生理的録音と黄熱病の蚊の味覚付属器RNAの配列決定ネッタイシマカ

サマリー

電気生理学的検査によって決定されるようネッタイシマカの主要な味覚付属における遺伝子発現を評価するために2つの方法を使用して、我々は、推定される苦味反発化合物に神経細胞応答の根底にある遺伝子のセットを同定した。

要約

>jove_content<蚊の感覚ニューロンからの活動電位の電気生理学的記録は、蚊の感覚ニューロンからの電気生理学的記録により、研究者はこれらの病気媒介者の化学的知覚を垣間見ることができます。 私たちは最近、直接的な電気生理学的調査を通じて、雌のネッタイシマカのラベルに、DEETやその他の忌避剤、および苦いキニーネに応答する苦味感知ニューロンを特定しました。 これらの味覚受容体ニューロン応答は、これらの接触化学受容組織で発現する推定化学受容遺伝子を解明するために、雄と雌の両方のラベラおよびタルシサンプルからの総mRNAのシーケンシングを促しました。 足根のサンプルは、男女ともに親胸部、中胸部、中胸部のサブタイプに分けられました。 次に、同じ組織サンプルでqRT-PCRを実施してデータセットを検証し、統計的手法を使用して2つの方法間で結果を比較しました。 分子機能に取り組む研究は、蚊による忌避知覚に関与する遺伝子を決定するために、特定の遺伝子を標的にすることができるようになった。 これらの受容体経路は、有害なウイルスの拡散を抑制するための宿主探索行動の混乱に向けた新規の忌避剤のスクリーニングに使用される可能性があります。

概要

DEET、Picaridin、シトロネラールとIR3535のような化合物は、効果的に重要な病気のベクトル^1,2 ネッタイシマカヒトスジシマカなどの蚊を、撃退することが示されている。私たちは、蚊の忌避に関与する細胞を決定するために、特定の味覚感覚器に関連した感覚ニューロンからの活動電位を記録します。これらの組織で発現された遺伝子の下流の配列決定と相まって、我々は、改善された撥水性機能のための新規な化合物をスクリーニングするために最も可能性の高いこれらの細胞の応答を媒介する遺伝子を同定することができる。

RNA-seqが迅速に遺伝子発現の時間的·空間的変化を追跡するための標準になりつつ、強力なツールです。昆虫化学感覚付属や臓器のRNA-seqの分析が大幅に遺伝子⁶により従来のPCRベースの検索遺伝子に改善し、いくつかの昆虫種^3-5の分子受容体を発見するために使用されている。昆虫は最も多様な動物のクラスを表す、事前遺伝子とユニークな表現型との間の接続を研究する多くの機会をセンディング。 RNA-seqの技術は、あらゆる生きている昆虫の組織に採用することができる。同様に、uniporous味覚感覚器内の感覚細胞からの電気生理学的記録は、多くの異なる昆虫種で達成することができる。これら2つの技術のペアリングは、研究者が観測された化学感覚表現型に関与セット遺伝子を絞り込むことができます。異なる種は、特定の課題を提示するが、化学感覚受容体遺伝子および化学感覚適応の間の接続を通知することができる。化学感覚感覚器のサイズおよび形態は可変であり、活動電位を記録する際のノイズを低減し、反復可能な信号を識別するために大規模なトラブルシューティングを必要とする場合がある。化学感覚器官の解剖は、昆虫の形態およびサイズ​​に応じて、些細なまたは繊細で時間がかかるかもしれない。高品質なRNAの回収は、そのような中に特定の顔料を避けるように、同様にいくつかのトラブルシューティングが必要な場合があります組織収集。

行動試験によって忌避化合物の効果を実証する直接的で有益であるが、このアプローチは、時間の作用機構に関して集中的かつ広い。 RNA-seqのと相まって電気生理学は、昆虫に回避行動を駆動何のより具体的な分析が可能になります。化学的差別の「キット」は、昆虫種で同定されたならば、既知の忌避剤に改善するためのより具体的な試みが可能である。これらの行動に関与する感覚細胞における受容体および関連タンパク質は、直接的な化学スクリーニングのために、異種発現されてもよい。さらに、分子モデリングは、化学物質は、これらの受容体⁷からの強い応答を誘発するかを予測することができます。

化学感覚組織の狭いセット内のすべてのアクティブな遺伝子のスナップショットは、他の種における類似の遺伝子を同定するのに有用であり得る。配列相同性および発現シを使用してmilarities、研究者は、最も可能性の昆虫に広く有効である忌避剤に対する応答を媒介する受容体分子の集合を形成することができる。私たちは、昆虫の化学感覚経路を解体の研究者を支援する非モデルと経済的に重要な昆虫のneuroethology掘り下げるために多くを説得するために以下のプロトコルを提示する。

プロトコル

1.飼育ヨンエ。ネッタイシマカ大人

1. 浅いトレイ内の約¾インチの水でハッチの卵。過密状態は、大人のサイズを小さくします。
2. 25°C（12 hLの：12-HD）でリア幼虫と接地魚の餌で飼育。
   注：過剰摂取は、生存率を減少させることができる。
3. 毎日のパスツールピペットによって個別に蛹を外し、細かいメッシュ蓋で小さな封じ込めバケットの内側にプラスチック皿（5.5センチメートル×9センチ）に移転、このように24時間の年齢グループを確立する。
4. ケージハウジングの画面の壁に置かれた綿球によるフィード大人の蚊10％のショ糖溶液の幼虫と同じ光周期の下で27℃、相対湿度70％の環境チャンバー内の蚊。
5. 電気生理学のために、5〜10日齢の動物を使用しています。一般に、大型動物、より良い結果を生む。 RNA単離のために、5〜10日齢の範囲内の単一の24時間の年齢グループ内にある動物を使用しています。

2。化学物質の調製

1. 選択した感覚ニューロンからの最小限の活動を誘発電解質の適当な濃度（ 例えば 1-10 mm）を決定します。 10 mMのNaClまたは1mMのKClを実験の開始時のベースライン活性を試験するために合理的な電解質である。
2. 適切な溶媒中で、各実験化学物質を溶解させる（ない場合は水、エタノールまたはDMSOを使用）単独の電解質に比べてスパイク活性にほとんどまたは全く効果を有している。 10％エタノールまたは1％DMSOの最終濃度は、妥当な出発濃度である。
3. 昆虫に送り抑止や覚せい剤を十分に記載されている制御化学物質（甘いのための苦いまたはスクロース例えばキニーネ）適切なを選択します。

3.電気生理学（先端記録^8;図1）

1. 機械的にガラスキャピラリーを引いてフォームガラス電極。熱を最適化し、適切な形状のrecordiを形成するために、ガラスを引っ張って設定を引っ張るNG電極。慎重には、ターゲット感覚子を包むのに十分な幅が、隣接する構造体との接触を回避するのに十分に小さい開いた電極チップを作成するために、解剖顕微鏡下でピンセットを使用してガラス電極の端部を断つ。
2. 顕微鏡下で、視覚的に形態によって特定し、先端記録の再現性を確保するために、ターゲット感覚器/感覚子を配置。準備は動物電極エントリの角度から感覚器への無料アクセスを許可する。
3. -20℃の冷凍庫に冷たい麻酔大人の昆虫。低温に露出オーバーにより末梢ニューロンへの損傷を避ける。スライドガラス上にカミソリの刃でセロハンテープの狭いストリップをカット。狭いストリップを使用してスライドガラス上に全昆虫を不動。
4. 無関心（アース）電極として機能するように背側胸部または眼の中に化学的に尖らタングステン線を挿入します。
5. 興味のある刺激溶液とステップ3.1で行われたガラス電極を埋める。挿入された注射器を使用して、キャップを埋めるエンドを鈍らに引か端からillary。プルダウン端部を保持、すべての気泡をはじく。記録と刺激電極として機能するようにステップ3.1で行われたガラス電極に銀線（塩化物化別売）を挿入します。
6. 昆虫におけるコンタクト化学受容の感覚器からの​​記録のために設計されてプリアンプに電極を接続します。このプリアンプ（300 HZ-3 kHzの帯域通過フィルタ）が可能なように導入を刺激に近づけ神経活動をキャプチャするセトリング時間を削減します。収集、保存、スパイク記録ソフトウェアを搭載したマイコンを使用して電気信号を解析する。
   注記：正しく記録セットアップを接地すると、急激に信号対雑音比を改善することができる。
7. 機能性を確保するために、コントロール溶液（電解液のみ）との感覚器を刺激する。すべての準備のための刺激アーチファクト次の200ミリ秒を開始するスパイクをカウントします。
8. 用量応答研究を除いて、すべての実験のための試験化学物質の順序をランダム化、バイアスを除去する。用量応答研究のために、実験的な化学物質の濃度を増加する感覚器を公開。十分な回復を確実にするために刺激間の3分の最小値を許可します。
   注：この要件は、昆虫や感覚器によって異なる場合があります。閾値は、標準誤差は試験した最低濃度の標準誤差と重ならないためにその濃度として定義される。

4. RNA単離および配列決定（図2）

1. しっかりとスナップキャップチューブに合わせて組織disruption.Prepare伴うRNaseフリー乳棒前にドライアイス上でそれらを冷却することによりしっかりとフィット無RNAse乳棒を準備します。積極的に過剰結露を避けるために、解剖しない限り、閉じたコレクションチューブを保管してください。
2. 性別によるコールドステージとソートに（-20℃の冷凍庫15秒）で濾過吸引器を使用して、30から40の冷麻酔をかけた蚊を置く。置き動物は味の付属を損傷しないように翼を把握し、ダウンサイド背側。
3. 細かい鉗子の二組を使用して、解剖顕微鏡下で男性または女性からペアのlabellaまたはtarsiを解剖し、隣接する組織を含めることを制限する。
   注：500ペアlabellaは全mRNAの約800〜ナノグラムが得られます。 400個々のtarsi（5セグメント毎に）全mRNAの1,200-1,800ナノグラムをもたらす。
4. あえぎ-鉗子の1対の、軽く内側のスタイレットを公開するlabellaのすぐ近位蚊口吻を把握する。コレクション-鉗子の他のペアを使用して、labellaを削除し、冷たい収集チューブの側に組織を追加します。
5. 鉗子の1対の、軽く脛骨と第一足根セグメントの接合部に蚊の足を把握する。鉗子の他のペアを使用して、tarsiを除去し、冷収集チューブの側面に組織を加える。
   注：希望と望ましくない組織の界面において考慮細胞型を取る。それは、組織を隣接の混入を制限することが重要であるが、所望の組織の一部を省略しないことも重要である。 FiのNALサンプルを正確に関心のある器官全体を表している必要があります。コレクション鉗子を正確に掻きのみ所望の組織をつかんことで解放することができるように、把持鉗子との正確な境界を作成します。
6. 定期的に、チューブの底に組織を維持するために9000×gで簡潔に0℃の遠心機でコレクションチューブをスピンダウン。水分が解剖時に採取管に蓄積する場合、採取した組織をカバーするために冷たいTrizol試薬50μlのを追加します。
7. 防汚ラボマーカーを使用して、明らかに1 RNaseフリー1.5ミリリットルコレクションの各組織型用キャップチューブスナップラベルを付けます。 1.5ミリリットルチューブラックと液体窒素を用いて、（トリゾールであれば細かい個）の微粉末に組織を挽く後、凍結。一回繰り返します。 1ミリリットルにトリゾールの全量を、ボルテックスで地面組織を懸濁します。
8. クロロホルム200μlのを追加し、完全に混合する。室温で5分後、4℃、15分間11000×gで遠心分離器でスピンダウン。慎重にゲノムDNAフィルターカラムに直接水層を追加します。 5分間11000×gでスピンダウン。スルー流れ、ピペットで混合するRNaseフリーの70％エタノールを等量加える。 RNAのコレクション列に液体を移し、提供の指示に従ってRNA抽出を続ける。
9. 定量化し、精密分光光度計で全RNAの純度を評価し、任意の標準RNA配列決定法を進める。

5.定量的RT-PCR RNAの配列決定の検証（図3）

1. 予測された配列の存在量と推定される化学感覚遺伝子機能の両方で、ダイナミックレンジの相対的な遺伝子発現レベルを比較するために、できるだけ多くの遺伝子を選択する。
2. 各標的遺伝子のための設計プライマー対は、特定の100-180塩基対のPCR産物を増幅した。セットごとに少なくとも1つのプライマーは、イントロン境界にまたがる確実にすることによって、非特異的なgDNAの増幅を除外する。あるいは、ゲノム汚染を低減するためにDNase処理を使用しています。
3. 集める前のセクションで説明したように昆虫組織。すべてのqRT-PCR反応を完了するのに十分なRNAを提供するために必要な組織を計算する。
   注：生物学的三連と技術的三連の反応は、結果の最大の自信を提供します。
4. 、生物学的および技術的の両方をそれぞれの各標的遺伝子の平均のために^{（Ctは[対象] -Ct [参照]）}を複製^- X _{ターゲット}として相対的な遺伝子定量化を計算します。生物学的反復の間のCt値を正規化し、相対的発現の比較でY軸スケールを根絶するために、ハウスキーピング遺伝子を使用する。
5. RNA-seqのと回帰ベース、ブートストラップ同値手順^9、反復的に各組織からのデータに、適用を使用して定量RT-PCRデータセットの類似性を評価する。
   注：この手順は、観察されたRNA-seqの及び定量RT-PCRデータの周りに構築することができる最小の「類似性の領域」を特定し、QRT-によって測定される相対的な遺伝子発現を可能にするPCRは、RNA-seqのにより相対的遺伝子発現の測定と統計的に同等であると考えられる。

結果

アエからの活動電位のトレース記録。ネッタイシマカ味覚感覚器（ 図1）化学物質の範囲の直接刺激の有効性を示す。この技術は、合理的な時間範囲（一般に500ms未満）にわたって所定の振幅と持続時間のスパイクをカウントすることによって、任意の刺激の化学への応答を定量することができる。トレース記録は、実験条件の所定のセットの下で容易に再現可能でなければなりません。そうでない場合には、観察された生理学的反応は、試験動物種の個体間の珍しい表現型を表すことができる。

生RNA-seqのデータは、丸みを帯びたRPKM（マップされた数がマッピングされた読み取り万人当たりの転写産物のキロベースの長さごとに読み込む）またはFPKM（百万分の転写産物のキロベース長さ当たりの読み取りフラグメントの数がマッピングされた読み取り）として表示される前にろ過し、正確なマッピングが必要です数値は（ 図2）。の区別これら二つのRNA-seqの正規化手法は、2つの精液の作品^10,11に記載されてい...

ディスカッション

味覚感覚器からの​​記録活動電位の最も挑戦的な側面はあるの応答を決定されている「通常」与えられた昆虫種、総数と味覚受容体ニューロンの感度（GRNs）の最初の時間を記録する単一の味覚感覚子チップを採用する場合であるそう不明。多くの予備録音は最初のテストの範囲や化学物質の濃度を決定するために必要とされる。この例では、我々は、単一のGRNはDEETの低濃度（ 図1）に応答したことを観察し始めた。その後、我々は、苦味または他の昆虫に嫌悪であることが知られている化学物質の濃度の範囲に同じ感覚器内の反応を検討し、同様のスパイク形状および振幅（ 図1）を観察した。これらの観​​察は、単一のGRNのサブタイプはこれらの嫌悪の化合物に応答することを示唆した。比較のために、我々はmosquに摂食を刺激することが知られて甘い化合物を試験した同じようなスパイクが発生したかどうかを確認するためにitoes。我々は、この場合、異なる、より大きなスパイクを観察した。同様に、3つの合計GRNサブタイプ数をもたらす、塩の刺激に応答して第三の中間サイズのスパイクを観察した。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラス毛細管	AMシステム	628000	標準、1.5ミリメートルX 0.86ミリメートル、4 "
銀線	AMシステム	7875.015	"裸
タングステンワイヤー	アルファ製品	369	0.127ミリメートル
直径ファイン鉗子	ファインサイエンスツール	11252	#5SF イノックス
再冷却ステージ	BioQuip製品	1429	チルテーブル
プリアンプ	Syntech	Taste Probe	電気
生理学用プリアンプソフトウェア	生理学用	Syntech	Autospike
TetraMin 魚料理	Tetra	Tropical fish food granules	魚料理 微粉末に粉砕した魚料理
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA単離試薬
RNeasy Plusミニキット	Qiagen	74136	には、gDNA エリミネーターと RNeasy スピンカラムが含まれています
ナノドロップ分光光度計	ナノドロップ製品	ND-1000	卓上分光計
R 統計	フリーウェア (Robert Gentleman と Ross Ihaka によって作成)	www.r-project.org	統計パッケージの lm 機能と Equiv.boot 機能を R コンピューティング環境で使用します。
1.5 mlチューブラック	エバーグリーン	240-6388-030	液体窒素をいくつかの空のウェルに注ぎ、ティッシュを凍結して粉砕します。
1.5 ml コレクションチューブ ベビーベッド付き	グレインジャー	6HAX6	RNase フリー
遠心分離機	サーモサイエンティフィック	11178160	凍結組織をスピンダウンして、1.5 ml チューブの底に保持します。
プライマー-BLASTプライマー設計ツール	NCBI	n / a