網膜色素上皮細胞に貪食アッセイのためにブタまたはウシの感光体外側セグメントの大規模精製

サマリー

この記事では、ホモジナイゼーションとショ糖勾配遠心分離を用いたブタ/ウシ網膜からの超遠心分離による光受容体外側セグメント断片(POS)の精製のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルにより、標識付きまたは標識なしのPOSアリコートを大量に調製し、-80°Cで保存することができます。

要約

網膜色素上皮（RPE）細胞は、光受容体の外側セグメント（POS）の過ごし熟成末端断片の食作用の重要な機能の一つの分析は、 インビトロで行うことができる。光伝達機構を含む膜状のディスクのスタックを持つ光受容体の外側セグメントは、連続して網膜にリニューアルされている。使用済みPOSは、RPE細胞によって毎日排除される。齧歯類、ブタ/ウシおよびヒトRPE細胞は、同様に、様々な種からのPOSを認識する。小さな変動を用いた実験の大規模シリーズを実行しやすくするために、POSの大きい株式は、ブタの眼から単離し、そしてアリコートで凍結保存することができる。このプロトコルは、暗所に保存するとき、オレンジ色を表示する光色素の特性を利用しています。暗赤色灯の下では、半分にカットしオープンしたアイカップからバッファに網膜収集されます。網膜細胞懸濁液を均質化し、濾過し、そして連続的なスクロース勾配上にロードされる。 CENの後trifugationは、POSを特徴オレンジ色のグラデーションの上部に分離したバンドに位置している。 POSは、次いで、収集紡糸、洗浄緩衝液で連続的に再懸濁し、計数し、等分している。このようにして得られたPOSは、POSチャレンジ後の種々の時点で食作用アッセイおよびタンパク質活性化、局在、または相互作用の分析のために使用することができる。代替的に、POSは、フルオロフォア、 電子 。 グラムで標識することができる。、FITC結合POSまたは飲み込みの後続の蛍光定量に等分する前に。他の可能な用途は、酸化的ストレスまたはRPE細胞の老化の影響を研究するためにストレス条件と組み合わせて改変POSまたはPOSチャレンジの使用を含む。

概要

網膜では、ビジョンは、脳内の視覚野までの神経細胞との間で伝送することができる信号に変換される前に、オプシンと呼ばれる感光性分子の異性化によって誘発される。これらの分子は、光受容細胞の外節部（PRの）を構成するパンケーキに似た膜状ディスクのスタック内に埋め込まれている。光酸化ストレス、したがって、かなりのレベルまで一定の曝露を受けること、PRは、連続的に潜在的な酸化的損傷を制限するために、それらの外側のセグメントを更新する。光受容体外側セグメントは、隣接する網膜色素上皮（RPE）細胞の頂端微絨毛に密着している。 RPE細胞は、血液網膜関門の外側部分を構成し、このようなメラニン色素、光反応性オプシン成分レチナールの再異性化、栄養素を提供するとgを介して光線を急冷などの光受容体の健康と機能¹に重要である多数のタスクを確実にPR代謝物処分に参加し、要因をrowth。

また、RPE細胞は、POSを過ごしたとそのコンポーネント、哺乳類の網膜^2,3に概日リズムによって調節されている毎日の占領をリサイクルなくす。小屋のPOSのクリアランスは、PRの生存のために絶対に必要である。それが完全に廃止されると、POSの破片が蓄積し、PRSは急速な失明の^4,5の原因と縮退。リズミカルなプロファイルが失われ、一定の活動に置き換えている場合は、PRおよびRPE欠陥が⁶歳に蓄積する。したがって、その機能不全にリンク表現型を理解するために、インビトロでの RPEの食作用の分子の調節を特徴づけるために非常に重要である。興味深いことに、RPE細胞における分子機構は、アポトーシス細胞をクリアするためにマクロファージによって使用されるものと非常に似ており、両方とも、食破片^7-9の露出したホスファチジルセリンの認識に依存している。それでも、RPE細胞およびマクロファージがphを調節マクロファージが遭遇時のアポトーシス細胞の即時撤廃を選ぶようagocytosisは異なって、RPE細胞は、リズミカルに外節との永続的な接触にもかかわらず、一日一度だけPOSを巻き込むながら。これは、まだ完全に理解されていない特定の調節メカニズムを示唆している。

RPEの食機械に関与する分子の多くは、孤立したPOSおよび細胞培養食作用アッセイの使用のおかげで同定または検証されています。 RPE頂端細胞表面に位置alphavbeta5インテグリン受容体は、そのリガンドMFG-E8と連携して、その後MERTKチロシンキナーゼ受容体^13-15を介して内在化されるPOS ^10-12に特異的に結合する。 CD36スカベンジャー受容体は、POS摂取に関与し、その速度^16,17に影響^を与えること^が示されており、POS面¹⁸における酸化リン脂質のセンサーとして機能するかもしれない。内在化は、F-アクチン細胞骨格-尻の動員を必要とするそのようなアネキシン2 ^19、ミオシンII ²⁰とミオシンVIIA ^21,22としてociatedタンパク質。 インビトロでのネイティブまたは酸化POSも乏しい消化酸化さPOS ^23-28の蓄積に連結されたインビボでの RPE細胞の老化の表現型を理解するために利用される。幹細胞由来のRPE細胞の生成は、それらが動物または患者^29,30,27に移植する前に、細胞の機能性を証明するために使用される単離されたPOS用の新しいアプリケーションを開始した。

まず1987年³¹モルデイらによって記載され、ウシPOSの単離のためのプロトコルは、（11- シスレチナールを運ぶ）無漂白レチナール光色素の特徴オレンジ色の外観の観察と連続ショ糖勾配上の網膜ホモジネートの超遠心分離ステップを兼ね備えています。過去10年間に、狂牛病の危険性を最小限にするために取ら予防のためには、ブタの眼の使用がincreasiとなっているngly目立つ。ここで説明するプロトコルは、ブタまたは等分して、長期間保存することができるウシ目からPOSを大量に取得する方法を示します。これは、POS調製及びアッセイ^32,33,21,22当たり多数の動物を使用する必要が齧歯類目からPOSを用意する必要がなくなる。また、蛍光分子を使用して保存前のPOSラベル付けについての詳細は食作用アッセイ^32,10の後、標識POSに比べていくつかのアプリケーションのために簡略化し、比較可能な方法でPOSを定量化し、可視化するために、与えられている。したがって、これらの大型株を実験の多くの異なる種類で再現性と使いやすさを可能にする。

プロトコル

このPOS分離実験は時間がかかり、POSは保存前標識されている場合は、完了するために12時間まで必要な場合があります。プロトコルは、1987年³¹でRSモルデイらによって発表された論文から適応し、1997年¹⁰でSC Finnemannらによって修正されている。

動物は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科（ARVO）計算書の研究のための協会による取り扱った。プロトコルは大学ピエールとマリー·キュリー·パリ06とフォーダム大学施設内動物管理使用委員会から見直し、チャールズ·ダーウィン倫理委員会によって承認された。

1.一般セットアップ

1. できるだけ早く屠殺した後、新鮮な80新鮮な豚や牛の目を入手して、暗闇の中で冷蔵保管してください。会社が同じように進行するようにプロバイダに指示を与える。このプロトコルは、80の目のために最適化されています。へもっと目を進め、より大きな株式を取得する（ 例えば、160目から）、ソリューション量を倍増し、超遠心分離の2ラウンドを行う。プールのサンプルは、後の収集ステップ（ ステップ2.2.2を参照）。
2. 赤いセーフライトランプ、吸収パッドはベンチに設定し、（ 材料表 ） を拭き取る。廃棄物収集（未使用の眼の部品、ガラス質の...）のために15cmの皿とバイオハザードバッグを準備します。タイトフィットlabcoat、手袋、スリーブプロテクタとゴーグルを着用してください。
3. 注意事項：
   1. すべてのソリューションは、すべてのステップの間に冷たいそれらを保つ事前冷やす。できるだけ多くの氷上で冷却目とグラデーションにしてください。
   2. 視覚色素と光色素の活性型のオレンジ-ピンク色の損失の光退色を避けるために、超遠心分離後の回収工程まで、可能な限り多くの暗闇の中で目や由来の組織にしてください 。

2.プロトコルアクション

1. ソリューションや勾配を準備します。
   1. 37℃の水浴を用いて完全にタウリンストックを解凍する。
   2. ストック溶液（ 表1、ストック溶液）からのすべてのソリューションを準備し、各ソリューションのための磁気攪拌機を使用して他の成分で十分にショ糖を混ぜて。
      1. 20％ショ糖の最終濃度に均質溶液15mlを調製し、20 mMのは、2のMgCl _2、10mMのグルコースおよび5mMのタウリンを酢酸pH7.2のトリス。
      2. （70％スクロースストックを使用して）、25％スクロース、20mMのトリス酢酸pH7.2で、10mMのグルコースおよび5mMのタウリン、最終濃度25％スクロース溶液を調製する。
      3. （ショ糖粉末を使用して）60％のショ糖の最終濃度は60％スクロース溶液を調製し、20mMの酢酸塩pH7.2で、10mMのグルコースおよび5mMのタウリントリス。
      4. 20 mMのトリス酢酸pHは7.2と5 mMのタウリンの最終濃度まで洗浄1溶液を調製する。
      5. ウォッシュ2溶液を準備10％スクロース、20mMのトリス酢酸pH7.2の5 mMのタウリンの最終濃度にした。
      6. 10％スクロース、20mMのリン酸ナトリウムpH7.2の5 mMのタウリンの最終濃度まで洗浄3溶液を調製する。
   3. マグネチックスターラー上勾配メーカーを着実にし、60％溶液が挿入される出口に最も近いチャンバー内の攪拌棒を挿入します。適切な鋳造速度を達成するために、チューブの出口に配置されたカットオフP200のピペットチップを使用してください。
   4. 予備冷却超遠心チューブに各溶液から12ミリリットルを用いて25％の1（80目のためすなわち、合計6管）60％ショ糖溶液を希釈し、攪拌することにより微妙に線形グラデーションをキャストします。よく徐希釈60％スクロース溶液を撹拌した。速すぎてスムーズにしない溶液を注ぐ、勾配流速を安定。
      注：連続、線形勾配を得るために、右全体勾配のための溶液の表面にピペットチップ開口部を維持formatioN。
   5. 勾配が安定化のために約1時間、氷の上に座ってみましょう。ロードされるまで冷やし勾配を保管してください。勾配の破壊を防ぐために、チューブを振らないでください。
2. 組織収集：
   1. 暗赤色灯の下での組織を収集します。片手に目を取り、離れて目を保持しながら、カミソリの刃のエッジと正面を突く（飛散を避けるために、 図1）。 2半分（角膜プラス強膜に少なくとも5ミリメートル）に前方眼球をカットするカミソリの刃を使用してください。レンズを取り外し、それは、このように網膜を露出する1指の先端の上に保持できるように裏返しにアイカップを反転。
   2. 角度でカミソリの刃を使用して、優しく簡単に取り外しとタペート表面から、ピンクがかった層として現れると視神経乳頭（ 図1）で切断、網膜をこすり。 2×50ミリリットル管氷上で均質化溶液15mlを含む各内のすべての網膜を収集します。
   3. 網膜ホモgenization：
      1. 異なる細胞層を破壊PR細胞、断片POSの残りからPOSを破壊し、網膜の懸濁液を均質化するために、2分間手で激しく懸濁液を振る。
      2. 大きな組織片を除去し、清潔な50mlチューブ（ 図1）において、フロースルーを収集するために清潔なガーゼの二重層を通して3回濾過する。収量を最大化するために、非常に厚いという網膜の懸濁液は、静かにそれぞれの濾過後に残った断片化された組織を解放するためにガーゼに押します。
3. 光受容体外側セグメント断片（POS）の分離：
   1. 60％ショ糖勾配（ 図1） -各生鮮冷蔵連続25の24ミリリットルを含む超遠心チューブ、チューブあたり7mlの30×6オーバーミリリットルを-優しく6の周囲に、原油網膜の準備を築く。ローターを使用するために、必要に応じて、対向するチューブのバランスをとる。 4℃で50分間の106000×gで超遠心機。
   2. 吸引（ 図2A）により勾配の上部3分の1で、オレンジ·ピンクバンド上記溶液の大部分を削除します。ビーカーにカットオフP1000の先端でオレンジ - ピンクバンドを収集します。漂白剤（生物学的な廃棄物）を使用して中和した後、残りを捨てる。
   3. 氷冷洗浄1溶液の5ボリューム - 〜4で希釈します。必要な数の30ミリリットルチューブに区切ります。 4℃で10分間3000×gで遠心し。注意深く上清を捨てる。
   4. 上記で詳述したように10ミリリットル中に再懸濁ペレットを10分間3000×gで2溶液とスピンを洗ってください。 15ミリリットルに再懸濁ペレットは3を洗浄し、10分間3000×gで再びスピン。ウォッシュ2に遠心分離前に必要な管の数を減らし、3ソリューションを洗浄するためにいくつかのペレットからの懸濁液を組み合わせる。
4. 標識なし等分POS：
   1. 20mlのDMEM - 10に再懸濁POS。 490μlのDMEM中で事前希釈10μL（1:50）とに長いだけでなく、旋回POSをカウント細胞計数室（ 図2B）。 mL当たりPOS粒子中の収量と濃度を算出する。
      注： - 80ブタの目から8×10 ⁹ POS収率は例えば 、豚/牛や目の大きさの年齢および株にほとんどが異なり、良い準備が5の範囲である。
   2. 最終DMEM量を決定（典型的には10〜20ミリリットル）および2.5％スクロースの最終濃度を得るためにスクロースを加える。
   3. /ウェル40μlの96ウェル実験用の2ミリリットルの再懸濁ボリュームの所望の大きさの分量を準備し、 例えば、チューブ当たり5×10 ⁷ POS。 RTで2300×gで5分間の1アリコートをスピンし、ペレットサイズを評価する。 POSは二回凍結融解されるべきではない別のアプリケーションボリュームのための様々な分量のサイズを準備します。
   4. さらに使用するまで-80℃でのPOSアリコートをフリーズします。
      注：一定量を何ヶ月も安定している。私たちの手では、未標識または標識POSは少なくとも1年間保存することができる。
5. POS標識および分注 ：
   注：我々は、典型的には、食作用アッセイの定量化のためにPOSを標識するためにFITCを使用するが、他の染料は、必要に応じて用いてもよい。
   1. 1.4ミリリットルの0.1MのNa ₂ CO ₃のpH 11.5（ 表2、ストック溶液）で2.6ミリリットルの0.1MのNaHCO ₃ pHが8.4を混合することにより、0.1MのNa炭酸緩衝液pH 9.5で2.5 mg / mlの濃度で再懸濁し、1 10mgのFITCバイアル。非再懸濁FITC固形物をペレット化し、最大速度で5分間光とスピンから保護しながら室温で1時間回転させます。
   2. ウォッシュ3溶液（またはDMEM）10ml中のPOSペレットを再懸濁し、80目にFITC溶液の2ミリリットルを追加します。 -80℃で凍結残り物FITC保管してください。 RTで少なくとも1.5時間、回転させます。アルミ箔を用いて光から保護する。
   3. セクション2.3.4で説明したようにほとんど無料でFITCが上澄みFで見られなくなるまで、その後一度か二度DMEM中で、二回洗浄3溶液を用いて標識POSを洗うraction。 DMEMに再懸濁POSおよび計数及び分注（ セクション2.4）のために、非標識POSのための手順。
6. 実験でPOSを使用する：
   1. 解凍RTでPOS、それらが蛍光標識である場合、できるだけ多くの暗所に保管してください。 RTで2300×gで5分間スピン。上清を吸引除去する。
   2. 実験によって決定されるように、すぐにアッセイ溶液の適切な容量の懸濁します。 POSチャレンジの異なる時間の場合には、ストアは、数時間の時間点の間暗所でRTにてPOSを再懸濁した。

結果

線形スクロース勾配超遠心分離の組み合わせは、密度による網膜懸濁液の異なる成分の分離を可能にする。ヘビー大きな網膜破片とRPE細胞は、勾配（ 図2A）の底にまたはその近くに沈む。網膜からライターPOSおよび軽量化、個々の細胞または細胞破片を遠心分離期間の終了により勾配の上半分に到達するために別々のバンドとして移動する。遠心分離工程後まで目、暗所でサンプルを保持することによって、POSを含むバンドは直ちに明るいオレンジ色によって認識することができる。このバンドの幅と強度が勾配品質とチューブ高さ（89ミリメートルの高さが好ましい）に依存します。適切に単離されたときの顕微鏡スライド（ 図2B）で観察された場合、通常、POSは直線状または曲がった、細長く表示されます。顕微鏡上の焦点面に応じて、彼らは暗いまたは光沢のあるのいずれかを表示することができます。そうでない場合resus適切に保留、彼らは塊のままになります。彼らは（下の段落を参照）破損している場合、彼らは少し「ほこり」の背景などはるかに小さい部分を、表示されます。

発...

ディスカッション

3段階の条件が最適化された精製のために重要である：収集ステップまでの勾配鋳造の品質と繊細なグラデーション管操作、チルド組織を維持し、暗闇の中で、PRの残りの部分から適切なPOSアイソレーションを得るために、網膜ホモジネートの揺れの強さセル。いくつかの問題が適切にオレンジ色のバンドを見に発生した場合、それらは、上記の3つの理由の1（また結果セクションの第二段落を参照）する可能性が最も高い。 50％スクロース勾配濃度³²または^33,21のOptiPrepステップ勾配の-特定の条件のいくつかの変形例27のように使用可能である。

いくつかの注意がPOSは二回凍結融解してはならないように、実験用の分量については注意が必要です。したがって、異なるアプリケーションボリュームの様々なサイズを用意することが有用である。

POSプレラベリングは注意して使用する必要があります。共有結合性のラベリングは、共局在の研究を困難にする非常に高い蛍光POSを生成します。また、予...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Specific 材料/機器
2チャンバーグラデーションメーカー			30mlチャンバー付きグラデーションメーカー
3mm径のシリコンチューブ			グラジエントキャスティング用
小型マグネティックスターバー			グラジエントメーカーチャンバーにフィットするスターバー
赤色セーフライトランプ			解剖用インアクチニックランプダーク
ウルトラクリア 25 x 89 cm チューブ	ベックマン	344058	超遠心チューブ
PP オークリッジチューブ	ナルゲン	3119-0050	30 ml 遠心チューブ
オプティマ LE-80K	ベックマン・コールター		365668 超遠心分離
機 SW 32Ti スイングローター	ベックマン・コールター	369694	超遠心分離機用スイングローター
アバンティ J-26 XP	ベックマン・コールター	393124	遠心分離機
JA-25.50 ローター	ベックマン・コールター	363058	アバンティ J-26 XP 遠心分離機
FITC 異性体 I	ライフ テクノロジー	F-1906	蛍光色素
その他の材料/機器
計数室 (ノイバウアーやマラセスなど)
蓋
マグネチックスターラーと支持極
Refrigated microcentrifuge
37 °Cウォーターバス
-80°;C冷凍庫
消耗品、
白衣			、健康と安全
、手袋
スリーブプロテクター、
ゴーグル
、吸収パッド、
バイオハザード、ゴミ袋、ゴミ箱
Weck-Prepブレード		解剖	60mm/2.25インチ幅 カミソリ刃
15cmプラスチック皿
滅菌ガーゼシート
15mlと50mlのチューブ			一般的な消耗品
マイクロチューブ
アルミホイル

チューブズ 付きダークアイス バケツスケール、