレートをカバー。株式会社4℃での胚のO / Nをubate。ガラスピペットを使用して、抗体/ブロック溶液を除去し、5-10分間ずつMABTで胚を10回洗浄する。
   注：それはウェルに新鮮MABTを各プレートからMABTを削除し、分配する研究者5〜10分かかりますようにMABTの洗浄は、連続的に行うことができる。
4. プレ染色バッファー40mlの（80ミリリットル合計）の2つのチューブを生成します。染色液を作成するために予め染色緩衝液の調製されたチューブのいずれかに180μlのNBTた（50mg / ml）および140μlのBCIPた（50mg / ml）を加える。
   注：この染色溶液は紫色の着色基板を生成します。
5. プレ染色緩衝液でMABTを交換し、胚を室温で5分間インキュベートしてみましょう。
6. 染色溶液で事前に染色バッファーを交換し、RTで去る。比色反応を実体顕微鏡を用いて、15​​分ごとに監視します。
   注：染色反応はプローブに応じて、多くの時間を数分からかかることがあります。
7. 代表染色反応が完了した後、1×PBSTを用いた染色液をレースし、次いで5分間、1×PBSTで二回、胚を洗浄する。
8. 1X PBSTを取り外し、胚を固定し、4％PFA / PBSを追加。
   注：あるいは、抗フルオレセイン抗体で標識したリボプローブを検出するために二重のWISHを行う。 in situで重を行う場合、1×PBST洗浄（ステップ10.8）の後、4％PFA / PBS（ステップ10.9）を加えるスキップし回MABT洗浄液で15分間、0.1 Mグリセロールで15分間、二回、胚を洗浄し、次いでブロック内で30分間胚をインキュベートする。そして、正しい抗体O / Nに追加して、正しい染色液を使って手順10.3から10.9を実行します。フルオレセインで標識されたリボプローブを検出するためには、赤い基板（10.1ステップ参照）を観察するBCIPとINTでの染色溶液を調製。

11.採点化学スクリーン胚プレート

1. 胚SAMPLを評価するために実体顕微鏡を使用して結果を視覚的にスコアリングを行う表現型アッセイにおいて、エス。
2. プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、最適な視覚化のための12ウェルプレートに48ウェルプレートから胚を移す。彼らは元​​の深い96ウェルプレートからのウェルの位置に対応するように12ウェルプレートにラベルを付けます。転送が完了すると、実体顕微鏡下で表示します。
   NOTE：代表胚は12ウエルプレートから選択し、カバーガラス⁴¹の下でスライドガラス上に結像することができる。

Results

ここで説明する手動のアプローチは、効率的かつ成功して小分子の化学遺伝学は、ゼブラフィッシュ胚モデル（ 図1）を用いてスクリーニングするハイスループットを実施するために単一の研究を可能にする。この方法を使用して、9週間にわたって（40時間の作業週にコミット）一人 ​​〜600の化合物（ 図1）の調査を行うことができるように、化学遺伝学の画面を実行する一人のために実用的である。このように、一人のベンチタイムは自動化されたシステムのように、高リソース要求の厳しい機器の必要性を回避することができます。トレードオフは、手動の画面は、専用の努力の数週間を必要とすることである。対照的に、自動化されたシステムの使用は、ロボットの時間の1~2週間に必要な時間を圧縮することができ、全体的に比較的最小限の研究者の努力を伴ってもよい。手動スクリーンの効率及び/又は範囲を増加させる1つの方法は、m個のスクリーニングを可能にするであろう、合計2-3研究者を参加させることである石化合物は、様々な化合物濃度、および/またはより短い期間にわたってスクリーニング。

WISH読み出しとゼブラフィッシュ胚における化学遺伝学の画面を完了するために、プロトコルに関係する主要な工程を示すフローチャート（ 図2）として示されている。 （1）化学物質曝露と胚標識、および（2）分析およびイメージング：実験的な作業は、作業週間の2つのタイプに分けることができる。化学物質暴露作業週では、これらの手順は、4日目（in situハイブリダイゼーション （3日目） において 、及びin situハイブリダイゼーションのための胚を準備する、ゼブラフィッシュの大人（1日目）、胚の収集、胚および薬物治療を配列（2日目）のセットアップが含まれる-6）。分析/イメージング週では、研究者は、胚および画像のヒット（日7-11）を採点するmRNAの発現を解析する。

化学遺伝学スクリーニングを行うの重要な部分は、一貫して正確にうまく位置を標識することである。化学遺伝学の画面pのようなrocessは、異なるプレートでウェルに一方のプレートにウェルから複数回の胚のセットを転送することを含む、化学ヒットが得点されたときに直線的にかつ容易にさかのぼることができるように、正確かつ明確な標識のための必要性は、最も重要であるここでは詳述し化学ライブラリー内でそのアイデンティティ（ 図3）へ。これを確実にする簡単な方法は、任意の時点での化合物によって処置された胚のセットのためのウェルの位置を直接それらの胚を治療するために使用される化合物の化学ライブラリ薬剤プレートのウェルの位置と一致するようにプレートを標識することである（ 図3）。ここで、カラーコーディング、数値ラベルのデュアルシステムは、永久マーカー（ 図3）を使用して、スクリーンプレートに添加したサンプルを整理するために利用される。

ハイスループットスクリーニングの結果を分析しながら、正確に整理する方法を開発注釈、および潜在的な小分子を分析するための重要な必要性があるヒット。したがって、化学遺伝学画面は慎重に設計されており、厳密に接着されている徹底した明確なグレーディングシステムを持っている必要があります。このようなシステムは、容易に、かつ完全に化合物の重要な動力学を伝え、完成したスクリーニングの結果を提示するための簡潔な方法を提供するべきである。このようなシステムを構築する1つの方法は、全体的な形態学的重症度およびヒットの信頼を説明するであろうクラスのシステムを利用グレードの胚である。さらに、クラスのカテゴリがと結合させることができた^（+）または（ ^{- ）}関心領域（複数可）に膨張又は還元作用のいずれかを記述する。ここでは、ゼブラフィッシュ胚は、24 HPF、50％の被包からの生物活性ライブラリ（エンゾ·ケミカルズ）からの個々の化合物が施された後ネフロンセグメント（ 図4A）を検出するために3つのリボプローブのカクテルを用いてWISHによってアッセイした。例グレーディングシステム、劇的に拡大した近convoluを持っていた胚のグループが含まれているだけでなく、前腎のテッド細管（PCT）、ゼブラフィッシュ胚腎臓、すなわちこの場合にも最も厳しい欠陥に関連付けられたクラスとの最高レベルを表すであろう（クラスI）として分類されて治療するために使用される化合物を生じさせる（ 図4B）観察された表現型に自信。 （ 図4B） -化合物は、完全な表記は（PCT ⁺のクラスI）であること、（PCT）および^（+）で注釈されるであろう。分類のこの概念は、薬物および領域である方法によって影響を受ける領域、生物に対する化合物の効果の重症度を含む、関心のある小分子に関する情報の宝庫を記述するための簡単​​かつ迅速な方法を提供影響を受けた（ 図4B）。

図1。＆＃160;手動ゼブラフィッシュ胚の化学スクリーン戦略研究者は、都合良くゼブラフィッシュ胚における化学物質の96ウェルプレートをテストし、1週間の間に、後続のWISH処理を行うことができる。化学試験（第1週（日1-6）と第2週（7-12日））の二週間を実行する解析をサンプリングするために専用の第3週とペアにすることができます。約画面サンプル分の2枚の96ウェルプレートを、3週（13-17日）記録し、画像化することができる。このシナリオでは、完全に9週間によってスクリーニング約600の化合物の小さなライブラリに等しくする、3週間の期間に約200化合物のスクリーニングに達する。このマニュアル戦略は、利用可能なリソースに応じて変更することができる。たとえば、3研究者は、それが1研究者と一緒に取ると9週に比べて3週間に約600の化合物の画面を完了する時間を減らすことができます。スクリーニング戦略は、薬物治療として、画面の特定の側面に研究者を割り当てることによって適合させることができるメントおよびin situハイブリダイゼーション 、または独立して、化学的ライブラリの別々の部分に全体のスクリーニングプロセスを実行するために、研究者を導く。

図2.フローチャート：6日間の画面のワークフローの内訳は、化学的なスクリーニングプロセスは、離散的に6日間に分けることができます。 1日目は、各96ウェルプレートをスクリーニングするために胚を供給するためにゼブラフィッシュの交配のペア（= /> 25）を設定で構成されています。 2日目は、薬物処理して、相手側のチャンバから胚を収集し、深い96ウェルプレートでそれらを配列することを含む。 3日目に、胚をdechorionation、組織の固定、及び胚の脱水を含む、WISHのために調製される。最後に、WISHはデイ4-6を通じて胚上で実行される。固定した標本上の代替染色手順をs容易にすることができることに注意してくださいWISHのためubstituted。

図3.プレート移動標識の概略図。ゼブラフィッシュの胚を配列し、96ウェルプレート中で処理薬剤はその後瓦礫撤去やプロナーゼ露光のために24ウェルプレートに移動されます。胚はその後、胚の準備、WISH、組織固定のために48ウェルプレートに移される。次に、胚は、スコアリング、画像化、および保存のため、12ウェルプレートに移す。胚の正確な整列は、各試験サンプルのための起源の化学物質を追跡するために研究者を可能にするカラーコーディングシステムを使用することによって達成される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4の例グレーディングシステム：腎臓セグメンテーションアッセイは WISH実験は、mRNAの転写位置の変化に応じて、胚の表現型の変化の評価を可能にする、選択されたプローブの同一性に基づいて、特定の細胞型を染色するために研究を可能にし、および/またはレベル。例として、ゼブラフィッシュ胚腎臓の三つのセグメントは、前腎は、画面のミックス1.画面のミックス1を用いて標識された特異的に足細胞（P）に局在wt1bからなるプローブのカクテル、近位尿をマークslc20a1aです細管（PCT）、および遠位初期（DE）セグメント^47をラベルslc12a1。 （ ^{- ）}記号領域の縮小を指示するために使用される領域のラベルの隣に^（+）記号は、拡張またはその領域の正のシフトに注釈を付けるために使用される。ここでは、EM13-シスRAで処理されたbryos薬が拡大近位尿細管と足細胞上の明らかな効果を備えた遠位セグメントの早期の完全な喪失を持っている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

ゼブラフィッシュにおける化学遺伝学は、創薬の進行に重大な影響を作ることができます。このプロトコルは、効果的に、小分子スクリーンを実施する個人または小規模なチームを可能にする、WISH読み出しとゼブラフィッシュ胚において、化学遺伝学を実行するために手動のハイスループット方法を提供する。この最小限の資源方法は、多くの研究グループが、化学遺伝学の可能性を拡張する。このようなシステムは広く研究部門全体ではアクセスできませんように具体的には、この画面戦略は、ロボット計装の使用に重要な代替手段を提供します。このマニュアルは画面には、6日間の作業週でWISHの読み出しを有する化合物の1の96ウェルプレートをテストするための単一の個人を可能にします。ゼブラフィッシュ以来、親の外に発生中の胚で、卵生であり、胚（1-3ミリメートル（mm））肉眼で見ることのに十分な大きさで、彼らは、単純な楽器との研究者缶アレイをサンプルと手作業のため適している顕微鏡を使用せずにマルチウェルプレート。ゼブラフィッシュは、急速に発展ので、小分子の曝露は、さらに手動の処理を最小限に抑える化合物の単回の治療ではなく、反復投与、と効果的である。彼らの卵黄が摂食稚魚の合併症を排除5-6日後に受精への栄養までのソースを提供するため、ゼブラフィッシュの胚は簡単に培養される。さらに、幼虫の臓器の大半を開発し、研究課題を幅広く研究する機会を提供し、この期間中に機能的になってきた。胚培養培地への小分子の単純加算は、非侵襲的であり、研究者（複数）は、薬物用量のための添加時期を選択することができ、かつ露光こうしての持続時間は、多くの変数を厳密に制御を提供し、特定の発達プロセスを可能にする興味の照会される。ここで説明したように、かなりの研究の生産性は、短いtimefrで達成することができるこのマニュアルのスクリーンの方法論を用いてAME。我々の経験では、そのような腎開発中ネフロンセグメンテーション（; PoureetezadiとWingert、未発表の図4）のように、興味のあるプロセスを分析することが知られた生物活性化合物ライブラリーを使用することにより強調することが可能に投資努力、高いリターンがあります。

それは、固定ゼブラフィッシュ標本上のアッセイが含まれるため、ここで説明マニュアルの化学画面は非常に汎用性があります。例えば、この戦略は一週間での化合物のいくつかのプレートをテストするために改訂することができますし、次の週の胚を獲得する。そのような免疫組織化学または他の組織染色の準備として、固定ゼブラフィッシュ試料上の代替のアッセイは、また、WISH読み出しの代わりに用いることができる。ゼブラフィッシュにおける細胞アッセイを行う実験的な戦略は、初期の発達段階の光学的透明性と透明性に適応可能である。さらに、研究者は後で駅で色素沈着を阻害することができるGESは、化学物質を使用するか、完全にキャスパーまたは薄手のゼブラフィッシュ¹³のような顔料レス遺伝回線を使用して、顔料の開発の複雑化を避ける。それは、プロセス、手動で小分子を投与することが関心のある汚れ（S）実現可能で、かつシンプルな実体顕微鏡を使用して胚を手動で採点する。しかし、自動画像解析を行うことができることを心に留めておくことが重要であり、実際には、高解像度表現型分析のために必要とされ得る。これは、サンプルの手動処理を合理化し、肉眼で容易に識別可能ではない違いを定量化し、研究者バイアス^15を排除するように、例えば、それは、そのようなトランスジェニックレポーターとして相手の直接アッセイによる自動画像解析システムに好ましいかもしれない。幸いなことに、いくつかの自動化されたイメージング·システムは、ソフトウェアのコスト¹⁵の面でユーザーフレンドリーかつ経済的の両方である。他の自動化システムの使用や能力は急速に進化してできています薬物治療を管理し、オリエント生物に使用すること、さらには生物^12,15を再配置する。これらの自動化システムは、研究の新しい技術の時代を予告しており、試験対象を大量に操作するので、HTSを実行するために革新的なソリューションを提供してきたし、HCSは全生物^12,15に近づく。そのような機械は紛れもなく便利なツールですが、彼らはまた、非常に高価であり、多くの基本的な研究機関のための手の届かないところにある。これらの自動機能にアクセスすることなく、それが化学の画面が不可能であることに思えるかもしれません。しかしながら、このプロトコルは、合理的な期間にわたり実際的な方法では、化学遺伝学の画面を完了するために使用することができる手動スクリーンを実施する方法のためのガイドを概説する。

一般的に、手動のスクリーニングおよび化学遺伝学のための欠点が存在し、化学画面を検討する際に留意すべきである。具体的には、ここで実証した方法は、中等度が必要物理的な器用さの。器用さは練習で改善されるように、この懸念は、反復を通して減少または完全に回避される。分析のためのウェルあたりわずか10の胚がある限りまた、グロスエラーのための最小限の余地がある。小分子が誘導されるので、興味のある化合物を同定するための合理的なスコアリングレジメンに接着しなければならない表現型の浸透率を変えることができる。それは、このプロトコルを利用して、研究者は、彼らがヒットを検討します何のために適切に厳格な基準を考案することが重要です。これは、画面のこの形式の性質は最も可能性の高いさらなる化学ワークアップを通して描写することができます偽陽性の特定の部分を、得られますことを心に留めておくことも重要です。また、正確に胚をステージングすると、非同期開発正確薬物治療の効果を評価する合併症を引き起こすことができるので、すぐに受精後のスクリーニングのためのクラッチを収集することが重要である。さらに、元のような化学的スクリーニングに関してでperimental戦略、制限事項のホストがあります。担体分子（ 例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO））の化合物の溶解性および毒性はまた、問題を提示することができ、多くの分子を試験する際に法外であってもよい。絨毛膜は、薬物曝露に対するバリアとして作用することができる。最後に、ゼブラフィッシュは、化学遺伝学のための強力なおよび翻訳モデルであっても、介護は常にそのような細胞株として、in vitro系を用いて、例えば 、代替の化学スクリーン戦略かどうかを決定する際に注意が必要、全体の使用の代わりに用いることができる動物。それは化合物の全身効果を収集するという利点を提供し、哺乳動物モデルにおいて試験する化合物のリストをトリアージするために研究者を可能にすることができるようにもかかわらず、全体のゼブラフィッシュ系における化学的処理は、哺乳動物における同様のアプローチを実施するに好ましいと考えられる。

現在までに、ゼブラフィッシュの化学スクリーンは強力な実験ツールtを提供しているO開発のメカニズムを描写し、そのような疾患の病態を防止することができる分子の同定としては、医療で用いるための候補薬理学的薬剤を確認する。例えば、バーンズらによる研究では、心筋⁴²内にGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を用いて、心拍数のための自動化されたマイクロウェルアッセイを開発しました。これらは、開発中の心拍数を分析するために、このトランスジェニック系統を使用し、それは薬物治療⁴²上にどのように影響を受けた。別の研究では、ゼブラフィッシュ胚での造血幹細胞の集団密度を試験することによって、プロスタグランジンE2は、HSCニッチ^23を調節することを同定した。この知見は、マウスで検証し、後にヒト臍帯移植^{23,31-33（NIH、}臨床Trials.gov、NCT00890500、NCT01627314）での臨床試験のために実装されました。いくつかの最近の研究により、化学遺伝学は、ゼブラフィッシュを用いて、腎疾患を研究するのに有用であることが証明されている 43アップ。ゼブラフィッシュ腎臓はネフロンの腎形成または再生を研究するための優れたパラダイム、開発および急性腎臓損傷⁴³の間に腎臓を含み、機能ユニットを提供する。ネフロン構造は非常にゼブラフィッシュ胚性腎臓および成人の哺乳類の腎臓^44-50の間で保存されている。化学遺伝学と組み合わせるとゼブラフィッシュ胚性腎臓を調べるいくつかの研究が明らかに本来の翻訳の可能性を示している。化学遺伝学画面が多発性嚢胞腎^（PKD）34キープレーヤーであることが知られている遺伝子PKD2およびift172にマッピングされた2つのゼブラフィッシュ変異体で実施した。画面には、通常、変異胚において見られる形態学的欠陥を無効にすることができる小分子のようなトリコスタチンA（TSA）阻害剤、汎ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）を同定をもたらした。デGrohと同僚が撮影した別のアプローチがinduc化合物についてスクリーニング腎機能³⁵の中断を示すことになる野生型ゼブラフィッシュ胚におけるED浮腫。ヒットとしてPTBAを識別した後、それらは浮腫を引き起こすことに加えて、PTBAはまた、腎前駆細胞のマーカーをpax2aの発現の増加が観察された。重要なことに、PTBAの最適化された誘導体は、その後、ゲンタマイシン誘発性腎臓損傷を受け、さらに、腎障害²⁷を患ったマウスの回復を加速成体ゼブラフィッシュのパーセントの死亡を減少させることが示された。まとめると、ゼブラフィッシュの化学遺伝学のこれらの寄与は、このプロトコルに記載された方法を用いて作製することができる発見のタイプを披露。

化学遺伝学研究は、実質的なメリットを担うが、それは特定の課題がないわけではない。単にそれが化合物によって影響を受けている特定の遺伝子または遺伝子を決定するために複雑にすることができ、化学遺伝学アプローチを用いて。ターゲットは、（複数の）発見された場合であっても、シgnificantギャップは、化合物の同定および小分子がどのように動作する作用機序（複数可）を理解する間に残ることができる。単一の化合物が、生物内の異なる効果の範囲を有することが可能であるため、例えば、小分子が作用する機構を決定することは困難である。しかし、新技術の出現や複数の化学遺伝学的スクリーニングはゼブラフィッシュに完成した状態で、メカニズムを決定する問題は縮小している。同定された化合物の分子の効果を判断するための一つの方法は、機構は、潜在的に、以前の注釈付きのデータから推定することができるスクリーニングのための既知の生物活性物質の薬物ライブラリを選択することである。また、ディスカバリーゲートのようなchemoinformaticアルゴリズムは、生得的なメカニズム¹⁴を有する化合物のデータベースに対する化合物の構造的類似性を比較することができます使用するために用意されています。化合物のメカニズムを解明するためのさらに別の方法は、MICRを生成することであろうその後oarray治療後のプロファイルや、接続マップなどのマイクロアレイ薬物プロファイルのコンパイルでこのプロファイルを照会、同様の効果^を引き出す¹⁴の機構的に定義される化合物を探索する。このアプローチは、目的の化合物と同様の効果を有する遺伝子変異体を同定するために用いることができる。化合物および変異体との間の接続を見つけることは化合物が化合物およびモルフォリノで突然変異体を処理することによって線引きすることができ、関連する遺伝子の分子的に上流または下流に動作することを提案するかもしれない。別のオプションは、ゼブラフィッシュのためのより最適化になることを継続している質量分析、だろう。この方法は、薬物治療後の特定のタンパク質の変化または翻訳後修飾を描写するために使用することができる。最後に、小分子あるいはライブラリ全体は時々結合パートナーのプルダウンのためにタグ付けされることが可能である。それは、また、注目に値することながら、どのように小分子の機能のメカニズムのi重要な輸入のsが、メカニズムは不明のままであるためにFDA承認薬があります。

ゼブラフィッシュは、両方の遺伝的および生理的に哺乳動物に多くの類似性を示すものの、依然として薬物クロスオーバー¹⁴の問題があります。ある研究では、ゼブラフィッシュ胚⁵⁰における細胞周期阻害剤のスクリーニングからのヒットのクロスオーバー能力を調べた。画面には、細胞周期活性を有することが以前に未知であった14のヒットが同定された。 6は、ヒトおよびゼブラフィッシュ細胞培養アッセイの両方において細胞周期活性を有することが見出された、3は細胞培養アッセイにおいて不活化血清であることが示されたこれらの14の化合物のうち、1はゼブラフィッシュ細胞において活性であり、4のいずれかにおいて活性を有さなかったゼブラフィッシュまたはヒト細胞培養アッセイが、唯一のゼブラフィッシュ生物全体で。注目すべきことに、唯一のゼブラフィッシュで活性を有した4化合物がprohiもゼブラフィッシュと哺乳類の間に違いがあることを実証している特定の化合物の並進潜在的なビット。しかし、これは、哺乳動物における腎回復速度を向上させるヒトレシピエントとPTBA誘導体で生着するHSCの能力を増幅するPGE _2、従って証拠を提供するような小分子の例は、存在に留意することが重要な考慮事項であるクロスオーバー^23,31-33可能であるという原則。

かかわらず、これらの落とし穴、化学遺伝学とこの最小資源アプローチの研究コミュニティを提供するために多くあります。化学遺伝学は、ゼブラフィッシュで特に有用であり、分子経路の尋問や創薬に重要な役割を果たしていきます。離散分子標的に基づく化学画面は歴史的に起因する吸着、分布、代謝、排泄、および毒性（ADMET）の特性⁵¹の星座として知られているものに、高い故障率の対象となっている。にゼブラフィッシュを用いた化学スクリーンむしろ離散目標より、プロセスに焦点を当て、いくつかのADMETの問題を回避し、生物全体のコンテキストで有効である化合物を同定することができます。現在の変異株とターゲットを絞った遺伝的変異体およびトランスジェニックを作成するために、ゲノム編集を使用する機能など、ゼブラフィッシュ研究のための利用可能なリソースの増加プール、と、ゼブラフィッシュを用いて、潜在的な化学遺伝学的スクリーニングの無限の数は事実上存在します。多くの化学ライブラリは、キュレーション、および既知の生物活性物質、構造的に多様かつ構造的に類似した新規化合物、とのスパンのコレクションされています。これらの試薬は、現在入手可能であり、さらに今後数年間で成長する可能性があるスクリーンの組み合わせのためのエキサイティングな機会を豊富に提供しています。手にこれらの可能性では、このマニュアルとハイスループットプロトコルは、ゼブラフィッシュを用いた化学遺伝学的スクリーニングに着手する研究グループの能力を向上するための実用的かつユーザーフレンドリーな方法を提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 - 10 μl ナチュラルピペットチップ	USA Scientific	1111-3800
1x E3			50x E3 と DI 水を使用して生成します。
1x PBST			1x PBS で 0.1% Tween-20 を生成します。
10x PBS	American Bioanalytical	AB11072
12ウェル染色皿	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	American Bioanalytical	AB13156
24ウェルプレート	BD-Falcon	35-3226
4% PFA/1x PBS			1x PBSで4% PFA(w/v)を生成します - 沸騰させてから凍結し、-20°Cで保存します。
48ウェルプレート	CytoOne	CC7672-7548
50x E3			水中で16.5 mM CaCl2、16.5 mM MgSO4、250 mM NaCl、8.5 mM KClを生成します。
96深い井戸の版	VWR	100-11-940
96の井戸の版のシーリングマット	VWR	10011-946
反ジゴキシゲニン抗体	ロシュ	11-093-274-910	-20 °Cで保つ。
BCIPストック	Sigma	B8503	100% DMFを使用して50 mg/mlを生成 - 凍結し、-20°Cで保存します。
ブロック溶液			10 ml BSA(10%)、5 ml FCS、および 35 ml MABT を使用して 50 ml を生成します。(BSAとFCSを37°Cで解凍します。
BSA(ウシ血清アルブミン)ストック	アメリカンバイオアナリシス	AB00448	でMAB中のBSAフレークを攪拌することにより10%BSAを生成し、その後凍結して-20°Cで保存します(未使用のBSAフレークは4°Cで保管してください)。
DIG/FLU標識リボプローブ in vitro転写反応試薬	Roche	11175025910; 11685619910	メーカーの手順にご相談ください。
DMF(ジメチルホルムアルデヒド)	American Bioanalytical	AB00450
DNase 1阻害剤、10x DNase 1バッファーRoche		4716728001
胚培養皿	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 μl	エッペンドルフ	22492284
エタノール (EtOH)	Sigma	E7023	分子グレードのH2Oと100% EtOHを含む70% EtOHを50 mL生成し、-20°Cで保存します。
FCS(子牛胎児血清)ストック	Invitrogen	16140089	-20°Cに保ちます。
フィルター滅菌ユニット	Corning	430516	0.45 μm CA / 1 L容量
の細かい鉗子	Roboz	RS-1050
平底マイクロ遠心チューブ	VWR	87003-300; 87003-298
ホルムアミド	アメリカのバイオアナリスティック		AB00600-20°Cに保ちます。
ガラス洗面器 90 x 50	Kimax Kimble	23000
ガラスピペット	VWR	14673-010
ガラスバイアル	ウィートン	225012
グリセロール		Sigma G7893
グリシン		Sigma G8898
グリコーゲン	ロシュ	10901393001
HYB+			50%ホルムアミド、0.1%Tween-20、5x SSC、5 mg/ml酵母トルラRNA、および50 μを生成します。l/μl ヘパリン
INTストック	Sigma	I8377	70% DMFと30% H2Oを使用して55 mg/mlを生成 - 凍結し、-20°Cで保存します。
MAB			、55.0 g の Trisma 塩基、8 ml の 1 M Tric-HCl pH 9.5、23.2 g のマレイン酸、および 17.5 g の NaCl を 1.5 L の脱イオン H2O に添加して生成します。次に、脱イオンH2Oを2Lに充填し、オートクレーブします。
MABT
メッシュ茶ストレーナー	イングリッシュティーストア	SKU#ASTR_KEN、MPN#1705
	Mediatech25-055-CM
マルチ8チャンネルピペット0.5-10μl	エッペンドルフ	3122000.019
マルチ 8 チャンネル ピペット 30 - 300 μl	Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
NBT stock	Sigma	N6876	70% DMFと20% H2Oを使用して50 mg/mlを生成 - 凍結し、-20°Cで保存します。
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡サービス	19210
PCRフィルム接着剤	Eppendorf	30127.48
プレート容器 (ペンシルボックス)	滅菌済み	1722
予備染色バッファー			0.1% Tween-20、50 mM MgCl2、100 mM NaCl、および 100 mM Tris pH 9.5 を生成します。(毎回新鮮に作っておいてご使用ください。
Pronase	Roche	11459643001	E3を使用して50 mg / mlを生成し、凍結してから-20°Cで保存します。
プロテイナーゼK	ロシュ	03-115-879-001	脱イオン水で10 mg/mlを生成し、-20°Cで凍結保存します。
RNase 1阻害剤	ロシュ	3335399001
ゴム球	フィッシャーブランド フィッシャーサイエンティフィック	03-448-22
染色液-紫	N/A	N/	A 45 μ を使用して生成;NBTのlと35 μプレ染色バッファーに必要な10 mLごとにBCIPのl。
染色液-赤			31.5 μ を使用して生成します。INTのlと35μプレ染色バッファーに必要な10 mLごとにBCIPのl。
実体顕微鏡	ニコン	SMZ645, SMZ1000
T3 RNAポリメラーゼ	ロシュ	11031171001
T7 RNAポリメラーゼ	ロシュ	10881775001
トランスファーピペット	Samco	202, 204
Tween-20 stock	American Bioanalytical	AB02038
waterbath	Thermo		51221073(モデル#2831)