デジタルマイクロフルイディクスにBioanalytesの輸送を最適化するための縮小液滴表面相互作用の活用

サマリー

フィールドデウェッティングデバイス（Field-DW)の製造と操作のためのプロトコル、および液滴内容物に対する電界の影響に関する予備的研究について説明します。

要約

デジタルマイクロ流体工学(DMF)は、液滴を操作する技術であり、「ラボオンチップ」プラットフォームの開発のための有望な代替手段です。多くの場合、液滴の動きは表面の濡れに依存しており、電界の印加に直接関連しています。しかし、表面の相互作用により、動きは液滴の内容に依存するため、この手法の適用範囲は限られます。

この依存性を最小限に抑えるために、いくつかの代替案が提示されています。しかし、液滴やその周辺に化学種を追加することで、液滴部分と相互作用する可能性があります。この課題に対処するために、私たちのグループは最近、追加の添加物なしでDMF内の細胞とタンパク質を輸送できるField-DWデバイスを開発しました。

ここでは、モーションコントロールのための電子インターフェースを含む、デバイスの製造と操作のためのプロトコルが提供されています。また、デバイスを使用した研究も続けており、多細胞の比較的大きなモデル生物も、デバイスの操作に必要な電場の影響を受けずに輸送できることを示しています。

概要

液体を扱う装置の小型化は、「ラボオンチップ」のプラットフォームの開発のために最も重要である。この方向では、最後の二十年は、様々なアプリケーションで、マイクロフルイディクスの分野で大きな進歩を目撃した^。1-5同封チャンネル（チャンネルマイクロフルイディクス）内の流体の輸送に対照的な、DMFは、電極のアレイ上の液滴を操作する。この技術の最も魅力的なメリットの一つは、流体を輸送するための可動部がないことで、動きを瞬時に電気信号をオフにすることによって停止される。

しかし、液滴の運動は、液滴の内容、ユニバーサル」ラボオンチップ」プラットフォームの確かに望ましくない特性に依存する。タンパク質や他の検体を含む液滴が移動不能になって、デバイス表面に固執する。間違いなく、これをDMFアプリケーションの適用範囲を広げるための主要な制限されている; ^6-8不要な表面の汚れを最小にする選択肢は、潜在的に液滴コンテンツに影響を与える可能性が液滴またはその周囲に余分な化学種の添加を含む。

以前、我々のグループは、追加の添加剤（電界DW装置）なしで、DMF中の細胞およびタンパク質の輸送を可能にする装置を開発し⁹これは、液滴圧延を優先するデバイス·ジオメトリを有するキャンドルすす^、10に基づいて、面を組み合わせることによって達成されたさらに、液滴表面相互作用を減少させる、液滴に上向きの力をもたらす。このアプローチでは、液滴の運動は、表面の濡れに関連付けられていない^。11

以下に説明する詳細な方法の目的は、余分な添加剤を含まない、タンパク質、細胞、および生物全体を含む液滴を輸送することができるDMFデバイスを製造することである。フィールド-DWデバイスは、大部分が独立して液滴化学者の作業完全に制御プラットフォームへの道を開くRY。

ここでは、それを示す、本シミュレーションでは、デバイスの動作に必要な高電圧にもかかわらず、液滴の両端の電圧降下は、液滴内部bioanalytesにほとんど影響を示し、印加電圧のごく一部である。実際には、 線虫（C.エレガンス ）、生物学の研究のさまざまな目的で使用線虫を用いた予備試験では、電圧が印加されるとワームが乱さ泳ぐことを示している。

プロトコル

注：以下の手順では、実験室の安全ガイドラインは、必ず従わなければなりません。特に重要なのは、高電圧（> 500 V）および取り扱い化学物質を扱う安全である。

キャンドルすすと導電性基板の1.コーティング

1. 長方形に切断の銅金属（0.5mm厚75×43ミリメートル）。約20秒間水道水で洗って、約30秒間銅エッチング液に浸漬することにより、各銅基板をきれいにし、紙で乾燥させます。
   注：以下の方法1を使用する場合は、マシンに収まるように75×25 mmの寸法を変更します。
2. ほぼ均一なすすコーティングを得るために、30〜45秒間、銅基板の下に点灯してパラフィンろうそくをスイープ（約40μm厚）。火炎内部〜1センチメートルで基板を保管してください。脆弱なすす面に触れないでください。

2.コーティングでスート層の保護

注：スート層は非常に脆弱である、および保護のために被覆しなければならない。つの単純な代替案（メソッド1及び2）は、ここで提案されているが、より堅牢なプロトコルが現在開発中である。

1. 方法1
   1. 金属蒸発器またはスパッタリング装置内に試料をロードします。システムの操作手順に従って、チャンバを排気し、スート層（150〜200ナノメートル）の上に金の制御された堆積を開始します。デバイスは、室温まで冷却してみましょう。
   2. 化学フード内部10分間1-ドデカンチオール溶液（1％v / v、95％エタノール中で、ACS / USPグレード）、ディップコート金属化基板。その後、60°に近い角度でデバイスを保持し、静かにエタノールのみの数滴で表面を洗う。一晩、デバイスは、乾燥してみましょう。
2. 方法2
   1. 基板はまだろうそくの炎から温かいうちに化学フード内で、すぐに煤を基板上に塗布した後、のいずれかの側にフッ素化された液体の一部の液滴を堆積し基板、および90°に近い角度に基板を傾けます。より多くの液滴を堆積し、それらが全体のすす表面上を転がるましょう。
      注：液滴がスポットに当たるときは、煤がその領域から洗い流される。フッ素化された液体の液滴の広がりを可能な限りう。
   2. 化学フード内部のホットプレート（15分間160℃）上の基板焼く。
   3. 基板は、使用前に室温で一晩放置します。無期限に保管してください。

3.上部電極の作製（Abdelgawad らから適応^。12）

1. グラフィックデザインソフトウェアを使用して電極を描画します。各電極は、幅0.3mm、長さ2mmであり、電極間のギャップは0.3mmである。接点（下記参照、コネクタにスナップするため）との間のギャップは2.3ミリメートルです（ 図1）。
2. モナーク形式に柔軟な銅積層（厚さ35μm）（3.87×7.5インチ）トリム。他のサイズを使用してIプリンタと互換性fを。カラープリンタの手差しトレイに積層体をロードします。
3. 銅板に印刷する場合、エッチング中に印刷されたパターンを保護する、銅基板上のブラックインクの密度の高い層を可能にするために「リッチブラック」、または「登録黒"を使用してください（詳細についてはAbdelgawad ら ^12を参照）ことを確認してください。プリント基板に完全に乾燥させ、一晩。
4. 化学フード内では、（40°C）、銅エッチング液を50 mlのビーカーを温める。ビーカー内の印刷された積層体を浸し、ゆっくり約10分間溶液中にそれを振る。エッチング時間は、銅エッチング溶液によって異なります。数分ごとには、腐食を確認し、パターンが無傷であるかどうかを確認。
5. 慎重に水で積層体を洗って、化学フード内でアセトン、エタノールでコーティングを除去。もう一度洗って、優しくペーパータオルで積層体を乾燥させます。
6. 慎重にGLAに電極を積層板を取り付けるSSスライド（75×25ミリメートル、厚さの〜1ミリメートル）、両面テープを使用した。エアポケットを避けてください。
7. テープを使用して、電極にパーフルオロアルコキシPFAのフィルムを取り付けます。これは、液滴と電極の偶発的な接触を防止するのに役立つによる短絡の損傷上部電極。

4.（図2の回路）電子インターフェース

1. ユニバーサル回路基板にリレーやコンデンサCを半田付けします。
2. 電子回路用のブレッドボード上で10のリレードライバの残りの部分を組み立てます。
3. 各ワイヤは、制御基板内のチャネルに、運転者の入力をリレー。
4. 慎重にコネクタ（ 図3）に上部電極をスナップ。図に示すように、ワイヤそれぞれは、上部電極にドライバの出力を中継する。電気ノイズを最小化するために、リレーからの一対のワイヤ間に接地されたコネクタ接点があることに留意されたい。
   注：コネクターは、Tを制御するために調節可能なプラットフォーム上に座っ彼は距離頂部と底部との間（0.1〜0.5ミリメートル）（スートコーティングされた）基板。
5. その後2345年、3456 など ; 0.8秒、作動させるために1234年、すなわち運動（の方向に1電極をずらし、同時に4電極に高電圧（HV）アプリケーション（約0.8秒）のタイミングを制御するプログラムを使用してください。0.8グループごとに秒、その後、後方に、反対方向に移動するので、液滴も同様）。

5.液滴可視化と取扱い

1. CCDカメラと組み合わせ96X倍率アセンブリ - 液滴の動きを記録するために、24Xで構成されている可視化システムを使用する。 Sビデオを使用してカメラにビデオレコーダーを接続します。
2. Cを含む4μlの滴をピペットですす被覆基板の底部にあるメディアでエレガンス 。
3. 液滴上記〜0.3ミリメートルに上部電極を持参してください。液滴がより簡単に操作のための、ちょうど第五電極直下の、真ん中に近くなければなりません。
4. 電子インターフェースと高電圧（500 V _RMS）の電源をオンにし、それが移動を開始するまでの液滴に上部電極の距離を調整する。上部電極は、液滴を接触させてはいけません。
5. 電気パルスに応答したデバイス上で成功した液滴転送回数を記録することによって、データを収集する。成功した実験は、少なくとも700滴転送、 すなわち 、各電気パルスの後1転送することを特徴とする。
6. 滴が5から10パルスに応答して、もはや動かないまで、継続的にデータを収集する。
   注：表面が劣化し始めると、動きが近い液滴に上部電極にすることによって回復することができた。

結果

以前、我々は、DMF中のタンパク質の運動を可能にするためにフィールド-DWデバイスを使用している。特に、ウシ血清アルブミン（BSA）を有する液滴が以前に（添加剤なし）、他の著者によって報告されたものより2000倍高い濃度で移動することができる。これは滴と表面との間の相互作用の減少によるものであった; 図4は、蛍光標識したBSAを（。フレイレら参照実験の詳細については^、9）を含む液滴を示しています。左側の最初の画像はススでコーティングされた表面の上に座って、液滴を示している。中央の、液滴圧延を生成するだけでなく、さらに表面との相互作用を減少させる、液滴に上向きの力を加える、電界の影響。のみ（ろうそく煤なし）フッ素系液体でコーティングされた表面であるDMF中で使用される一般的な代替案へのせん断コントラストを（右）に注意してください。下部コンタクトaの表面との強力な相互作用ngle、かなり頻繁に運動を妨げる。

ここでは、現在、より大きな生物を含む液滴を輸送する、これらのデバイスでテストを継続する（...

ディスカッション

プロトコルの最も重要なステップは、直接、液滴を動かすの成功に関連付けられている、スート層の保護である。スート層（上記の方法1）を金属化することは、製造の成功の100％に近いことができる。しかし、最大動作時間は約10分である。おそらく、小滴のフラクションは、金属層の貫通孔煤湿潤される。フッ素化液体とのスート層をコーティングすることは、最も簡単かつ最速の代替であり、最小のリソースを必要とするが、製造された基板の作業（20分以内）のわずか40-50％ - とコーティングが均一ではない。実際には、スート層は、それは非常に脆弱であり、粘性フッ素系液体を容易に損害。現在、デバイスの動作時間を増加させるスート層を保護するために、より堅牢な代替案に取り組んでいる。しかしながら、一つの重要な側面は、表面への液滴の内容物の吸着である。以前は^、9我々 ^は ATTタンパク質の量を定量化デバイスの動作中に表面に痛いと相関が継続運動およびウシ血清アルブミン（BSA）の減少した表面吸着の間に発見された。それにもかかわらず、生物付着は、複雑な問題であり、何人かの著者も、それが完全に効果を抑制することは不可能かもしれないことを...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
パラフィンキャンドル			任意のパラフィンキャンドル
スパッタリングシステム	デントン真空、ムーレスタウン、ニュージャージー州		スパッタコーター デスクV Auターゲットを装備。
1-ドデカンチオール	Sigma-Aldrich	471364
テフロン	デュポン	AF-1600
フッ素 FC-40	シグマ-アルドリッチ	F9755	フッ素化液体: テフロン AF 樹脂を Fluorinert FC-40 で 1:100 (w/w) 調製して、疎水性コーティングを作成します。
グラフィックデザインソフト - Adobe Illustrator	Adobe Systems		他のソフトウェアも使用される場合があります。
銅ラミネート	デュポン	LF9110
レーザープリンター	ゼロックス	フェイザー 6360 または類似品	「リッチブラック」または「レジストレーションブラック」との互換性を確認してください(本文を参照)。
銅エッチング	、トランセン、	CE-100
、パーフルオロアルコキシ(PFA)、フィルム	McMaster-Carr	84955K22
ブレッドボード、	Allied Electronics	、70012450、または同様の	10個のドライバーを組み立てるのに十分な大きさ。
ユニバーサル回路基板	Allied Electronics	70219535または類似の
コネクタ	Allied Electronics	5145154-8または類似の
制御ボードおよび制御プログラム(LabViewソフトウェア)	National Instruments	NI-6229または類似の
高電圧アンプ	Trek	PZD700
コンデンサ CおよびC1、100 nF、60 V	Allied
トランジスタT、NPN	連合
ダイオードD、1N4007	連合
リレー	連合国
可視化システム	エドモンド・オプティクス	VZM 200i または類似	システム倍率 24X – 96X.日立KP-D20B 1/2 in CCDカラーカメラと組み合わされています。
レコーダー	Sony	GV-D1000 NTSCまたは同等品	カメラとSビデオケーブルで接続します。
シミュレーション	COMSOL Multiphysics	V. 4.4