植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用インゲンマメ例として

Summary

このプロトコルは、フランスの豆植物(Phaseolus vulgaris)をモデル例として、植物の葉からのアポプラスト洗浄液の最適化された抽出を詳述しています。

Abstract

アポプラストは、原形質膜の外側に位置し、細胞壁を含む植物組織中の異なる細胞外区画である。葉植物のアポプラスト区画は、細胞壁形成、細胞の栄養と水の取り込みとエクスポート、植物エンドファイト相互作用および病原体に対する防御応答を含むいくつかの重要な生物学的プロセス、のサイトです。浸潤遠心法がよく、様々な植物種の可溶性アポプラスト組成の分析のためのロバストな手法として確立されている。この方法によって得られた流体は、一般的にアポプラスト洗浄液（AWF）として知られている。以下のプロトコルは、 インゲンマメ （フランス語豆）CVからAWF抽出のための最適化された減圧浸潤および遠心分離方法を説明している。 Tendergreen葉。この方法および他の植物種のためのプロトコルの最適化の限界が議論される。 AWF下流experimenの広い範囲で使用することができる回収アポプラストの組成物を特徴づけるために求め、それが植物種及び遺伝子型、植物の開発および環境条件に応じてどのように変化するか、または微生物がアポプラスト液中で成長する方法を決定し、その組成の変化に対応するためのts。

Introduction

植物アポプラストは、植物細胞を囲む間の空間である。これは、多くの代謝および輸送プロセスが行われる動的な環境である。アポプラストの主要な構造成分を組み立て、アポプラスト内に位置する酵素、構造タンパク質および代謝物によって修飾された細胞壁である。健康な植物細胞にアポプラストは、一般的にアミノ酸、糖および他の栄養素がH ⁺共輸送¹によって細胞質にアポプラストからインポートされることを可能にする酸性の状態に維持される。ショ糖輸送中に、光合成のソースからのスクロース移動ア​​ポプラストを通って、師部血管系へ。ショ糖は、その後、シンク器官²ショ糖を切断アポプラストインベルターゼによって維持浸透ポテンシャルによって輸送される。糖および他の栄養素も上向きに輸送され、蒸散流³を通して、気孔の空洞内に蓄積することができます。

">アポプラストはまた、多くの病原体が彼らの寄生のライフスタイルを確立し、環境ニッチを表します。細菌性植物病原体は彼らがそのような気孔として、あるいは傷⁴を通して自然の開口部を介してアクセスするアポプラストの高い密度に増殖する能力を持っている。アミノの濃度細菌および真菌病原体^5,6の栄養要求をサポートするのに十分であることが示されているアポプラストトマトおよび他の窒素化合物を含む。一次防御応答微生物病原体に向かっても、細胞外ペルオキシダーゼによって、アポプラスト中の反応性酸素種、すなわち生を生じる。及びオキシダーゼと架橋およびカロース沈着⁷を介して細胞壁の強化植物細胞壁は、抗菌活性を有する二次代謝産物が豊富であり、これらの二次代謝産物の生化学的性質は、種⁸の間で変化する。

上記に言及した結果編および他のプロセスは、葉アポプラスト液はタンパク質、糖、有機酸、アミノ酸、二次代謝物、金属および他のカチオン（ 例えば Mg ^{_2+、K +}のNa ^{+、Ca 2+}の、Feの^2/3の様々な含まれ^+）。シュートのアポプラストの溶質濃度はアポプラストと木部、師部および細胞質⁹との間に発生する輸送プロセスのバランスによって大幅に制御されている。しかし、代謝反応と微生物の成長も消費したりアポプラストの溶質を生産する。アポプラストの組成物は、植物種および遺伝子型の間の光、栄養および生物的および非生物的ストレス⁹を含む環境条件の変化に応じて異なることが知られている。アポプラスト物の組成を研究することによって、それがそのような酸化還元と浸透ポテンシャル、pHは、栄養/代謝物の可用性と酵素活性のような特性を含め、どのように変化するか、1は、植物が再どのように小説洞察を得ることができますその環境それに相当。その代謝産物および/またはイオンが、揮発性の一時的または細胞壁および原形質膜と結合することのできる空間的に構造化された動的な区画であるため、理解またはアポプラスト液中に発生する分子の変化を特徴づけるは複雑である。さらに、異なる分析技術は、異なる化学種の範囲をカバーするために必要とされる。

可溶性アポプラストの組成を研究するために、流体は、通常、組織から抽出される必要がある。いくつかの方法が新たに提案されたフィルタストリップ法¹⁰を含む様々な組織からのアポプラスト液を抽出するために存在するが、葉のための最も確立された抽出方法は、浸透、遠心分離である。この手法は、以前は^11-13とLohaus ら評価されている。2001年¹⁴方法の技術的なパラメータの多くの精密検査を提供する。名前、浸潤-centrifuによって示唆されるようにゲーション技術は、本質的に、葉の穏やかな遠心分離によって浸潤/アポプラスト流体混合物の回収が続くネイティブアポプラスト液と混合し、水性浸透流体とアポプラスト空隙の置換を含む二段階法である。回収された流体が希釈され、アポプラスト中に存在する全ての化合物（下記参照）が含まれないように、この流体は、一般的にアポプラスト洗浄液（AWF）、または時々間洗浄流体ではなく、アポプラスト液として知られている。浸潤遠心法十分な容積の単一またはプールAWFサンプルが生成され、下流の生化学的分析技術（ 例えば、タンパク質電気泳動、酵素活性測定、NMR、クロマトグラフィーおよび質量の多くのタイプの広い範囲に供することができるように容易に拡張可能である分析）。リーフAWFはまた、植物コロニー微生物のウィットとの相互作用を研究するための成長培地を模倣アポプラストとして有用であるHその環境^5。

次のプロトコルでは、 インゲンマメを使用して浸潤·遠心分離技術を実行する方法について説明CV 尋常 。 Tendergreen葉、およびメタボロミクスを中心とした下流の分析のいくつかの例を提供する。重要なことには、AWFの品質を評価するための方法は、異なる葉タイプの手順を最適化するために助言に沿って設けられている。

Protocol

注：これらの要因が大幅に品質変動とAWF（ 図1）の収率に影響を与えることができるように、植物の成長条件の葉の出発物質の選択および標準化が重要である。考慮すべきパラメータは、表1に示され、議論でより詳細に説明する。

パラメーター	例標準化
	インゲンマメ	トマト	シロイヌナズナ
葉の種類	最初の真の葉、完全に拡張され、健全な	下から2 番目と3 番目の葉、アポプラスト抽出に使用されていない頂端リーフレットを取っ4最大のリーフレット	完全に展開ロゼット葉
植物の齢	21日	7から9​​週間	7週間
時刻	光時代中期（12:00）	光時代中期（12:00）	光時代中期（12:00）
水和	すべての植物はよく1時間収穫前を骨抜き	すべての植物はよく1時間収穫前を骨抜き	すべての植物はよく1時間収穫前を骨抜き
ライト	16時間明、400マイクロモルメートル-2秒-1	16時間明、400マイクロモルメートル-2秒-1	週2から10時間の明（短日）、400マイクロモルメートル-2秒-1
湿度	70パーセント	70パーセント	70パーセント
温度	22°C光、18℃暗黒	22°C光、18℃暗黒	21°C

標準化されたparameの表1例AWF抽出に使用される葉のためにTERS。

1.生成アポプラスト洗浄液

注：このプロトコル中に感染した葉から微生物の病原体をinculding危険なmaterilaは、ドレインを下に洗浄すべきではありません。むしろ適切な廃棄手順を使用する必要があります。

1. 葉の大きさに基づいて装置を選択する。
   1. 無針注射器を使用してより小さな葉（ 例えば、シロイヌナズナ、豆）を潜入。注射器に収まらないほど大きい葉を浸透させるために真空フラスコを使用してください。同時に複数の葉に潜入するために真空フラスコメソッドを使用します。
   2. カミソリの刃を使用して、小さなセクションに利用可能な浸潤法には大きすぎる葉を分割します。徹底的に損傷を受けた細胞から滲出する細胞質の汚染物質を除去するために浸透の前に蒸留水で葉の切片をカットすすぐ。
2. の60mLシリンジを用いて、葉の浸潤。
   1. から葉を切り離しカミソリの刃を使用して、葉柄で植物。例えばトマトなどの化合物の葉の場合は、petioluleでリーフレットを切り離す。
   2. 葉の表面の汚染物質を除去するために蒸留水に浸して、新鮮に切除した葉をすすぐ。優しく吸収性の組織または紙で吸い取りによって葉を乾燥させます。
   3. 浸透する前に葉の重さを測定します。
   4. （他の浸透液を使用することができる、議論を参照）を注意深くロールおよび/または60 mlシリンジ中に葉を折るし、蒸留水で注射器を満たす。約40ミリリットルマークにプランジャーを下げながら、シリンジ内の空気を取り出します。
   5. 手袋をはめた指またはパラフィルムの一部のいずれかと注射器先端をカバーし、その後60ミリリットルマークに外側にプランジャーを引いて、注射器内の負圧を作成します。ゆっくりプランジャーを解放します。
      注：細胞溶解および細胞質の汚染を生じ得る圧力を解放すばやく。
   6. シリンジ先端のプラグを抜き、すべての空気を排出し、先端を押して取り外し再接続正圧のささやかな量を作成するためのプランジャーにさらに下方。
   7. 浸透した領域の暗く色によって見られるように葉が完全に、浸透されるまで1.2.6 -を繰り返して、1.2.5を繰り返します 。
   8. シリンジから葉を削除します。穏やかに、しかし完全に表面の液体を除去するために吸収紙葉ブロット。
   9. 浸潤葉の重量を測定します。密接に浸透量を近似浸潤前後の重量差を計算する。
3. 真空フラスコによる葉の浸潤：
   1. カミソリの刃を使用して、葉柄に植物から葉を切り離します。
   2. 葉の表面の汚染物質を除去するために蒸留水に浸して、新鮮に切除した葉をすすぐ。優しく吸収紙で吸い取りによって葉を乾燥させます。
   3. 浸透する前に葉の重さを測定します。
   4. 250ミリリットル以上のサイドアームフラスコの共同で（複数の葉に浸潤している場合、または葉）の葉を置き（他の浸透液を使用することができる、 説明を参照）を蒸 ​​留水をntaining。完全液体と葉をカバーしています。
   5. フラスコに真空を適用します。穏やかに葉から気泡を放出するために攪拌する。慎重にゆっくりと真空をリリース。
      注：すぐに真空を解放すると、細胞溶解および細胞質汚染の原因となります。
   6. 浸透した領域の暗く色によって見られるように、葉になるまで繰り返しステップ1.3.5は 、完全に浸透させる。
   7. フラスコから葉を削除します。穏やかに、しかし完全に表面の液体を除去するために吸収紙葉ブロット。
   8. 浸潤葉の重量を測定します。密接に浸透量を近似浸潤前後の重量差を計算する。
4. 遠心分離によるAWFの回収：
   1. 4インチ（10cm）に幅のパラフィルムの一部に葉を置きます。を5mlピペットチップ（または同様のサイズのオブジェクト）を使用して、パラフィルム内の葉をロールアップ。
   2. 20ミリリットル注射器にピペットチップでロールアップの葉を挿入します。上向きにすべてのカットの葉のエッジを配置します。きれいな50ミリリットルポリエチレン又はポリカーボネートチューブに注射器を挿入します。
   3. 遠心分離し、4℃でスイングバケットローター1,000×gで10分間、管内の注射器。
      注：遠心分離の後、葉の視覚的検査は、浸透液の大部分が排出されたことが示される。濃い緑色のパッチは、追加の遠心分離時間が必要であることを示している。
   4. 新しい1.5 mlチューブに回収AWFをピペット。
      注：AWFの容積は約その葉のための浸透量を一致させる必要があります。ボリュームは、遠心分離時間または遠心分離速度の追加、その後も小さい場合に必要です。
   5. 遠心分離する任意の細胞または粒子状物質を除去するために5分間、15000×gでAWFサンプル。また、REMOする0.22μmのフィルターを介してAWFを渡す細胞および粒子状物質VEの。
   6. 新しいチューブに上清をピペットで。ストレージまで氷上にサンプルを保管してください。
   7. -80℃でAWFのサンプルを保管してください。

細胞質汚染2.アッセイ

1. 酵素反応（ 例えば、タンパク質分解）を最小化し、遠心分離工程が完了した直後にアッセイを実行するために氷上でAWFのサンプルを保管してください。
   NOTE：代謝産物アッセイのために、試料は直ちに抽出後に凍結されてもよいし、使用するまで-80℃で保存した。
2. 標準のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（MDH）アッセイプロトコルの場合は^15を参照してください。それ以外の場合は、市販のMDHアッセイキットを使用しています。
3. 標準グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）アッセイプロトコル^16を参照のこと;それ以外の場合は、市販のG6PDHアッセイキットを使用しています。
4. 例えば、グルコース-6-リン酸（G-6-P）のような細胞代謝産物の定量化のためのステップ5に記載したようにGC-MSを使用して NG。そうでない場合は、G-6-Pを直接アッセイ用の市販のキットを使用。

アポプラスト希釈ファクター3.計算

1. ステップ1.2.4または1.3.4（例えば、蒸留水）に上記で使用浸潤液の2つのボリュームが準備します。 50μMの最終濃度を1液に、インジゴカルミン粉末を追加し、他には何も追加しません。
2. プレートリーダーを用いてインジゴカルミン浸潤溶液200μlの610 nmの（OD _610）での吸光度を測定します。インジゴカルミンなしでODを浸透液の₆₁₀ 200μlのを減算することにより、この値を修正してください。下記の式にOD _{610infiltrate}としてこの補正された値を代入します。
3. （インジゴカルミンとない）の両方浸潤ソリューションと（ ステップ1.2または1.3）上記のように、少なくとも3回の反復の葉の浸潤を実行します。
4. 浸透後、R蒸留水で葉で、InSe外表面に残っているインジゴカルミン存在を削除します。
5. （ ステップ1.4）上記のように遠心分離を進めます。
6. インジゴカルミンAWF抽出200μlの平均OD _610を決定します。インジゴカルミン無料AWF200μlの平均OD ₆₁₀値を減算して、この値を修正してください。下記の式にOD _610AWFとしてこの補正された値を代入します。
7. ように補正吸光度値から（ すなわち、倍希釈）、希釈係数を計算する。
   アポプラスト希釈係数= ODの_{610infiltrate} /（OD _{610infiltrate} - OD _610AWF）
8. プランタアポプラスト液中の濃度/作用を推定する希釈倍率によってAWFから乗算濃度または活性値。

凍結乾燥により完全な強さにAWFの4濃度

1. 凍結乾燥機とAの電源を入れます作業温度及び圧力で安定させるためにLLOW。
2. 新鮮なまたは保存されAWFサンプルの所望の量をプール。
3. 2ミリリットル遠心管に均等にサンプルを配布します。
4. 再構成ボリュームを決定します。
   凍結乾燥/アポプラスト希釈係数の前に再構成ボリューム=ボリューム
5. 蓋を閉じた状態で、液体窒素中でチューブを凍結する。
6. 一つ以上のチルド凍結乾燥容器に凍結されたチューブを転送します。チューブを転送する一方で、ガス交換を可能にするために鋭利なもので刺してきたものにふたを交換してください。
7. 凍結乾燥機に血管を取り付け、完全にサンプルを凍結乾燥。
8. マシンからサンプルを取り出し、蒸留水を算出した額を加算してAWFを再構成する。
9. unpierced蓋を交換し、-80℃でサンプルを記憶。

ガスクロマトグラフィー質量分析法¹⁷ 5.代謝物の分析

1. 1.5ミリリットルチューブにピペットAWF200μlの
2. 内部標準として10μg/ mlのリビトールを含むメタノール700μlのを追加します。
3. 10分間70℃で加熱する。
4. 11000×gで10分間遠心。
5. 新しい1.5 mlチューブに上清700μlのを転送します。
6. 10秒間の冷クロロホルムと渦の375を添加する。
7. 10秒間のdH ₂ Oと渦の500を添加する。
8. 2200×gで15分間遠心。
9. その後、熱することなく、完全に真空濃縮器でサンプルを乾燥、新しい1.5ミリリットルチューブに上層の水層を150μlのを転送します。
10. 20 mg / mlのメトキシアミン塩酸塩を含むピリジン30μlのサンプルを溶解する。
11. 2時間激しく振とうしながら70℃でインキュベートする。
12. MSTFA50μlの（N-メチル-N-（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド）を加える。
13. 30分間振盪しながら37℃でインキュベートする。
14. GC-MSコンプへの転送サンプルatibleガラスバイアル。
15. サンプルのGC-MS分析を実行します。 Lisec らを参照してください。2009年^17、GC-MS機器のセットアップとパフォーマンスの詳細については。

Results

健康的な3週齢のPに行っAWF抽出のための典型的な結果CV 尋常 。浸透液として蒸留水を用いてTendergreen 葉は、 表2に示す。ヤングP.尋常葉浸潤に適している、そして、ここで使用される遠心分離速度で（1,000×gで）遠心分離により浸透液の大部分の除去は、葉が元の緑色に戻すとして直接見ることができる。P.尋常葉新鮮重量が浸透する前に平均1.1 XGにあったとのグラム新鮮重量あたりのAWFの0.5ミリリットルが得られた。 AWFのタンパク質濃度は、溶液は、標準的なBradfordタンパク質アッセイを使用して/ 0.18±0.08 mgであると決定された。インジゴカルミンの希釈を測定することによって計算これらの葉の希釈係数は、2.3±0.3倍であった。上記の値は、グラムの葉新鮮我々当たりAWFの収率を決定するために必要とされる種と予備実験の間、実質的に変えることができるIGHT、ならびに所与のリーフタイプ期待できるAWFタンパク質濃度および希釈係数。

圧力の変化があまりに急速である場合、遠心分離ステップ中に遠心力が高すぎる場合、細胞の完全性の損傷は、溶浸​​工程中の両方を発生することができる。これは、細胞質の汚染のマーカーAWFサンプルをアッセイすることが必要である。理想的には、複数の独立したアッセイが行われる。ここでは、3つの可能なアッセイからの結果を表2に報告されている。P.のよく行わ抽出で尋常性 AWFは、G6PDHは、標準的な酵素アッセイによって検出されなかった。これはG6PDHの活動のみしきい値遠心力¹²の上方に検出可能になる他の報告と一致している。対照的に、リンゴ酸脱水素酵素活性（2.5 U / ml）でのベースラインレベルは、すべてP.において検出可能であった標準代謝アッセイを使用して、尋常 AWFサンプル。遠心を増やす千×gでの閾値より上のceが増加MDH活性をもたらした（結果は示さず）。他の種からのアポプラスト、内因性MDH活性が^18を含むことが知られているように、ここで検出された量は、本物のアポプラスト活動と考えられ、このベースラインレベルを超える有意な増加は、汚染の指標とされている。そのようなヘキソース-6-リン酸として、主に細胞質であると考えられる代謝物は、また、AWFの汚染を評価するために用いることができる。ここでは、GC-MS分析は、AWF抽出のG-6-Pのゼロまたはトレースレベルを検出した。対照的に、カットトウモロコシ根部において、G-6-Pは、すべての遠心分離速度でAWF抽出の後に検出された細胞質汚染^10を表す、より高速で濃度が増加した。

PのGC-MSによる代謝物解析60識別可能な代謝産物と識別不能な化合物のほぼ同数（ 図2） - 尋常葉AWFは、典型的には、40を生じる。またはganic酸、単糖、及びアミノ酸が同定可能な代謝産物の大部分を表し、ただし、二次植物代謝産物も検出され、AWF ¹¹から定量化されている。これらの異なる分子クラスからいくつかのサンプルのピークは、図2のラベルが貼られてさらに下流の分析技術は、例えば、様々な分子を定量化するためにこれらのAWFサンプルに適用されます。ICP-MS、NMR、HPLC、原子吸光分析、タンパク質質量分析。

図3に、クーマシーブリリアントブルー染色したSDS-PAGEゲルに示されるようにアポプラストのタンパク質成分はまた、AWFで表されている。他の役割の中で、アポプラスト酵素は、細胞壁の合成および細胞外の反応の生成に関与している酸素種。様々な種からAWFのプロテオミクス研究は、個々のタンパク質の十を同定し、アポプラストのタンパク質成分がいる環境保護に応答することが示されているnmentalストレス^13,19。理想的にはAWFエキスは、ルビスコなどの細胞質タンパク質による汚染から自由でなければなりません。しかし実際には、これを達成することは困難である。 SDS-PAGE後〜53 kDaのルビスコタンパクバンドの存在は、AWFサンプルの完全性のためのさらなる定性アッセイを提供する。例えば、 図3のレーン2にロードされたサンプルは、レーン1のことルビスコ汚染の大きな量を含む。

	インゲンマメはAWF尋常
AWFの容量（ml G -1葉FW）	0.49±0.09
タンパク質の濃。 （MGミリリットル-1）	0.18±0.08
希釈係数	2.3±0.3
G6PDH活性（Uミリリットル-1）
のGlc-6-P量（mg ml -1の）	どれも検出されず
MDH活性（Uミリリットル-1）	2.5±0.9

PからAWF抽出表2.典型的な結果CV 尋常 。 Tendergreen葉。

図1.標準アポプラスト抽出ワークフロー。数字は、プロトコルの手順を参照してください。

図2の例PのGC-MSクロマトグラムは。CV 尋常 。 Tendergreen AWF番号の例の代謝物ピークは、次のとおりです。1-マロン、2リン酸、3-コハク酸、4-不明、5-リンゴ酸、6-アスパラギン、7-リビトール（内部STandard）、8-クエン酸塩、9 - グルコース、10イノシトール、11、カフェー酸、12-スクロース。

図3.例SDS-PAGEクマシーは、Pのゲルを染色した。AWFの葉の抽出物尋常 。このゲルは、豊富なプラスチド酵素ルビスコによって細胞質汚染量が異なる2つのAWF抽出のタンパク質成分との間の比較を提供します。 AWFの抽出後、両試料は、冷アセトンの4倍過剰（v / v）のアセトンをタンパク質沈殿にかけ、十分の一元の体積の水に再溶解。レーン1および2は、40μgのタンパク質を含む。ルビスコ大鎖（〜53 kDa）の対応するバンドを矢印で示す。 M _rは ：タンパク質分子量マーカー。

Discussion

植物組織源の最適化

アポプラスト抽出を行う際に生物学的および技術的な変動が大きくなる可能性があり、したがって、高度に標準化されたワークフローは、（ 図1）の実験全体で連続性を高めるために有用である。重要なことには、植物組織の供給源は、リーフ型、葉の年齢、成長/環境条件および時刻（ 表1）を含めた、標準化されなければならない。大きな違いは、異なる葉が浸透しているとAWF、その後遠心分離によって回収しやすさに存在する。これらの違いは、気孔の数、開口の大きさ及び肉抵抗^12,14と相関している。偶数P.の異なる品種間AWF抽出手順の容易性、歩留まりに大きな違いがある尋常 。ここで使用Tendergreen品種の例葉カナダのワンダー品種よりも、この方法を用いてAWF抽出に対してより適している。中にP.は、最初の真の葉がそれらアポプラストの抽出のための当然の選択作り、侵入する最大かつ最も簡単に尋常 。アポプラスト空気と水の体積は、AWFの抽出性^12,14の違いにつながるいくつかの種で、葉齢とともに変化することが示されている。 Pに尋常 、古い葉は、遠心分離の際に少ないAWFに浸潤し得、実質的にはより困難になる。それらは完全な展開に達したときに、したがって、葉を採取した。続いて浸潤AWFを回復するために、より高い遠心分離スピードを必要とすることが困難な葉。一つはので慎重に大規模なAWF抽出のための組織源に応じ決定する前に、いくつかの異なる葉の種類や品種を選別する必要があります。

植物成長条件は、実験の文脈内で可能な限り標準化されなければならない。それらが許す限り、成長のキャビネットを使用することが好ましい一貫した湿度、温度、およびガーゼトン強度連隊が維持される。 などの代謝物、酵素の濃度は概日周期¹⁴を通して変化するため、葉の収穫は常に日の同じ時刻に発生する必要があります。最後に、植物は全て同様の膨圧を持つ離れることを保証するために、植物は収穫（〜1時間）の前にすぐに給水されるべきである。

葉の浸潤および遠心分離の最適化

細胞が遭遇する機械的ストレスが浸潤や遠心分離ステップの間に高すぎる場合に起因する部分的な細胞溶解にAWFの望ましくない細胞質の汚染が発生します。したがって、与えられたリーフタイプの手順は、歩留まりを最大化し、AWFの細胞質汚染を最小限に抑えることとの間に最適化されたトレードオフにする必要があります。全ての場合において、人はAWF葉細胞の機械的な破壊を回避するために回収することができる最低遠心分離速度を使用する必要があります。 centrifuの最適化ゲーション速度は体積を回収し、遠心分離速度の範囲にわたってアポプラスト汚染を監視することにより、各リーフタイプについて経験的に決定されるべきである。これは、閾値遠心力が超えられるまでそのようなMDH、G6PDHおよびグルコースリン酸イソメラーゼなどのマーカーの酵素活性は、これらの活動は、おそらく、細胞質漏れ^9,12,14に、急速に増加させるの上、低いままであることが観察されている。 Baker ら。2012 ¹¹によって示されるように、遠心分離工程の間に支持するためのパラフィルムの使用は、AWF抽出の有効性を向上させることができ、過度の折り畳み及び圧縮による葉身に機械的損傷を最小限に抑えることができる。一つはAWF抽出の損傷や完全性について葉を調べる必要がある場合さらに、パラフィルムの使用は、遠心分離後に、葉の可視化を向上させます。

野内^12は、Dである、カットイネ葉切片からAWFの回復の最適化を説明ifficultが浸透し、それらの小さな気孔の開口部のAWFを収集するために、より高い遠心速度を必要とする。イネの葉の表面の濡れ、いずれかの蒸留水中で葉または浸透液に界面活性剤を添加し予備浸漬することにより改善、浸透プロセスを容易にした。アポプラスト汚染¹²を監視しながら、より高い遠心分離スピード（6000×gで）も使用した。切断された葉の切片を使用する場合、細胞質汚染があっても、創傷部位の徹底的な洗浄でより優勢になるというリスクが常に存在する。カットの葉は、したがって、必要な場合にのみ使用してください。

多くの研究のために蒸留水を浸透流体¹¹として使用される。しかしながら、化合物は、ある種のアポプラスト化合物、特にタンパク質¹³の抽出を改善するために、このような塩または緩衝剤として、浸透流体に添加することができる。 Lohaus ^14は、イオン性および浸透力oの効果を評価する回収AWFの組成がn、それらを無視できることがわかった。浸潤培地のpHの変化は、しかしながら、AWF組成物¹⁴に影響^を与え得る。

抽出されたアポプラスト流体の適切な取り扱いと保管は重要です。 AWFは、プロテアーゼおよび他の酵素^13,20と同様に、揮発性有機化合物を豊富に含むことが示されている。したがって、それは氷の上で、またはそうでなければ、-80℃で保存したサンプルを維持することが推奨されているリカバリ後AWFの組成の変化を低減することができる。また、AWFの酵素アッセイは、タンパク質分解による酵素の不活性化、長期の希釈を制限または凍結融解をするために、抽出後できるだけ早く実施すべきである。

浸透処理はアポプラスト液を希釈し、この希釈の程度を決定することがしばしば必要である。遠心分離工程はまた、細胞内区画からの水でAWFを希釈することができる。希釈倍率は、必要とされている測定はAWFに行われたとき編、 インビボアポプラスト化学濃度を推定する。このようにして可能な限り正確にインビボで代謝物濃度に一致-希釈係数はまた、それが微生物のための成長培地を模倣アポプラストとして使用されている場合、完全な強さに戻すAWFを濃縮するために必要とされる。いくつかのバリエーションが、浸透流体に添加マーカー化合物の希釈を測定することにより、AWF希釈係数を決定するためのステップ4に記載の方法に存在する。すべてのメソッドのためにAWF希釈計算が浸透流体がかなりAWF復旧処理中に葉の細胞によって吸収されるか、または希釈されていないことを前提としています。この仮定は、以前に浸透ステップ¹⁴のために確認されているが、遠心分離工程のために未検証されている。マーカー化合物は、また、吸収された輸送またはアポプラストにいる間変更してはなりません。インジゴカルミンは、最も広く使用され、完全に使用される染料を試験するAWF希釈の計算のために。インジゴカルミンは、陽イオン交換樹脂と、単離された細胞壁に低い吸光度を表示し、 セイヨウアブラナにおけるAWF計算、エンドウマメ、トマトおよびダイズ ^11,21,22に適していることが示された。しかし、いくつかの葉の種類、 例えば、米やキュウリに、インジゴカルミンは、完全にAWF希釈係数^12,21の過小評価につながる浸潤、後に回収することはできませ現れた。インジゴカルミンの回復の欠如は、特にストレス下で^24、アポプラストに産生されることが知られているスーパーオキシド²³によってイサチンスルホン酸に開裂することにより、その感受性にすることができる。イサチンスルホン酸へのインジゴカルミンの切断は、610 nmでの吸光度の損失および245 nmでの増加になります。この反応はアポプラストにかなりの程度で起こるかどうか、またはこの反応がinfiltratするスーパーオキシドスカベンジャーの添加によって阻害され得るかどうかイオン液体は、これまでに検討されていない。ブルーデキストランはイネにおけるAWF希釈係数の定量化のために代わりにインジゴカルミンの使用されてきたAWF中での安定性と回復が報告されていないものの^、12を残します。あるいは^、[14 C]ソルビトール又は他の定量化内部標準としての放射性標識化合物は、代わりに、染料を用いることができ、放射能濃度の減少を測定し、同様の方法^11,14,25で希釈係数を計算するために使用される。

技術の限界

いくつかの注意点は、浸潤、遠心分離AWF分離法のために存在する。まず、浸透中アポプラストの希釈は、植物からの応答を誘発し得る。周囲の葉細胞はアポプラスト液の特定の成分の減少濃度を検出する場合、それらは、代謝物濃度の解釈を歪め、さらに代謝物を排出することによって応答することができる。でこの問題の評価は、それが浸潤し、遠心分離や浸透液のイオン強度の緩やかな差の時間のいずれも抽出AWF ^14,22の組成に影響を与えることが観察された。したがって、アポプラスト希釈に起因するいかなるアーティファクトは最小限であると考えられている。

第二の潜在的な欠点は、遠心分離によるAWFの溶出はいくつかの理由のためにアポプラスト中に存在する全ての分子を捕捉しないことである。特定の陽イオンおよびタンパク質中のいくつかの化合物は、しっかりと負に帯電した細胞壁に関連し、AWF ¹³で溶出しないことができる。タンパク質のような他の分子は^、14を使用する遠心分離スピードでアポプラストから効率的に溶出するには大きすぎるかもしれない。活性酸素種は、それらの広報アポプラストに生成された化合物の重要なクラスであるが、により、これらの化合物の短命の性質、及びそれらの製造不特定の要件esenceはよくAWF抽出によって捕獲されていません。それはAWFはアポプラスト液のインビボ合成を表し、これは種間でどのように変化するかを正確に知られていない。

何も普遍的に受け入れていないものの、いくつかのアッセイは、細胞質の汚染を測定するために存在する。主に細胞質酵素のアッセイ（ 例えば、G6PDH、ヘキソースのリン酸イソメラーゼ、MDH）が実行しやすいという利点があるが、細胞質の漏れ^14,18とよく相関しない場合があります。細胞質の代謝物（ 例えば、六炭糖リン酸塩、クロロフィル）の評価は、おそらくもっと指標であるが、あまりウェル^11を確立されている。それにもかかわらず、アッセイのいずれかのタイプは、サンプル間のアポプラスト汚染の相対的定量化のために有用であり得る。理想的には、複数の独立した測定値は、AWFサンプルの完全性を検証するために使用されるべきである。

その限界を認めているが、浸潤、centrifugatiここに記載されている技術にアポプラストタンパク質、一次および二次代謝産物及び無機イオンの研究では、シンプルで堅牢な技術のまま。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
エッペンドルフ微量遠心チューブ	エッペンドルフ	22364111
カミソリ刃	フィッシャー	12-640
60 mlシリンジ	ベクトン・ディキンソン	300865
20 mlシリンジ	ベクトン・ディキンソン	300613
4インチパラフィルム	ビーミス	PM-996
サイドアームフラスコ	SciLabware	12972831
真空源
5 mlピペットチップ	フィッシャー	50-813-28
遠心分離機	ベックマン・コールター	392932
スイングバケットローター	ベックマン・コールター	369702
インディゴカーマイン	シグマ	I8130
マイクロプレートリーダー	Tecan	Infinite 200
96ウェルプレート	ベクトン・ディキンソン	353072
凍結乾燥機	SciQuip	Christアルファ 2-4 LD
微量遠心分離機	biorad	166-0612EDU
オキサロ酢酸	Sigma	O4126
D-グルコース-6-リン酸	Sigma	G7250
NADH		Roche 10128023001
MDH assay kit	Biovision	K654-100
G6PDH assay kit	Sigma	MAK015-1KT
G-6-P アッセイキット	Biovision	K657-100
リビトール		Sigma A5502
メタノール	Sigma	650471
クロロホルム	Sigma	472476
真空濃縮器	Thermor Scientific	SC250EXP
methoxyamine hydrochloride	Sigma	226904
N-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド	シグマ	394866