このプレゼンテーションの目的は、 生体内および昆虫病原性線虫の飼育のためのインビトロ技術に実証することである。 インビトロ法は、リッチ寒天培地を利用し、一方、 インビボの方法は、昆虫宿主でこれらの線虫の飼育を考えてみましょう。
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方法論記事
in vivoおよび昆虫病原線虫の体外飼育には（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）
この記事について
サマリー
要約
昆虫病原性線虫（EPN）（SteinernematidaeとHeterorhabditidae）は 、腸内細菌科にグラム陰性ガンマプロテオバクテリアと共生のパートナーシップを持っている。 フォトルハブダスは heterorhabditidsの共生している間Xenorhabdus細菌がsteinernematids線虫に関連付けられています。一緒線虫や細菌は親密で、特定の提携で昆虫種の広い範囲を殺す強力な殺虫複合体を形成する。ここで、私たちは、生体内で 、一般に実験室条件下で、これらの線虫の飼育に使用されるインビトロ技術で実証している。さらに、これらの技術は、EPN培養の確立に成功するための重要なステップを表し、また、研究のために、これらの生物を利用する他のバイオアッセイの基礎を形成する。 aposymbiotic（シンビオントフリー）線虫の生産は、多くの場合、深いと共生の研究に多面的なアプローチのために重要である。このプロトコルは、抗生物質の添加を必要とせず、標準的な実験装置を用いて短時間で行うことができる。貯蔵におけるそれらの生存が使用される種に依存して変化し得るが、このようにして製造線虫は、比較的ロバストである。このプレゼンテーションで詳述技術は、P株価の研究所、アリゾナ大学（ツーソン、アリゾナ州、米国）により、さまざまな著者によって記載され、洗練されたものに対応する。これらの技術は、害虫管理の目的のためにこれらの生物の大量生産に使用される技法の本体から区別される。
概要
昆虫病原性線虫（EPN）SteinernemaとHeterorhabditis属 。 （Steinernematidae、Heterorhabditidae）とそれらの細菌の共生、XenorhabdusとのPhotorhabdus属（腸内細菌）が陸生動物-微生物共生関係2-4,6,10,19。XenorhabdusとのPhotorhabdus属の創発モデルと考えられている。また、感染性若年性（IJ）として知られている線虫の唯一の自由生活段階、または第3段階感染幼若8,10,13の腸内に共生として保有されている。細菌線虫ペアは昆虫の広い範囲の病原性であり、成功裏に6,8、世界中の生物学的制御と統合された害虫管理プログラムに実装されています。
ここで私たちは、生体内で 、頻繁に実験室条件下でEPNの飼育のために行使されたインビトロ技術での選択を示している。 私をnは、生体内の方法は、線虫の飼育用の昆虫宿主を企図している。通常、さまざまな昆虫の受注（ すなわち鱗翅目 、 甲虫目 、 双翅目 、 等 ）の未成熟な段階は、適切なホストとみなされます。メソッドは、通常、実....
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プロトコル
彼らのSymboitic細菌と昆虫病原線虫の1。 インビボ飼育
- 100×15ミリメートルのプラスチックシャーレを反転し、皿のふたにろ紙（90ミリメートル）の2つのディスクを配置します。
- 均等に濾紙上（1,000〜2,000 IJ / mlの濃度で）IJ（感染少年）水懸濁液1mlを分配する。
注：IJSは表面殺菌する必要はありません。 - 皿に大きなwaxmothのハチノスツヅリガの10終齢幼虫を追加します。目標は、約100〜200 IJS /幼虫を提供することにある。
- ペトリ皿（ 図1）の底部とふたをカバーし、ペトリ皿にラベルを付ける。以下の情報に言及：線虫種名（既知の場合）;コード/指定を隔離する。日付感染トラップが設定されました。
- （水分を節約するために）緩く密封されたビニール袋の中に皿を置き、どちら室温または20〜25℃の間のインキュベーター内で暗所に保管してください。毎日の料理をチェックする
注：それは土壌中に自然感染状態を模倣として闇は、線虫の感染を容易にします。 - 3〜5日後に、変更されたホワイトトラップ7への線虫感染の兆候で死体を取り除く。
注：死体が腐敗の臭い場合、これは培養が成功しなかった、および/または汚染があったことを示す可能性があります。線虫および昆虫の新しいバッチで新しい....
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結果
in vivoでの飼育方法は、線虫の成長と再生のための宿主としてのライブ昆虫を使用しています。感染室は昆虫のIJSを露出させるための効率的な方法である。これは別の昆虫宿主から細菌共生ベクトル線虫のライフサイクルにおける唯一のステージである。1は感染室だけでなく、このチャンバーを構築するために必要な材料のために設定示しています。 インビトロ飼育方法を許可EPN昆虫宿主なしで成長するだけでなく、aposymbiotic（シンビオントフリー）線虫の飼育のために実装されています。 図2を参照すると、別の線虫のステージを有する脂質寒天プレートを示している。寒天プレート脂質はまた、生物種の概念に基づいて、線虫のアイデンティティを検証するために必要とされるクロスハイブリダイゼーション試験において考慮することができる。肝臓、腎臓寒天法は、もともとPoinar·トーマス（1966）14によって記載された。この方法では、線虫が成熟しreproducすることができます昆虫宿主なしで、電子とその共生細.......
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ディスカッション
適当な宿主を使用すると、EPNの生体内で飼育することに成功するための重要な要因である。通常、両方steinernematidsとheterorhabditidsを再現することができますし、正常に高いワックス蛾、 ハチノスツヅリガ （鱗翅目：メイガ）の幼虫で、そのライフサイクルを完了。しかし、異なるファミリーおよび/または指図から他の昆虫種が考えられる。現在記載され線虫種のいくつかは、特定の昆虫宿主に対する特異性を有することが知られている。例えば、S. kushidaiとS. scarabaeiは鱗翅目の幼虫に非常に病原性はなく、そのような実験室で成功した飼育用のコガネムシの幼虫（コガネムシ科）などの甲虫の幼虫を必要としています。別の種、S. scapterisciは、コオロギやケラなどの直翅目の昆虫を好む。
適切なホストが使用できないか、実験条件は、それを必要とする際に、 インビトロ法は、EPの飼育のために使用することができる場合にはN.これらの方法は、線虫.......
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開示事項
利害関係が宣言されていない。
謝辞
これらのプロトコルの多くの改善への貢献のために明ミン·リー、キャスリンPlichta、ビクトリアミランダ·トンプソンとサム·キュッキム：著者は、在庫ラボの過去のメンバーに感謝したい。この作品は、SP株に国立科学財団の助成金IOS-0840932およびIOS-0724978によって部分的に資金を供給された
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| In vivo 感染症 | |||
| 100 x 15 シャーレ | VWR | 25384-088 | |
| 濾紙、9 cm グレード 1 セルロース | Whatman/VWR | 28450-081 | グレード 1 濾紙推奨 |
| 昆虫ホスト | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella推奨 |
| 肝臓腎臓寒天培地用(500ml用) | |||
| 60 x 15 mm シャーレ | VWR | 25384-092 | |
| 牛レバー、50 g | 地元産、肉屋またはスーパーマーケット | 残りは冷凍および解凍して将来の使用のために保存することができます | |
| 牛肉腎臓、50 g | 地元産、肉屋またはスーパーマーケット | 残りは、将来の使用 | |
| のために冷凍および解凍して保管できます塩化ナトリウム 2.5 g (0.5% 最終濃度) | Acros/VWR | 200002-434 | 任意の研究グレードの NaCl を使用できる |
| 寒天、7.5 g (1.5% 寒天、最終濃度) | HiMedia/VWR | 95026-642 | 任意のメディアグレードの寒天 |
| 500 ml 蒸留 H2O | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 シャー | VWR | 25384-088 | |
| 栄養ブロス、8 g | BD / VWR | 90002-660 | |
| 抽出物、5 g | EMD / VWR | EM1.03753.0500 | |
| マグネシウム六水和物10 ml(0.2 g / ml) | EMD / VWR | EM-MX0045-1 | |
| 油、4 ml | 任意のブランド | 産、スーパーマーケット | コーン油の任意のブランドを使用できます |
| コーンシロップ、96 ml 7 ml コーンシロップを 89 ml 加熱 H2O と渦巻き模様で均質性 | Karo | 地元産; スーパーマーケット | |
| 寒天、15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | 任意のメディアグレードの寒天 |
| 蒸留 H2O、890 ml |
参考文献
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M.
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再版と許可
