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方法論記事

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

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DOI:

10.3791/52101

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2014年11月2日

 , 
1Biological Sciences Platform, Sunnybrook Research Institute, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

この記事について

サマリー

手元の発達プロセスには10日間の一時的な勾配で動作するため、胚性哺乳動物の蝸牛のライブイメージングは​​困難である。ここでは、培養した後、5日間にわたり蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛外植片組織を画像化するための手法を提案する。

要約

ここでは、ライブ胚のマウス蝸牛外植片の長期的なタイムラプスイメージングのための方法を提示する。約10日間の哺乳類蝸牛が進むの非常に規則正しい、複雑な構造を構築するための責任が発生プログラム。この期間にわたって遺伝子発現の変化および医薬品または遺伝子操作に対する反応を研究するために、長期的画像化が必要である。以前は、ライブイメージングは​​、典型的には、標準的な顕微鏡の上の加湿チャンバー内で移植組織の生存度によって制限されてきた。湿度および温度に関して培養増殖のための最適な条件を維持することが困難で画像化実験の長さに制限を置いている。修正された組織培養インキュベーターに統合顕微鏡は、長期的なライブイメージングのための優れた環境を提供します。この方法では、我々はマウス胎児蝸牛外植片を確立する方法と時間経過のimagiを実施するインキュベーター顕微鏡を使用する方法を示し5日間にわたり、典型的な胚日（E）13蝸牛外植片及びSox2の、蝸牛のprosensory細胞のマーカーの挙動を調べるために、明視野および蛍光顕微鏡の両方を使用してngの。

概要

哺乳類の蝸牛は非常に規則正しい複雑な器官である。出生後早期の段階での日に耳胞からプリミティブ内耳の出現E11と発達プログラムの完了との間に、マウスでは、細胞のシグナル伝達および遺伝子発現の協調変化の複数の波が起こる。ベースから蝸牛管の頂点に実行すると、感覚上皮を検出する音、またはコルチ器官である。コルチ器官の開発は絶妙開発の終わりまでには、内有毛細胞の単一の行で構成されように制御され、外有毛細胞の3つの行は、支持細胞の5行（柱状セルの二行三に散在ダイテルス「セルの行）1。 、難聴起源感覚epithemlium 2のパターニングofthe studyeの重要性をheighlightingでこの正確な順序結果からの偏差。

胚性マウスCOCHの体外培養においてLEAは、コルチ器官の発達のメカニズムを研究する上で不可欠なツールです。この技術は1974年に設立され、過去40年間で、感覚上皮が指定され、コルチ器官は3が確立されたメカニズムの多くを解明するために使用されてきた。蝸牛は、動的な発生過程との複雑な器官である。操作1をマニフェストに限り、7日間かかる場合があります。 E13での蝸牛外植片培養物にGSK3βの阻害剤を追加する場合、例えば、化合物の強固な効果を観察するための最適なインキュベーション期間の6日4である。

現像蝸牛のライブイメージングは​​、コルチ器官の形態の変化、遺伝子発現の変化、細胞を、移行増殖性または死亡の追跡調査を可能にし、それはリアルタイム薬剤の結果の観察およびシグナリングの中断を可能にする経路。今までは、蝸牛のイメージングを生きる主に短時間5-8上コルチ器官の画像小領域に、共焦点顕微鏡を使用して実行するが、この技術は、外植片生存率による制限を有するされている。遅い発達プロセスにおける長期的な操作の効果の撮影では、撮影環境が重要である。通常、共焦点ライブイメージング·システムは、顕微鏡に座って、加湿プラスチックの箱を使用しています。暑さと湿度は、アクセス窓から、ヒンジ付きの開口部を通って、そのような客観的または光源としてmicroscope-のさまざまな部分の周りの隙間を通って、顕微鏡テーブルを満たすインキュベートボックス内の隙間を通って逃げることができる。これは、2つまたは3つ以上日間健康な外植片を維持するために最適ではない。

我々は、標準的なCO 2インキュベータ内に封入され、倒立顕微鏡ではなく、顕微鏡を中心に構築され、インキュベーターとして「インキュベーター顕微鏡'を定義。インキュベーター顕微鏡事後むしろ二、三日間のイメージングより、サンプルは2週間まで撮像することができるように、実験の寿命がある。インキュベーター顕微鏡は文化や標準制御された条件を外植する最小限の妨害で、細胞の増殖および分化のための優れた環境を提供します。複数日にわたって行われた研究では、培養器からそれらを除去し、倒立蛍光顕微鏡にそれらを実施することによって、日常的に画像化サンプルに頼るのが一般的である。このアプローチは働くことができる一方で、インキュベータから皿を除去することに敏感な開発組織のストレスを負わせる。原因インキュベーターから取り出し、温度における培養培地および変動の酸性度の変化は、次善の開発や不健康な組織になることができます。あらゆる時点において同じ焦点面と同じ方向に同じ領域を撮像することは極めて困難である。インキュベータ内で自動化システムを使用することにより、健康維持することができる組織は、複数の時点での画像を収集するために、同じ領域が全てのフレームに取り込まれることを確実にする。近年、いくつかの統合された顕微鏡組織インキュベーターが開発されており、これらは、臨床診療9にも、幹細胞および癌研究10,11のみならず、有用であった。

ここでは、マウス胎児蝸牛外植片の長期ライブイメージングのためのプロトコルを提示する。我々は、設定された時点で複数のサンプルの画像を捕捉する能力を有する標準的なCO 2インキュベータの内部に自動顕微鏡システムを使用する。システムは、インキュベータ内にセットし、倒立顕微鏡で構成されています。サンプルは、各時点で複数のサンプルの画像化を可能にする回転壇上に配置されている。照明、画像キャプチャ、および演壇の回転は、MetaMorphソフトウェアを介して操作の自動化システムによって制御される。オペレーティングソフトウェアを用いた撮像ルーチンを設定することにより、我々は、twの最大のために実行するための実験を​​設定することができ最小限の人間の介入と週O。この例では、大規模な成長と転位蝸牛の、具体的には、prosensory領域を示すために、明視野および蛍光の両方を使用する。この実験では、蝸牛は胎生E13にSox2のEGFPレポーターマウスから解剖されます。 インビトロ培養が確立した後、5日間にわたり画像化されます。

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プロトコル

マウス組織をマウス12実験動物のケアと使用のための動物実験ガイドラインにカナダ人評議会に従って維持し、安楽死させ-reporter Sox2のEGFPから収穫した。

1.培養胚蝸牛

  1. 、DMEMを8.89ミリリットルを混合することにより、ウシ胎児血清（FBS）、100×N2サプリメントを100μl、及び10mg / mlのシプロフロキサシンの10μlを1mlのをダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補う。 100％HEPES 5mlで495ミリリットルHBSSを混合することにより、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を補う。
  2. ガラス底の培養皿を準備します。
    1. 層流フード中で5mlのDMEM中の200μlの基底膜抽出物の基質を懸濁する。 10ミリメートルウェルを有する35mm直径のガラス底の培養皿を準備します。各ガラスの中心にピペット150μlの基質/ DMEMを皿の底。これらの皿は、40分間のインキュベーションの後に使用することができ、またはCO 2に格納することができ少なくとも1週間35℃でインキュベーター。
      注：ガラスの皿を、以下の理由のために使用される底：外植片を容易に位置する領域に定着することができ、皿の中心にうまくを作成するために、皿の底が透明およびイメージングに適していることを確実にするために、最終的に実験後、試料を免疫染色し、その後の分析のために処理することができるので。
  3. ワークステーションやツールを準備します。
    1. 層流クリーンベンチをオンにし、清潔な作業スペースを作成するために70％エタノールでダウンスプレー。 70％EtOH中（エージェント（1部）と木炭粉末（2.5グラム）を硬化、184シリコーンエラストマーのミックス（10部））ピンセット、スプーン、黒184シリコーンエラストマー皿を浸す。
  4. クリーンなワークステーションでは、実験用の収穫の胚。冷HBSS 1％HEPESを補充した氷の中の適切な妊娠の胚を収集します。
    1. デモンストレーションを行います外部または可視臓器を決定レポーター活性、蛍光実体顕微鏡を用いて、胚を調べます。氷冷HBSSにおけるレポーター活性を示す胚を集めるこれらは実験の対象であるとして、1％HEPESを補充した。
  5. 頭骨を収集します。
    1. クールな光源と細かい鉗子を用いて、迅速に作業し、子犬の頭を収集する。頭骨の損傷を避けるために頸椎時および顎の下にクリップするように注意してください。
    2. 慎重に頭蓋骨を開きます。脳を外し頭の前部を切り落とす、ときれいな皿に、1％HEPESを補充した新鮮氷冷HBSSに後部頭蓋骨を転送する。慎重にタクトで前庭系を保つように注意しながらピーナッツ形の頭骨を解剖する。
  6. 蝸牛を解剖：
    1. 氷冷HBSS中で料理をコーティングした黒色のシリコーンエラストマーに頭骨を転送骨の前庭地域をピン、1％HEPESを補充した。で虫ピンを挿入します頭骨を安定させ、鉗子のための部屋を作成するために斜めの角度。頭骨は、それが無傷蝸牛を収穫することは非常に困難であまり移動させることができるかのようにピン止めは、プロセスにおける重要なステップである。
    2. 慎重に蝸牛周囲の軟骨を取り除く。蝸牛の基部の外縁に軟骨に鉗子の1タインを挿入し、軟骨に穴をクリップ。
    3. 、サイドアップフラップをクリップ鉗子の歯を差し込んで、静かに軟骨からダクトの屋根を区切る。上部に水平にクリップや斜めに、そして慎重にカプセルの前部を持ち上げ。残りの軟骨とダクトとの間に鉗子の突起を差し込んで、静かに最後のセクションをオフにクリップ。蝸牛の頂端面は現在公開されます。
    4. baseから始まり、ダクトの屋根が蝸牛上皮を満たしているエリアをキャッチし、蝸牛管を開きます。優しくトリミング、屋根をはがし必要な場合、それが完全に除去されるまで。ダクトの内側に残された膜の任意の部分を切り落とす。過剰間葉組織のダクトを清掃し、前庭系からダクトを取り外してください。
  7. 文化植片：
    1. 慎重に液体のすべてをオフに描き、2分間のまま、基板コーティングされたガラス底の培養皿の中央に、外植片、管腔側表面を上にして置きます。 DMEMを滴下外植片に、それを邪魔しないように注意しながら補足し150μlのを追加します。外植片は、無料のフロート鉗子で再配置するが、それは基板に取り付けることができるように、外植片は皿の底に落ち着くことに注意する必要があります。
    2. 湿度を維持するための滅菌水小皿で、深い直径12cmシャーレにガラスボトムディッシュを置きます。外植片が基板に付着し平坦化するために、一晩、35℃のインキュベーターにで文化を置く。

2.ライブ画像の再生ING

  1. 外植片のサンプルを選択します。各外植蝸牛の状態を評価するために、蛍光立体顕微鏡を使用してください。ダクトは無傷で、ベースから頂点にガラスに付着している外植片をのみを選択します。
  2. 文化蝸牛組織への5％のCO 2で35℃のインキュベーターを設定します。インキュベーター顕微鏡に文化を置く：
    1. 優しく補充されたDMEMをオフに吸引し、少なくとも500μlの新鮮な培地と交換してください。 6日までイメージングするために、1〜1.5ミリリットルが良いです。外植片が緩く接続されているケースでは、皿の縁の周りのメディアの輪​​をピペット。この余分な液体は、それがマトリックスにアタッチし続けている間に外植片を乱すことなく、ミニチュアの「加湿チャンバー」を行います。
      1. 別の方法として、使用は試薬が画像コレクションの間隔の間に交換する必要がある場合に、皿を顕微鏡でのフィッティングに留まりながら、料理は蓋を開くためにカバーしてヒンジ付き。ヒンジ付きの皿カバーは蓋をすることを可能にするサンプルを乱すか、その設定から食器を削除せずにオープンしました。これは、次の画像キャプチャの彼らの正確な位置を維持しています。
    2. 試料皿ホルダーに適切なサンプルを含むガラスボトムディッシュを挿入します。この例では、顕微鏡は8 35mmのサンプル皿を保持している回転台を持っています。
    3. 層流フードの下にガラス蓋付きのプラスチックの蓋を交換し、試料皿ホルダーに料理を挿入します。皿の底から外植片を取り除くために、またはメディアを乱さないように注意しながらインキュベーター内部の試料皿ホルダーを置きます。
  3. イメージング·ルーチンを設定します。
    1. 顕微鏡、UVランプとカメラに切り替え、イメージングソフトウェアを開きます。
    2. 試料の位置を確認し、シーケンス内の各ディッシュの露光時間を、撮像エリアを選ぶ焦点面と調整。始動時の外植片の観点だけでなく応じて焦点面を選択しますが、アルそう、組織がどのように移動するかを念頭にしてどのくらいの時間経過が実行されます。
    3. 蛍光チャネルで選択された焦点面を中心に、Zスタックを設定します。実験のためのサンプリングの頻度と長さを設定します。サンプリング周波数は、画像を収集するのにかかる時間によって制限されるので、これは視野を選択し、Zスタックを設定した後に決定されるべきである。この場合、サンプリングは5日間にわたり30分毎に行われます。実験期間は14日間までであることができる。
  4. ムービーを生成します。
    1. 時間の経過期間の終了時にイメージファイルを開く。逐次収集ポイントをオープンする。この場合、MetaMorphソフトウェアを使用する。フレームごとに、関心のある細胞集団を示すための最良の焦点面を選択します。
    2. .aviファイルにこれらの画像を変換する、または複数のフォーマに開放し、分析する画像処理ソフトウェアで、または変換することができる一連の画像を生成するために、モンタージュとして書き出すビデオ処理ソフトウェアを使用してtsが。

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結果

ここでは、モンタージュ（ 図1）およびE13.5上に播種した場合、典型的な器官蝸牛外植片が成長する方法を示す映画（ 図2）を示す。 Sox2のレポーターマウスprosensory領域を可視化するために使用された。映画は蝸牛成長と収束と拡張子を受けることを示し、緑のSox2のドメインの横の領域内のセルは、それが拡大し、周囲の組織のように分割していないようです。これはコルチ器官の特徴である。 E13に前向き感覚上皮は、細胞周期を出て、その後、不拡散13のゾーンとして知られている。異なる蝸牛外植片のミッドベース（ 図3および図4）、それが延びるにつれて、prosensory領域が狭くなることを実証しているを中心とした第二タイムラプス実験。培養3日後に、組織は、それがINDIVIを可視化することが可能であることはかなりように平坦化していることに注意してください二重蛍光細胞、初めに起因し、組織の厚さへの光の内部反射は、それが可能な表現領域ではなく、個々の細...

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ディスカッション

培養物を確立し、長期的画像化するためにタイムラプス顕微鏡を設定する際にされているときに考慮すべきいくつかの技術的なポイントがある。

我々は、蝸牛外植片を培養するための基質として基底膜マトリックスを使用するが、基質は、細胞型に適合させるべきである。例えば、画像ニューロン培養物には、フィブロネクチンのコーティングを提供することが望ましい場合がある。インキュベーション温度およびガス組成物はまた、組織の種類に応じて選択すべきである。外植片の年齢を選択することが重要です。 E12に成長の方向が予測しにくいですので、私たちは、早ければE13に開始します。それは外植片を基板に取り付けるために一晩培養することが不可欠であるとして、実験は次の日を開始するために計画する必要があります。実験はE15または古い開始する場合、培養物をE13に確立されるべき組織を平らにし、経時的に広がるように、細胞を画像に容易である（ 図3参照）。

コルチ器官が撮像される場合は、蝸牛を非常に慎重に解剖されることが重要である。外植...

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開示事項

著者らは、開示することは何もない。

謝辞

有益なコメントとその建設的な助言のための3つの匿名査読のために技術支援のためのウィリー日博士とクリスGellynckに感謝します。この作業は、サニーブルック聴覚回生イニシアチブによって資金を供給された

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコのモディファイドイーグルメディアGibco12430複数のブランドがこの
基底膜抽出物を製造しています コーニング354230マトリゲル。代替の同様の製品は他のサプライヤーから入手可能です.
http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|細胞外+マトリックス+タンパク質+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|マトリゲル+地下室+メンブレン+マトリックス+%28Lifesciences%29
ウシ胎児血清Gibco16000044複数のブランドが製造しています
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
HEPESGibco5630080複数のブランドがこれを製造しています
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
100 x N2 supplementGibco17502-048複数のブランドが製造しています
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
CiprofloxacinSigma Aldrich17850-5G-F複数のブランドがこれを製造しています
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA
ハンクのバランスの取れた塩溶液Gibco14170161複数のブランドがこれを製造しています。使用前に修理する必要があります.
http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
ファイン鉗子ファインサイエンスツール11254-20サイズ番号 5
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
キュレット ファインサイエンスツール10080-051mmサイズ 
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
昆虫ピンファイン サイエンス ツール26001-35ステンレス鋼 Br
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
50 mm プラスチック皿コーニング/ファルコン351006複数のブランドがこの
木炭を製造しています シグマ アルドリッチ05105-250G複数のブランドが同様のアイテムを製造しています
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA
184シリコーンエラストマーダウ/コーニング SYLGARD® 184 シリコーンエラストマーキット皿は数週間前に自家製です。 シリコーンエラストマーは、任意のsupplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
ガラス底皿MatTekP35G-0-10-C皿の寸法は、イメージングシステムの仕様によって決定されます。 10mmも、番号0のカバーガラスはオリンパスVivaview FL.
http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&に適合products_id=2
実体顕微鏡ツァイス 495101-9804-000 ステミ2000年モデル。複数のブランドが同様のアイテムを製造しています
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
冷光源ツァイス000000-1063-182複数のブランドが同様のアイテムを製造しています
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
蛍光体顕微鏡 Leica microsystemsお問い合わせ Leica microsystemsLeica M165-FC.複数のブランドが同様のアイテムを製造しています
> http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ インキュベーター顕微鏡+イメージングソフトウェアオリンパスお問い合わせ オリンパスCo2インキュベーター内に密閉された反転マイクロコープ。Vivaview FL インキュベーター顕微鏡 独自のメタモーポ イメージングソフトウェア.
http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
クリーンベンチThermo Scientific51029701複数のブランドが同様のアイテムを製造しています
http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
CO2 インキュベーターThermo Scientific3310複数のブランドが類似のアイテムを製造しています
http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
層流フードThermo Scientific51026651複数のブランドが類似のアイテムを製造しています
http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html

参考文献

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