方法論記事

共培養モデルの組み込みGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞における抑制性シナプスの形成を安定的にGABAを表現 A受容体

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10.3791/52115

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2014年11月14日

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1UCL School of Pharmacy, University College London

この記事について

サマリー

個体発生時に抑制性GABA作動性シナプスの形成をコーディネイト分子機構はほとんど不明である。これらの過程を研究するために、我々は、機能的なGABA A受容体を発現する安定にトランスフェクトされたヒト胚腎臓293（HEK293）細胞と共に培養した胚性中型有棘GABA作動性ニューロンを組み込んだ共培養モデル系を開発した。

要約

抑制性ニューロンは、中枢神経系で神経回路網のダイナミクスと時空間協調を調節するために作用します。GABA(γ-アミノ酪酸)は、脳内の主要な抑制性神経伝達物質です。これは、シナプスとして知られる高度に特殊化された細胞間接合部内の抑制性ニューロンのシナプス前末端から放出され、シナプス受信ニューロンの原形質膜に存在するGABAA受容体(GABAARs)に結合します。これらのGABA依存性イオンチャネルの活性化は、塩化物の流入をもたらし、シナプス後電位の変化をもたらし、これらのニューロンが活動電位を生成する確率を低下させます。

発達中、異なる形態学的、電気生理学的、神経化学的特性を持つ多様なタイプの抑制性ニューロンは、標的ニューロンを認識し、特定のGABAARsサブタイプを組み込んだシナプスを形成する能力を持っています。ニューロンターゲットの選択的な神経支配のこの原理は、適切なシナプスパートナーがどのようにしてお互いを識別するかという問題を提起します。

根底にある分子メカニズムを解明するために、新しいin vitro共培養モデルシステムが確立されました。そこでは、胚性線条体から単離されたニューロンの非常に均質な集団である中棘GABA作動性ニューロンを、異なるGABAAを発現する安定トランスフェクションされたHEK293細胞株で培養しましたR サブタイプ。シナプスは、この系で迅速、効率的、選択的に形成され、定量化のために簡単にアクセスできます。私たちの結果は、さまざまなGABAARサブタイプがシナプス形成を促進する能力が異なることを示しており、この縮小されたin vitroモデルシステムを使用して、適切なシナプスパートナーの認識と特定のシナプスの形成に必要なin vivo条件を少なくとも部分的に再現できることを示唆しています。ここでは、中棘ニューロンを培養し、GABAARsを発現するHEK293細胞株を作製するためのプロトコルが最初に説明され、続いて、これら2つの細胞タイプを共培養で組み合わせ、シナプス接触の形成を分析する方法についての詳細な説明が続きます。

概要

GABAは、最も豊富な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸1に先行する胚の脳に見られる最も初期の神経伝達物質の一つである。開発中に、GABAは、興奮毒性を誘導することなく、細胞の増殖、遊走および神経回路網の形成を調節する上で重要な役割を果たし、未熟ニューロンを脱分極して励起する。成体の脳では、GABA A受容体チャネルのための逆転電位に起因塩化物の細胞内濃度の低下をより負電位にシフトする。このシフトは、並行して、アップレギュレーション細胞から塩化物を輸送する塩化カリウム、塩化カルシウム共輸送体（KCC2）のによって引き起こされ、ダウンレギュレーションがあり、ナトリウム - カリウム - 塩化物輸送体（NKCC1）の逆の効果2。

脳では、GABAは主に、それぞれ、高速または低速シナプス抑制を媒介するために、GABA AまたはGABA B受容体のいずれかに結合し、LY。 GABA A Rs はまた、ヘテロ五イオンチャネルまたはリガンド依存性のCysループイオンチャンネルとして知られている受容体のクラスである。 GABAの二つの分子は、重炭酸イオン、塩化物イオン、およびより少ない程度に透過性であり、受容体の活性化に必要である。クロライドコンダクタンスの増加は、シナプス後ニューロン3の活性化に脱分極、興奮するイベントの有効性を低下させる。

GABA A Rの構造的多様性は、長い機能的および薬理学的特性のそれらの広い範囲を決定する際の重要な因子として認識されている。共通で、α（1-6）、β（1-3）、γ（1-3）、δ、ε、π、θ3：ネイティブGABA A Rs はと分類、複数のアイソフォームのサブユニットからなるヘテロ五量体である大きなN末端 ​​細胞外ドメインを含む膜貫通トポロジーは、4つの膜貫通ドメイン（TMS）、及びTMの3及び4 4の間の主要な細胞内ドメインザこれらのサブユニットの遺伝子欠失を有するマウスは、出生5,6-後に死ぬので、β3およびγ2サブユニットは、シナプス抑制と生物の生存に不可欠である。これとは対照的に、αサブユニットの個々のアイソフォームは、そのような不安、鎮静、覚醒、および他のような異なる動作に関連する脳内の特定のシナプス結合の機能にとって重要である、しかし、個別に、人生7-9に必須ではない。 GABA A Rs は強力な鎮静、催眠、抗不安薬などベンゾジアゼピン、バルビツレート、神経ステロイドや麻酔薬7,10,11など抗痙攣効果、との種々の薬物のための行動の主な部位である。

シナプスのGABA A Rs は通常、γ2サブユニット、2つのβサブユニット（最も一般的にβ2またはβ3）と2つのαサブユニット（α1、α2、α3またはα5）12,13を含んでいます。余分なシナプス受容体の主要なクラスを組み合わせてδサブユニットが含まれています2つのαサブユニット（α4またはα6）、および2つのβサブユニット（β2またはβ3）14。プラズマ膜への軸索、樹状突起や細胞体、および挿入にGABA A Rs の細胞内局在は、βサブユニット15,16の存在に依存している。しかし、シナプスの別個のタイプへの異なるGABA A Rサブタイプの選択的な取り込みは、特定のαサブユニット（α1、α2、α3またはα5）7,17,18の存在とよく相関する。重要なことは、マウスでのα1またはα2サブユニットの削除は、抑制性シナプス19で超微細構造変化を引き起こす。これは、GABA A自体がシナプス形成の調節に直接的な役割を果たし得ることを示唆しているRS。

証拠は、GABA作動性シナプスの開発は、神経ターゲットの両方が、異なる抑制性軸索の種類とでクラスター化される受容体が接触したイベントの正確配位シーケンスであることを示しています抑制性シナプスの各クラスは、選択的かつ機能的に同調している17,20-22。 GABA作動性シナプスにおける特異性のこの基本的な原則は、前とシナプス後パートナーがシナプスの連絡先の開始時にお互いを認識してどのように問題を提起。

in vitroで共培養アッセイは、シナプス形成のメカニズムのいくつかを研究するために、このプロセスでは、個々のシナプス間隙貫通タンパク質の役割をテストするために首尾よく適用されている。シナプス形成および成熟を仲介する双方向機能の共通トランスシナプス相互作用タンパク質の組み合わせの1つは、ニューレキシン（Nrxns）およびニューロリギン（NLS）である。 Nrxnsは、多くの異なるアイソフォーム23を生じさせる、彼らのラミニンニューレキシン-性ホルモン結合タンパク質ドメイン内の選択的スプライシングを示すシナプス前タンパク質である。 Nrxnsはまた、他のタンパク質と相互作用しながら、NLSは、その遍在性シナプス後年率であると考えられているrtners 24。一緒にこれらのタンパク質は近いと剛性同格25にシナプス前及びシナプス後膜を保持に貢献しています。 2最も豊富なアイソフォームは、興奮性と抑制性シナプス、それぞれ26で存在しているNL-1及びNL-2である。トランスシナプスのタンパク質相互作用を調査するために設計された最も初期の共培養モデル系の一つは、非神経細胞の異なるタイプを採用し、そのような過剰発現NL-に対するヒト胎児腎臓（HEK）293細胞、最も一般的に不死化細胞株2。これらの細胞は脳橋神経細胞とともに培養した場合には、HEK細胞の表面に近接したシナプス前タンパク質の蓄積は、シナプスのようなコンタクトの形成を示す、観察された。これらの共培養物への可溶性β-ニューレキシンの添加はNrxnsとNLSとの間のトランスシナプスの相互作用は、シナプスコンタクト形成27のために必要であることを示唆し、コンタクトの形成を阻害した。また、一過性の発現シナプス後タンパク質gephryinのと、GABA A Rサブユニットの発現を誘導し、解離海馬グルタミン酸作動性及びGABA作動性ニューロンとCOS（C V-1（ 入出力 riginで）サル、およびS V40遺伝物質を運ぶ）細胞共培養におけるβニューレキシンのこれら二つの細胞型28との間の接触点でγ2及びα2。シナプス形成を研究するために使用される共培養モデルのもう一つの例は、一過性のGABA A Rは、α2/β3/γ2とNL-2、および視床下部ニューロン29の混合集団をサブユニットトランスフェクトしたHEK293細胞を、関与。この研究は、NL-2の発現は、抑制性シナプスの形成のための絶対条件であると結論した。

しかし、最近の共培養の研究では、安定にトランスフェクトされたα1/β2/γ2GABA A HEK293細胞中のRは、機能的シナプスを誘導するのに十分であることが見出された共培養した場合、GABA作動メッドと追加のトランスシナプスまたはシナプス後接着タンパク質を必要とせずにイウム有棘ニューロン、。 NL-2 GABA AのR 30と共発現させた場合が、シナプス形成および強度の顕著な増加が観察された。これは、この共培養モデル系は、前述のモデル系、シナプス接触検出の最も明らかに増加した感度及び信頼性上の利点を有していることを示している。シナプス結合の検出における全体的な改善に貢献する二つの重要な要因は、i）個々の細胞の表面でのGABA A Rサブユニットの高くかつ一貫した発現を有する安定にトランスフェクトされたHEK293細胞株を使用する。この一貫性は、異なる共培養条件との定量的比較を容易にします。 ⅱ）胚線条体31から培養GABA作動性中型有棘ニューロンの純粋な集団の使用が混在ニューロン集団と同種の使用から生じる合併症や曖昧さを取り除くwsは、例えば、シナプス形成の間に相互に比較することができ、最も適切なシナプス後GABA A Rの種類を選択する。

シナプスの形成は、前およびシナプス後細胞接着複合体内の多くの経シナプスシグナルが関与すると考えられている。によるシナプス伝達および細胞接着分子の膨大な数の双方向性のために、それがシナプス形成に関与する重要な要素を識別することは困難である。このように、非神経細胞への単一細胞接着タンパク質をトランスフェクション（この場合は、in vivoでの GABA作動性中型有棘ニューロンのための2つの最も普及しているシナプス後の目標、α1/β2/γ2またはα1/β3/γ2GABA Aルピー32）を大幅にシナプス後表面で利用可能なトランスシナプスの信号の複雑さを低減し、シナプス形成の促進におけるこのタンパク質の有効性の正確な定量分析を可能にする。

プロトコル

Sprague-DawleyラットまたはBAB / C近交系マウス（Harlan、英国、使用妊娠雌の数は30だった）が収容され、犠牲に英国内務省によると[と1986年11月24日（609分の86 / EEC）の欧州共同体理事会指令た]ガイドライン。プロジェクトが正式に薬局倫理委員会のUCL学校によって承認された。

楽器、培養培地、および皿の調製

  1. すべての回で、無​​菌条件下で動作させるためにオンにし、70％エタノールで層流フードを掃除。
  2. ダルベッコ改変イーグル培地pHを7.4（DMEM、500ml）を、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン（50単位/ ml）を、ストレプトマイシン（50μg/ ml）を、ウシ胎児血清（10を含む、HEK293細胞培養培地を準備％）。
    注：ペニシリンおよびストレプトマイシンは刺激物である。
  3. Neurobasal培地のpHが7.4（500ml）を、B27サプリメント（25ml）中、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリンを含む、無血清ニューロン培地を準備（50単位/ ml）を、ストレプトマイシン（50μg/ ml）を、グルコース（6ミリモル）。
  4. HBSS 10×ストック（50 ml）を含有する、HEPES緩衝化生理食塩水（HBSS）を500mlを調製し、HEPES（1 M）（5ml）および水（445ミリリットル）、pHが7.4。
  5. オートクレーブを、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4中、1 L）、水（1 L）、ガラスカバースリップ（直径13 mm）とし、それらを滅菌するガラスパスツールピペット。

α1/β3/γ2-GABA Aルピーを発現するHEK293安定細胞株の作製

  1. 10センチメートル無菌組織培養プレートにプレートに2×10 6 HEK293細胞を一晩70〜90％のコンフルエンシーに到達するために、加湿した5％の二酸化炭素（CO 2）雰囲気（CO 2インキュベーター）内で37℃Сインキュベートする。
  2. 翌日、G418二硫酸塩（ 表1）耐性遺伝子を組み込んだPCDN 3.1（+）発現ベクターにGABA A Rα1サブユニットcDNAをHEK293細胞にトランスフェ負と錯体をカチオン性リポソーム製剤を用いた（両方ともヒトサイトメガロウイルス前初期（CMV）プロモーターの制御下）フレオマイシンD1（ 表1）耐性遺伝子を組み込んだ発現ベクター中のGABA A Rのβ3サブユニットcDNAは、製造業者のプロトコルに従って荷電した核酸分子（ 表1）。
  3. 滅菌15mlの遠心管に構築リポソームトランスフェクションバッファリング試薬15μlの、続いて、ゆっくりと室温で離れる前に混ぜると各cDNAの7.5μgの、簡単に説明すると、減少した血清培地（ 表1 pH7.4）を500μlのを追加5分。
  4. この混合物に、リポソームトランスフェクション試薬の8.75μlを添加し、穏やかに30分間室温で出る前に混合する。これに続いて、（抗生物質なし）をHEK293細胞培養培地3mlを追加し、二回上下transfeを遠心管の内容物をピペットrは滴下10cmの組織培養皿中で増殖する細胞への、及び加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）内で37℃Сで48時間インキュベートする。
  5. 以下の比率で、滅菌PBS、pH7.4中で穏やかにHEK293細胞を洗浄し、新しい10cmの組織培養皿中にトランスフェクトされたHEK293細胞を希釈：1：3,1：5,1：7、1:10、1:15 1:20。これは、細胞が過度に密集​​していないことが保証されます。
  6. 培養培地に、各抗生物質選択マーカー、G418およびフレオマイシンD1の800μg/ mlのを追加することによって、GABA A Rサブユニットの両方を発現するHEK293細胞の選択を開始する。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベータ）内で37℃Сで細胞をインキュベートし、抗生物質含有培地（10ml）を2日ごとに交換してください。
  7. 小さな白いコロニーが（通常約7日後）を形成するために起動すると、慎重に皿のそれぞれから単一コロニーを選択し、滅菌P1000を使用してそれを集めるピペットチップ。上下培地をピペッティングすることによって再懸濁媒体注意深くを500μlを含む24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに移す。正確に一つのコロニー（5-20​​コロニーの合計が勧められる）を各ウェルに移されることを確認してください。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに抗生物質含有培地を交換してください。
  8. コロニーは70〜80％コンフルエントになったら、静かに24ウェル組織培養プレートの底から細胞を取り除くために、上下の媒体をピペット。転送し、6ウェル組織培養プレート中で2つのウェル間の細胞の懸濁液を分割する。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに抗生物質含有培地を交換してください。
  9. 80％コンフルエント、同じ単一のコロンから生じる細胞を含む2つのウェルの1から細胞を収集する - 70回yおよび準備タンパク質溶解物。簡単に述べると、細胞をPBS、pH7.4で2倍洗浄し、そしてPBS、pH7.4中の2％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）200μlを添加する。溶解液を収集し、マイクロ遠心チューブに移す。 BCAタンパク質試薬を用いてタンパク質濃度を測定し、製造業者のプロトコルに従って（ 表1参照）。これらの詳細については、表1を参照して、SDS / PAGEによるGABA A受容体の α1とβ3サブユニットの発現を分析し、（ウサギ抗α1固有およびウサギ抗β3固有のGABA A R抗体サブユニット特異的抗体を用いた免疫ブロッティング抗体）。
  10. 取り除くとより大きなを6cmの組織培養皿に残りのウェルからのみ陽性クローンを転送します。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに抗生物質含有培地を交換してください。
  11. 徐々に細胞のuのコロニーを拡大する10cmの組織培養皿に、最終的に組織培養フラスコ（T-75フラスコ）に転送することにより抗生物質選択ファインダー。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに抗生物質含有培地を交換してください。
  12. プレートのガラスカバースリップ上の各コロニー〜70,000細胞（直径13 mm）の細胞表面発現および免疫蛍光法によってGABA A Rサブユニットの共局在を分析するために細胞を固定する。
  13. （10センチメートル無菌の組織培養皿にGABA A受容体プレート2×10 6細胞の両方α1及びβ3サブユニットを高レベルで発現するHEK293細胞の陽性クローンを選択し、加湿した5％CO 2雰囲気中で37℃СインキュベートCO 2インキュベーター）中で一晩。細胞はすべての回で抗生物質含有（G418およびフレオマイシンD1）培地中でインキュベートすることを確認してください。
  14. 翌日、HEKをトランスフェクションGABA A Rとの293細胞をpcDNA™3.1（+）非リポソーム脂質トランスフェクション試薬（ 表1）を用いて、ハイグロマイシンB耐性遺伝子を組み込んだ発現ベクター中にサブユニットcDNAをγ2s。
    注：このトランスフェクション法は、良好な生存および抗生物質を連続選択の下にあるの遅い成長、安定した細胞株における外来タンパク質の高い発現効率を可能にする。
  15. 無菌の15mlの遠心管中で、250エンハンサーμlのDNA凝縮バッファー（ 表1）及びγ2sGABAの1.4μgの受容体サブユニットcDNAを追加します。 5分間室温で離れる前に11.2エンハンサーμlの1秒間ボルテックスを追加します。
  16. 10分間室温で離れる前に10秒間非リポソームの脂質トランスフェクション試薬と渦の35μlを添加する。 G418 /フレオマイシンD1含有培地3mlを加え、二回BEF上下遠心管の内容をピペット鉱石は、10cmの組織培養プレート中で増殖する細胞上に滴下して転送する。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで48時間細胞をインキュベートします。
  17. 以下の比率で、無菌PBSで穏やかに細胞を洗浄し、新しい10cmの組織培養皿にそれらを希釈する：3、1：1：5,1：7 1:10 1:15および1:20。
  18. G418 /フレオマイシンD1-含有培地に抗生物質選択マーカーハイグロマイシンBの800μgの/ mlに加えることによってγ2sユニットを発現α1/β3-HEK293細胞の選択を開始します。 2日ごとに新鮮なG418 /フレオマイシンD1 /ハイグロマイシンB含有培地（10ml）で古い培地を交換してください。
  19. リピートは、G418 /フレオマイシンD1 /ハイグロマイシンB含有細胞培養培地中で連続選択の下で、2.7から2.12を繰り返します 。
  20. 抗生物質を含まない細胞培養培地と将来の使用のために、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）中で140℃にて陽性クローンを格納する。
  21. レベルをテストα1の発現の、β3および式は、抗生物質選択下に起因する細胞の減少生存に変更することができますので、解凍後の各クローンにおける免疫ブロッティング及び免疫蛍光法により、GABA A Rサブユニットをγ2s。

HEK293細胞株のeメンテナンス

  1. コントロールのバイアルHEK293細胞または滅菌15ml中の細胞培養培地10ml中にα1/β2/γ2-GABA A値Rs（ 表1）または（上述の）α1/β3/γ2-GABA A Rs のいずれかを発現するもの霜遠心分離管。過剰DMSOを除去するために5分間440×gで遠心。
  2. 上清を除去し、新鮮な細胞培養培地1mlで細胞を再懸濁する。
  3. 最初のポリ-D-リジン（0.1 mg / ml）で再懸濁した細胞のその後1mlで被覆された10cmの組織培養皿に新鮮な細胞培養培地9mlを加える。細胞を分散し、加湿した中で37℃Сでインキュベートし、静かに左右にを攪拌5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）。
  4. 翌日、あらゆる細胞残屑を除去し、新鮮HEK293細胞培養培地10mlに交換する培地を吸引する。
  5. GABA A Rサブユニットを発現し、したがって、抗生物質耐性マーカーの発現を欠いていない任意の細胞を除去するために抗生物質を含む安定な細胞株を選択する。 α1/β2/γ2安定細胞株の場合は、G418（800μgの/ ml）を含む新鮮な細胞培養培地で正常培地を交換してください。 α1/β3/γ2細胞株について、G418（800μgの/ ml）を含む新鮮な細胞培養培地と交換し、フレオマイシンD1（800μg/ ml）をとハイグロマイシンB（800μg/ ml）を。 注意！G418は刺激性であるとハイグロマイシンBは、腐食性の有毒刺激性である。
  6. それらは> 70％のコンフルエンシーを達成一旦低い密度で播種して、新しい組織培養皿に継代細胞。吸引し、10の細胞培養培地1mlで2回洗浄簡潔PBS、pH7.4中。皿から細胞を剥離するために、PBS、pH7.4中のトリプシン-EDTA溶液、プロテアーゼトリプシン（0.05％トリプシン）の溶液およびCa 2+キレート剤EDTA（0.02％）の1ミリリットルを追加します。 注意！トリプシン-EDTA解決策は、刺激性である。
  7. ディッシュに、適切な抗生物質を含む細胞培養培地10mlを加え、細胞を吸引する。 5分間440×gで細胞を遠心し、細胞培養培地5mlに再懸濁。
  8. 通路新鮮な細胞培養培地および適切な抗生物質を含む新しい組織培養フラスコ（T-75フラスコ）中に1:10希釈液を用いて細胞。加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сで細胞をインキュベートし、2日ごとに培地を交換してください。継代細胞> 70％コンフルエントを（ ステップ2.8を参照）。

GABA作動性中型有棘ニューロン文化4.準備

  1. 無菌条件下で24我々の準備ポリ-L-リシンとllのプレート（0.1 mg / mlで）をカバースリップ（直径13 mm）でコーティングさと加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）内で37℃Сインキュベートする。
  2. 翌日、吸引ピペットで過剰ポリ-L-リジンとは、2つの短い10秒、滅菌水で2 5分の長い洗浄でカバーグラスを洗う。一晩ラミニン（0.01 mg / mlの）を追加し、加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сインキュベートする。
  3. 70％エタノールで解剖領域を消毒し、そのような湾曲した及び真っ直ぐ組織鉗子、はさみ、ピンセットなどのツールを切開するの配列を収集し、完全に解剖器具を滅菌するために70％エタノールに入れる。
  4. その背中にCO 2で安楽死させ、妊娠ラット/マウスを置き、70％エタノールで腹部の皮膚をきれいに。内臓や子宮を明らかにするために、ピンセットで皮膚をつまんで、皮膚、筋肉、および腹膜を通して腹部にカット明らかに胚を持つ。子宮から胚（E16-17）を抽出し、チルドPBSでペトリ皿に置いてください。
  5. 層流フード中で胚を置き、冷却HBSSを含む新しいペトリ皿に頭を集め、それらの首を切る。
  6. 解剖顕微鏡下で、湾曲したストレート鉗子を用いて脳を解剖する。チルドHBSSを含む新しいペトリ皿に脳を置きます。
  7. 2大脳半球を分離し、慎重に髄膜を除去します。海馬のラインに沿ってカットし、線条体を明らかにする皮質バックはがします。半球の前で横紋白い構造として線条体を守ってください。
  8. 線条体を解剖し、非常に小さな断片にカット（1 - 直径2mm）し、1mlの総容積で、無菌の15ml遠心チューブに材料を収集するために熱加工パスツールピペットを使用。火研磨材が損傷を受けることなく収集されることを確実にする。
  9. 火災研磨TIを使用してパスツールピペットのpは、細胞を吸引し、それらに8リリース - 10回。それが均質に表示されるまで、6回 - その元の直径（1ミリメートル）の約30％の火ポリッシュチップで新しいピペットを取って、ソリューションをさらに4を粉砕する。
  10. 新しい滅菌遠心管に100μmのナイロン細胞ストレーナーを用いて細胞をフィルタ。
  11. 血球計で細胞を計数し、24ウェル組織培養プレートにウェルあたりのニューロン培養培地500μlに7万細胞をプレー。ウェルは左から右へ、そしてインビトロ （DIV） で 14日間加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で37℃Сインキュベート攪拌する。
  12. ウェルにそれらの増殖を停止するために、7日後に、グリア細胞が存在する場合、（5μMのAra-C）、シトシンβ-D-アラビノシドを追加し、神経細胞培養物の純度を確認し。これを行うために、各ウェルから神経細胞培養液（pH7.4）を250μlのを除去し、新鮮な培地250μlのが含まれている追加INGのAra-C。 注意！アラ-Cは刺激性である。

5.共培養の準備

  1. 神経培養の11日目に、無菌条件下で、ポリ-D-リジン（0.1 mg / mlで）を用いてコート6ウェルプレートし、加湿5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）内で37℃で一晩インキュベートС。
  2. 翌日（神経培養の12日目）、過剰なポリ-D-リジンを吸引し、少量で被覆する（抗生物質なし）をウェルに新鮮な細胞培養培地を添加する前に滅菌水で5分間、ウェルを2回簡単かつ2回洗浄培地からの血清の。
  3. 組織培養フラスコ（T-75）からの培養培地を吸引除去する。 Ca 2+の1ミリリットルを加える前に二回PBSで細胞をすすぎ/ Mg 2+をキレート化剤はEDTAで穏やかに非酵素的に細胞を解離する（0.48 mm）である。組織フラスコの底からそれらを切り離すために細胞を攪拌。
  4. （細胞培養培地10mlを追加）これは、トランスフェクションを妨害し得るような、抗生物質を含まない滅菌遠心管に細胞及び場所を吸引する。低速ベンチトップ遠心機を用いて5分間、440×gで細胞をペレット。
  5. 上清を除去し、新鮮な細胞培養培地1mlで細胞を再懸濁する。血球計数器を用いて、6ウェルプレート中ウェルあたり3×10 5細胞の密度で細胞をプレートカウント。優しく攪拌し、加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベーター）中で、37℃Сで24時間インキュベートする。
  6. 翌日（神経培養の13日目）は、一過性リポソームトランスフェクション試薬を使用して、pcDNA3発現構築物中にmCherryをcDNAをHEK293細胞にトランスフェクト。簡単に言うと、滅菌マイクロチューブに、減少した血清培地500μlとmCherryをcDNAの5μgのを追加します。リポソームバッファリング試薬を5μl加え、穏やかに5分間室温で離れる前に混ぜる。
  7. リポソームのトランスフェクションREAGの8.75μlを添加する優しくENTと30分間室温で離れる前に混ぜる。 （CO 2インキュベーター）転送滴下6ウェル組織培養プレートの各へと加湿5％CO 2雰囲気中で37℃でインキュベートС、二回上下に微小遠心管の内容物をピペット。
  8. 翌日（神経培養の14日目）、6ウェルのそれぞれからのHEK293細胞培養培地を吸引し、PBS（pH7.4）で各ウェルを二回簡単に洗浄する。 Ca 2+の300μlを添加/ Mg 2+をキレート化剤はEDTA（0.48ミリモル）およびトリプシン-EDTA200μlの（0.02から0.48 mM）の各ウェルに解決し、5分間37℃Сインキュベートする。
  9. ウェルあたり新鮮HEK293細胞培養培地1mlを加える（これはトリプシンを消光）し、無菌の15ml遠心分離管に分離した細胞を吸引する。室温で5分間、440×gで細胞を遠心し、上清を除去。神経細胞培養液（pH7.4）を500μlにペレットを再懸濁します。
  10. 血球計数器を用いて、神経細胞を含む24ウェル組織培養プレート中にウェル当たり30,000細胞の密度で細胞および種子を数える。細胞を分散し、24時間加湿した5％CO 2雰囲気（CO 2インキュベータ ）内で37℃Сで共培養をインキュベートするためのプレートを攪拌。

6.シナプスの連絡先の分析とその活動

  1. 共培養中で23時間後、蛍光色素と結合した抗シナプトタグミン腔側ドメイン特異的抗体の活性依存取り込みを使用してGABA作動性中型有棘ニューロンおよびHEK293細胞間の「アクティブ」コンタクトの形成を調査（Cy5では、 表1を参照） 。
    NOTE：抗体は、シナプス小胞の内腔と細胞外空間との間に連続性がある場合にそれが結合するシナプトタグミンの管腔ドメインへのアクセスを得ることができる。これは、特にこのantibを作り、神経伝達物質の放出の間に起こるアクティブなシナプス前終末の優れたマーカーをODY。
  2. （神経基本培地、pH7.4の; 表1を参照）まず、ニューロン培地で共培養物を洗浄し、Cy5標識マウス抗シナプトタグミン抗体を追加し、（神経基本培地、pH7.4）中のニューロン培地で1:50に希釈培養物を、30分間。加湿した5％CO 2雰囲気下で37℃Сでこの時間（CO 2インキュベーター）の間に細胞をインキュベートします。
  3. 、抗体のアクセスを削除する共培養簡潔に3回洗浄する：第200 mMのNaClを含有する冷PBS（pH7.4）で、冷たい通常のPBS（pH7.4）で最初に、冷通常のPBS（pH7.4）で第三
  4. 撹拌しながら10分間PBS中の4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロース（PFA、pH7.4）を300μlの細胞を固定。 2長い10分間の洗浄、次いでPBS（pH7.4）で簡単に細胞を2回洗浄する。
  5. PFAをクエンチする攪拌しながら10分間各ウェルにグリシン（0.3 M）を追加します。
  6. 細胞を洗浄brieflyは二回PBS（pH7.4）で、その後（PBS、pH7.4中の1％（w / v）のウシ血清アルブミン（BSA））ブロッキング溶液を300μlを添加する前に二つの長10分間の洗浄との非特異的結合を減少させる抗体。
  7. 4°Сで一晩：吸引しブロッキング溶液およびγ2N末端 ​​ドメイン33（PBS、pH7.4中3000 1）に対して向けられたモルモット抗GABA A R-γ2抗体を追加します。
  8. 翌日、ウェルから一次抗体を吸引し、2より長い10分間の洗浄、次いでPBSで簡単に二回細胞を洗浄。
  9. 室温で30分間ブロッキング溶液中のTriton X-100（0.1％）を用いて細胞を透過。
  10. マウス抗グルタミン酸脱炭酸酵素のいずれかを追加する前に2つの長い10分間の洗浄、次いでPBS（pH7.4）で簡単に細胞を2回洗浄する（GAD）65抗体（1：4000、 表1）またはマウス抗シナプシンI抗体（ 1：1,000、 表1）を室温tで120分間emperature。
  11. 二つの長10分間の洗浄、次いでPBS（pH7.4）で簡単に細胞を2回洗浄し、次いで室温で30分間ブロッキング溶液を加える。
  12. 遠心適切な二次抗体での抗体の凝集物を除去するために（Cy5をコンジュゲートし、典型的にはヤギ抗モルモットIgGを、ヤギ抗マウスIgGを、アレクサフルオロ488、またはすべてを2μg/ mlのヤギ抗マウスIgGアレクサフルオロ405にコンジュゲート） 21910 10分間XG、および抗体（1：750）を追加するブロッキング溶液に。 1時間、ウェルを適切な光暴露およびその結果として光退色からの蛍光団を保護するためにアルミホイルでカバーするように適用される。
  13. 最後に、すべての非結合二次抗体を除去し、マウント試薬（延ばすゴールド、 表1）カバースリップあたりおよそ10μlのを使用してカバースリップをマウントするために2より長い10分間の洗浄、次いでPBS（pH7.4）で簡単に細胞を2回洗浄します。 4に転送する前に、光から保護しながら室温に設定する24時間を許可する長期保存のためС°。
  14. 63X油浸対物レンズとレーザ走査型共焦点顕微鏡を用いてサンプルを分析する。光のレベルを確保し、検出器利得は飽和を回避するように調整される。
  15. IまたはCy5標識抗シナプトタグミンシナプシンGAD65のための肯定的なシナプス前終末、およびDICによ​​って、またはmCherryを蛍光インジケータによって可視化シナプス後のHEK293細胞間の共局在の領域のような潜在的なシナプスのような接点を守ってください。
  16. イメージングソフトウェアを使用して、細胞当たり5〜 - 4の深さを通して - （10 8）光学切片のZスタックシリーズを使用して、潜在的なシナプスのような接点を数える。

結果

このニューロンHEK293細胞の共培養モデル系のためのプロトコルは、細かく最適な細胞の生存を可能にするために調整された。このシステムでは、シナプスのような接触の形成とそれらの分析は、機能性受容体に集合するすべての3つのGABA A Rサブユニットの安定した一貫性の発現に依存している。これは、神経細胞培養に追加する前にHEK293細胞の表面におけるサブユニットの発現を試験するために免疫細胞化学的解析を使用することが重要である。これらの実験では、α1、β2、およびγ2サブユニット（ 図1A）、またはα1、β3およびγ2サブユニット（ 図1B）の細胞表面発現は、これらのサブユニットの細胞外エピトープに結合するサブユニット特異的抗体を用いて検出した。 HEK293表面でこれらのサブユニットの間の共局在の高度が示された。

GABA Aの表面発現と共局在を確認した後HEK293細胞中のRサブユニットは、共培養物は、14日（試験管内（DIV）で14日間）培養α1/β2/γ2GABA A Rサブユニットおよび中型有棘ニューロンに発現するHEK293細胞を用いて調製した。共培養中の細胞を、24時間インキュベートし、固定し、免疫細胞化学および共焦点顕微鏡を用いて分析した。連絡先の分析は、GAD65陽性GABA作動性軸索終末対照HEK293細胞（ 図2A、2B）のみ散発的な接触を形成することを示した。 4時間後に検出された接点の数は、HEK293細胞あたり7.3±0.9であり、この数は、培養されたニューロンにHEK293細胞に添加した後24時間後にHEK293細胞あたり5.5±0.5接続（平均±SEM）に減少した。対照的に、GAD65陽性GABA作動性軸索端末はGABA A Rs とを発現しているHEK293細胞を用いた多数のシナプスのような接点を形成した。 HEK293細胞を加えた後、4時間で得られた接点の数はHEK293細胞あたり28.3±4.7であり、この数はさらに増加し​​た52.1±6.3へdは共培養中で24時間（ 図2A、2B）でHEK293細胞当たり（平均±SEM）。

これらのシナプスのような接点があったかどうかを判断するには「アクティブ' すなわち水疱性伝達物質の放出を支持し、小胞-腔側ドメイン固有抗シナプトタグミンのCy5コンジュゲート抗体は、インキュベーションの23時間後に共培養培地に添加した。この抗体は、唯一のシナプス前神経末端のシナプス小胞の内腔および神経伝達物質の放出の間のシナプス間隙内の細胞外液の間の細孔の形態に組み込まれている。リリースに続いて、毛穴、小胞の内部シナプトタグミンに添付シナプトタグミンのCy5共役蛍光抗体を残して、閉じます。このように、積極的に神経伝達物質の放出に従事するのみ小胞は、抗体で標識されている。いくつかのこれらの実験では任意のコントロール間の接触HEK293細胞や中型有棘ニューロン端末があった場合には「アクティブ＆＃8217; HEK293細胞中のシナプス前GAD65 /シナプトタグミン蛍光とmCherryを蛍光（ 図3A）との間の共局在の欠如によって示されるように。 GAD65 /シナプトタグミンとmCherryを間に共局在度の高いによって明らかにされたようにこれとは対照的に、多くの「アクティブ」接点は、中型有棘ニューロン端末およびα1/β2/γ2発現HEK293細胞との間に形成された、HEK293細胞（に特異的に発現図3B）。

GABA A Rの異なるサブタイプはまた、インビトロでシナプスのような形成を促進することができるかどうかをテストするために、我々は中型有棘ニューロンと共培養α1/β3/γ2発現するHEK293細胞を持っている。再び、めったに（ 図4Aは、図4B 左 ）共培養における24時間後のHEK293細胞あたり10.8±0.48（平均±SEM）の接点に到達するシナプシン陽性シナプス前終末との接触を受けていないHEK293細胞を制御します。しかしながら、HEK293細胞が発現するシナプシン陽性シナプス前の共培養における24時間後のHEK293細胞あたり25.3±0.27（平均±SEM）の連絡先に到達した中型有棘ニューロンの端子（ 図4A 権を持つシナプスのような接点α1/β3/γ2GABA Aルピーフォーム有意に多く、図4（b））。これはα1/β3/γ2GABA A RsはHEK293細胞で発現していることを彼らの効力がα1/β2/ GABA A Rs は γ2含有の効力よりも低いとはいえ、またシナプス接触形成を促進することができていることを示します。

これらの実験は、我々の研究室で開発された共培養モデル系は、定量的なインビトロでのシナプスのコンタクト形成の分析、ならびにこのプロセスにおけるGABA A Rの異なるサブタイプの有効性の評価を可能にすることを示している。これらの実験はさらに、GABA A Rs は 、GABA作動性シナプスの重要な機能的構成要素であることに加えて、重要な役割を果たし得ることを実証認識及び互いに独立して、シナプス接着タンパク質の抑制性ニューロンおよび適切な神経標的細胞間のシナプス接触の形成の過程において。

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GABA A Rα1/β2/γ2の発現または安定なHEK293細胞株において/γ2α1/β3図1.免疫細胞化学的分析。GABA A Rサブユニットの細胞外ドメインを認識する抗体は、細胞表面で発現される受容体を標識するために使用した。（ α1（アレクサフルオロ488）、β2（アレクサフルオロ555）とγ2を発現A）高レベルでα1（アレクサフルオロ488）、β2（アレクサフルオロ555）とγ2（Cy5標識）を発現するHEK293細胞株（B）HEK293細胞株（Cy5で）高レベルでのサブユニット。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
図2. GABA作動性中型有棘ニューロンは、α1/β2/γ2-共培養HEK293細胞に発現したシナプスのような接点を形成する。 （ 右 、青で）、これらの間の共局在の点を明らかにしたγ2サブユニットmCherryを（赤、 左 ）またはGABA A R抗GAD65抗体（緑色）とHEK293細胞とのシナプス前末端の（A）蛍光標識共培養の4または24時間後にシナプス様コンタクトの形成を示すマーカー。スケールバー：10μmの（B）のシナプスのような共同の定量分析 ntacts。それぞれの光学部に目で数えたDIC画像および/またはmCherryを発現、およびGAD-65陽性の斑点（緑色）およびHEK293細胞の表面との間の接触の数によって明らかにされたHEK293細胞は、その形状に基づいて同定されたZスタックシリーズ - イメージングソフトウェアを使用して細胞あたり（8〜10）、および連絡先/細胞の数として表される。グラフは、中型有棘ニューロン間の接点の数を示しており、4の後にHEK293細胞（ライトグレー）またはα1/β2/γ2-HEK293細胞（黒）を制御し、共培養中で24時間（平均±SEM、N =各8 2つの独立した実験からの条件）。この図は、フックスらから変更されている。（2013）30。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3. GABA A Rs は中型有棘ニューロン間の共培養24時間後に形成されたシナプスのような連絡先の免疫標識GAD65用の正の端子（アレクサフルオロ405シアン）、（A）は HEK293細胞を制御します。アクティブなシナプス接触の形成を促進する 、または両方の一過mCherryををトランスフェクトし、（B）HEK293-α1/β2/γ2細胞は、（赤）を構築。アクティブな連絡先は、シナプス前終末の両方の小胞腔ドメイン特異的抗シナプトタグミン抗体（Cy5の）およびGAD65特異的抗体との間の共局在によって識別され、そしてmCherryをHEK293細胞に発現させた。スケールバー：10μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図4. GABA作動性中型有棘ニューロンは、共培養における発現HEK293細胞α1/β3/γ2-サブユニットとのシナプスのような接点を形成する。 （A）抗シナプシン（左）I抗体（緑色）、および対照HEK293細胞、またはα1とのシナプス前終末の蛍光標識/β3/γ2HEK293細胞に発現、両方の一過性（赤）mCherryをでトランスフェクトされたが、点を明らかにした共培養中で24時間後シナプスに似たコンタクトの形成を示すこれらのマーカーの間の共局在。スケールバー：10μmの（B）。 シナプスのようなコンタクトの定量分析。 HEK293細胞を、mCherryを発現により同定し、シナプシンI陽性涙点（緑色）およびHEK293細胞の表面との間の接触数がZスタックシリーズの各光学部に目でカウントした（1 - 80）細胞当たりのイメージングソフトウェアを使用して、連絡先/細胞の数として表される。グラフは中型有棘ニューロンおよび対照HEK293細胞（ライトグレー）またはα1/β3/γ2-HEK293細胞（黒）共培養における24時間後の間の接触の数を示しています（平均±SEM、N = 8-12細胞内で2つの独立した実験から各条件、）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは実行することが技術的に困難ではありませんが、最も正確で再現性の共培養アッセイを達成するために従わなければならない、いくつかの重要なステップがあります。まず、培養された中型有棘ニューロンは、最適な密度で播種されなければならない。あまりにまばらに播種した場合、ニューロンは、非常にゆっくりと進行する傾向があり、生存率が大幅に低減される。あまりにも密に播種一方、ニューロンは、HEK293細胞との接触の分析を損なうどの凝集する傾向がある。第二に、それは一過性に安定的に前に共培養にそれらをplattingに、GABA Aルピーを発現するHEK293細胞中の蛍光レポーター、GFPまたはmCherryを表現することをお勧めします。これは、神経細胞培養中のこれらの細胞および希生き残っグリア細胞間形状および大きさの類似性が損なわれることがありHEK293細胞の信頼性の高い認識を可能にする。 GFPまたはmCherryをcDNAと効率的なトランスフェクションを達成するために、HEK293細胞株は指数増殖期にある必要と6ウェルプレート中の適切な密度で播種した。トランスフェクションに続いてスパース播種はオーバーシーディングのcDNAを取ってから細胞を防ぐことができますしながら、細胞は、成長が悪いことになります。トランスフェクションの当日に90％コンフルエント - 彼らは70との間になるように理想的には、細胞が播種されるべきである。いくつかの細胞株は他のものより敏感であるように第三に、トランスフェクションは、使用される各細胞株について最適化されなければならない。 HEK293細胞における構成的GABA A Rの発現が細胞の生存およびトランスフェクション後に回復する細胞の能力を低下させるためである。さらに、生存はGABA A Rの種類に依存し、いくつかの細胞系は他のものより有意に敏感であると共に、HEK293細胞で発現。リポソーム試薬を用いてトランスフェクションは、発現の高いトランスフェクション効率およびレベルの両方を提供し、急速に成長している細胞株において外来タンパク質を発現させるための最適な方法である。しかし、この試薬をゆっくりために、細胞株を成長させるためにあまりにも多くの損傷を引き起こすどの我々は定期的に非リポソームトランスフェクション試薬を使用しています。これは、リポソーム試薬と同様に動作しますが、効率的なトランスフェクションのために必要なDNAの量が大幅に低減される。 （ - 90％60％がリポソーム試薬を使用した場合に比べて約80）が、低いトランスフェクション効率（60％）でこれは大きな細胞の生存を可能にする。最後に、制御HEK293またはニューロン培養物に添加α1/β2/γ2HEK293発現する細胞の数を最適化する必要がある。彼らは非常にまれになっているのであまりにも少数の細胞を追加すると、HEK293細胞とニューロン間の接触に成功し分析を損なう。逆に、あまりにも多くのHEK293細胞を添加して数時間以内に神経細胞死を引き起こす。

胚の中型有棘ニューロン培養物は、理想的には、胚の年齢15から解剖線条体組織を用いて調製されるべきである - しかし17、それはしばしば胚は、最適な年齢より少し若い歳以上であることが起こる。この場合、ニューロンの数は、培養物に播種意志変化させる必要がある。 E15よりも若いです組織は、E17は、最適な細胞の生存を可能にするために、より高い密度で播種する必要があるかもしれないより古い組織しながら、わずかに低い密度で播種する必要があるかもしれません。さらに、シトシンアラビノシド（Ara-C）は、古い組織においてより豊富であるグリア細胞の成長を防止するために、古い培養物に添加する必要があるかもしれない。

共培養物を作成する際に上述したように、それは、トランスフェクトされたHEK293またはα1/β2/γ2HEK293発現する細胞の最適な数をめっきすることが重要である。しかし、それは、それらの生存率の違いにより、各個々の細胞株のためにこれを決定する必要があるかもしれない。この馴化ニューロン培地はあまり希釈し、条件ことないことを保証するように、典型的に50μlの最大容量で30,000細胞は、すでにニューロン培養培地500μlを含んでいる24ウェル皿の各ウェルに添加されるべきである各ウェル内、 例えばかなり一定のまま成長因子の濃度。各ウェルに50μlを上回るボリュームを追加すると、一般的にニューロンを殺す。

共培養技術の主な欠点の1つは、神経細胞培養は、ニューロンがその正常な微小環境から除去され、それらの正常な解剖学的組織を確立することができないされていることを意味する単層として増殖させ、解離した細胞から作成されることである。したがって、それらは、シナプスの発達の初期段階に影響を及ぼし得る他の細胞からの適切な接続、入力および分泌された分子を欠いている。例えば、in vivoでの中型有棘ニューロンが密にグルタミン酸作動性皮質からの入力、視床や他の脳領域34によって支配されているこれらの入力は、線条体組織の切開中に損傷されているので、しかし、私たちの神経細胞培養グルタミン酸作動性シナプスでは形成しない。どのように培養された中型有棘ニューロンにおける機能グルタミン酸作動性シナプスの不在はAFFクト互いに、および/ ​​またはGABA AのRを発現しているHEK293細胞とGABA作動性シナプスを形成する能力は、未解決の問題のままである。この質問は容易に皮質グルタミン酸作動性ニューロンは、それによって、それらを35の前HEK293細胞の添加に機能的シナプスを形成させるとともに、中型有棘ニューロンを培養することによって対処することができる。別のアプローチは、成熟およびシナプス形成のために重要であり得る細胞構築の一部を維持する器官型スライス培養に基づく共培養モデル系を設計することであろう。しかし、器官切片培養は、ここで行われた分析が損なわれる可能性が緻密かつ異種の神経網を持っている。これは十分に高い表面発現30を与えシナプス形成に必要でないように見えるが、共培養アッセイを使用することの別の重要な欠点は、GABA A Rは、それらが神経細胞内にあるようにクラスタ化されていないHEK293細胞の表面で発現されるということである。例えば、rの中odent脳と海馬培養において、α1、GABA AのRサブユニットは、錐体細胞のシナプス後のすべてのドメイン上で最もGABA作動性シナプスで発見されている。しかし、α2は、具体的には細胞体と樹状突起上のシナプスのサブセットに位置しているが、免疫蛍光および電子顕微鏡36によって明らかにされたように、軸索の初期セグメントで非常に濃縮されている。共培養におけるシナプス形成が依然として確実に検出することができることを考えると30分析し、これは、HEK293細胞の細胞表面でのGABA A Rs の密度は、シナプス内のこれらの受容体の密度よりも同様に、またはそれ以上であることを示唆しているニューロン内のクラスタ。これが適切に組み立てられたGABA A Rs が十分に存在する場合、少なくとも部分的には、なぜそのようなニューロリギンシナプス接着タンパク質、およびそのようなgephyrinなどのシナプス後肥厚タンパク質は、共培養においてシナプス形成に必要ではなく、説明することができ密度。

これはよく、GABA A Rs は構造的および機能的に不均一であることを文書化され、かつ受容体サブユニット組成物は、それらの細胞内局在および薬理学的特性を決定する。サブユニットは、ほぼ独占的に存在する領域外GABA A Rs のであるが、例えば、2サブユニットの組み込みは、GABA A Rのシナプス局在化のための前提条件であることが知られている。組み合わせのみαβ組み込む受容体はまた、主にシナプス外ドメイン12- 14に局在していると考えられている。この特異性は、我々の同時培養系で維持されているか否かを容易に一過性ニューロン培養物に追加する前に、安定してαおよびβサブユニットを発現するHEK293細胞株に2又はサブユニットのcDNAをトランスフェクトすることによって試験することができる。このアプローチを使用して我々の予備実験では、シナプス結合が容易にspeciことを示す、2つだけのサブユニットの存在下で形成されていることを示唆しているin vivoで観察ficity、インビトロで維持される可能性がある（データは示さず）。

さらに、異なるαサブユニットを組み込んGABA A Rs が選択的に、シナプス前ニューロンの特定のタイプで形成されたシナプスの連絡先に局在している。例えば、淡蒼球内、α1-GABA A Rs は 、一般的に線条体淡蒼球（STR-GP）で発見され、それぞれ、中型有棘ニューロンの樹状突起および体領域の上に配置されているpalliopallidal（GP-GP）シナプス、。 α3-GABA A Rs は中型有棘ニューロンのperisomatic地域に位置しており、これらのニューロンの遠位樹状突起上に位置し、線条体32からの入力によって主に接触されるα2-GABA A Rs をしながら、地元のGP軸索担保によって接触される。シナプスの異なるタイプ及び異なるニューロンコンパートメントにおける特定のαサブユニットの発現はまた、ヒップなどの他の脳領域において実証されているocampus 21と18,20新皮質。これらの知見は、特定の抑制性シナプスは、脳内に形成されているどのように問題を提起する。シナプス前終末の特定のタイプの接着は接触点に特定のGABA A Rサブタイプの挿入を誘導していますか？受容体は、それらの形質膜挿入は、特定の起源の軸索の端末の接着のための前提条件である彼らのサブユニット組成によれば、特定の細胞内位置に人身売買されていますか？現在までに、これらの問題は未解決のままである。このような共培養モデル系として縮小モデル系の使用は、システムが重要なのは、DNA構築物および試薬の適用のトランスフェクションを容易に適しているとので、私たちは、この複雑な質問への回答を開始することができ、それは、生細胞イメージングの分析に適して30。したがって、我々は、GABA A Rs の異なるタイプを含む個々の分子の役割のテストを開始することができ、このモデル系を使用して、知っているnはシナプスの連絡先に存在することができます。別の利点は、数分から数時間以内に急速にこのモデル系の形のシナプスは、実験の持続時間を減らすことである。同様に共培養モデル系が正常に新規のシナプス分子27,37,38をスクリーニングするために過去に使用した。

中枢神経系は、制御、例えば、行動や認知に非常に複雑にニューロン間の接続を、開発し成熟し、フォームを理解、基本的に重要である。この遠い目的は、開発中に認識および細胞間通信の個々のステップを支配する分子メカニズムの輪郭を描くことによって達成される。による複雑性のために、これらの複数の細胞の相互作用の分子的詳細は現在、縮小システムに精度で調べることができる。しかし、能力は、タンパク質の複数の組み合わせを表現する方法、および研究することによって、これらのシステムの複雑さを増加させるそれらは、例えば、遺伝子欠失のアプローチと比較していくつかの利点を有する相互作用する。単一の遺伝子欠失の効果の正確な解釈は、多くの場合、特に発達中の脳において、元の病変の影響をマスクする代償機構に伴う変化に影響されるためである。ここで説明するシンプルで有益な共培養技術は、シナプス形成におけるGABA A Rの構造的役割の発見を可能にし、GABA A Rs と他の細胞接着分子および/ ​​またはシナプスマトリックスタンパク質が相互作用するかを検討する可能性を開いているシナプス形成の間。シナプスマトリックスタンパク質は、それらが最近グルタミン酸作動性シナプス形成39において重要な役割を果たすことが実証されていることを考えると特に重要である。これらは「通常＆ガイド分子機構の知識を前進させる可能性があるため、共培養モデルのさらなる開発は重要である＃8217;したがって、脳の発達とは、これらのメカニズムは、例えば、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害や他の多くのような多くの神経発達疾患において変化している方法についての我々の理解を向上させる。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

私たちは、MRC英国（G0800498）からの財政支援に感謝し。我々はまた、抗生物質耐性を含むをpcDNA 3.1（+）発現ベクターを提供するために、GABA A -Rサブユニット固有のγ2抗体および教授R·ハーベイ、薬局のUCLスクールを提供するため、教授JM Fritschy、チューリッヒ大学に感謝したいと思います安定にトランスフェクトされたHEK293細胞株の産生のための遺伝子。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Life Technologies11960-04437°Cの水浴で温めます。C 使用前の
L-グルタミンライフテクノロジー25030-024
ペニシリン/ストレプトマイシンライフテクノロジーズ 15070-063危険性:刺激性
FBS (ウシ胎児血清)ライフテクノロジーズ 10106-169
神経基礎ライフテクノロジーズ 21103-04937°Cで水浴中で温めます。C 使用前の
B27 サプリメントライフテクノロジー17504-044
グルコースSigma-AldrichG8769
HBSS (10X)ライフテクノロジーズ 14180-046
HEPES (1M)ライフテクノロジーズ 15630-056
PBS (1X)ライフテクノロジーズ 10010-031
pcDNA 3.1(+) 哺乳類発現ベクター(遺伝選択)ライフテクノロジーズ V790-20
pcDNA 3.1(+) 哺乳類発現ベクター(ゼオシン選択)ライフテクノロジーズ V860-20
pcDNA 3.1(+)ライフサイエンスV870-20
安定したHEKα1&ベータ;2&ガンマ;2ラインSanofi-Synthelabo, Paris
Poly-D-lysineSigma-AldrichP1149
G418 二硫酸塩 (Geneticin)Sigma-AldrichG5013危険性:刺激性
Phleomycin D1 (Zeocin)Life TechnologiesR25001
Hygromycin BLife Technologies10687-010危険性:毒性、刺激性、腐食性
トリプシン-EDTALife Technologies25300-05437°Cのウォーターバスで温めます。使用前にC。危険:刺激性。
ポリ-L-リジンSigma-AldrichP6282
ラミニンSigma-AldrichL2020
100 μm ナイロンセルストレーナーVWR734-0004
シトシン &β;-D-アラビノフラノシド (Ara-C)Sigma-AldrichC1768危険性: 刺激性
キレート剤 (Versene)Life Technologies15040-033
リポソームトランスフェクション試薬 (Lipofectamine LTX) とリポソームトランスフェクション緩衝剤 (PLUS 試薬)。Life Technologies15338-100代替トランスフェクション法:エフェクテン試薬
非リポソームトランスフェクション試薬(Effectene reagent)Qiagen301425
還元血清培地(Opti-MEM)Life Technologies11058-021
Synaptic Systemsに結合したマウス抗シナプトタグミン抗体105311C5
Neurobasal ALife Technologies10888-022
ナトリウム(NaCl)VWR27810.364
GlycineSigma-AldrichG1726
BSA(ウシ血清アルブミン)Sigma-AldrichA3294
モルモット抗ガンマ;2 GABAA 受容体抗体Prof. Jean Marc FritschyN/A(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, JM and Mohler, H. J. Comp. Neurol. 359 (1), 154-194 (1995).
Triton X-100PromegaH5141
マウス抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ (GAD)65 抗体メルクミリポアMAB351
マウス抗シナプシン抗体シナプスシステム106-011
マウス抗β;2/3 抗体 (BD17)Merck MilliporeMAB341
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibodyProfessor Anne StephensonN/A(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al. J. Comp. Neurol. 416 (2), 158-172
Cy5抗体に結合したヤギ抗モルモットメルクミリポアAP1085
ヤギ抗マウス アレクサフルオ488抗体メルクミリポアAP124S
ヤギ抗マウス アレクサフルーア 405抗体ライフテクノロジーズ A31553
ヤギ抗マウス アレクサフルーア555抗体ライフテクノロジーズ A21422
ヤギ抗ウサギ アレクサフルーア488抗体ライフテクノロジーズ A11008
封入試薬(プロロングゴールド)ライフテクノロジーズ P36930室温で使用
ズ ズ Cy5 塩化

参考文献

  1. Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Defining the role of GABA in cortical development. J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).
  2. Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).
  3. Structure Sieghart, W. pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes. Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).
  4. Unwin, N. Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels. Cell. 72, 31-41 (1993).
  5. Homanics, G. E., et al. Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).
  6. Gunther, U., et al. Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).
  7. Mohler, H. GABA(A) receptor diversity and pharmacology. Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).
  8. Low, K., et al. Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science. 290, 131-134 (2000).
  9. Rudolph, U., et al. Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes. Nature. 401, 796-800 (1999).
  10. Rudolph, U., Knoflach, F. Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes. Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).
  11. Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles. Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).
  12. Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin. Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).
  13. Schweizer, C., et al. The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses. Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).
  14. Belelli, D., et al. Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).
  15. Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).
  16. Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors. J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).
  17. Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).
  18. Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors. Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).
  19. Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses. Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).
  20. Ali, A. B., Thomson, A. M. Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex. Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).
  21. Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus. Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).
  22. Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat. Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).
  23. Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).
  24. Siddiqui, T. J., Craig, A. M. Synaptic organizing complexes. Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).
  25. Tanaka, H., et al. Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin. Cell reports. 2, 101-110 (2012).
  26. Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses. Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).
  27. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  28. Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins. Cell. 119, 1013-1026 (2004).
  29. Dong, N., Qi, J., Chen, G. Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors. Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).
  30. Fuchs, C., et al. GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses. Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).
  31. Ventimiglia, R., Lindsay, R. Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 2nd edn, MIT Press. 371-393 (1998).
  32. Gross, A., et al. Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses. Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).
  33. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).
  34. Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).
  35. Lalchandani, R. R., Vicini, S. Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures. Physiological reports. 1, (2013).
  36. Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).
  37. Linhoff, M. W., et al. An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers. Neuron. 61, 734-749 (2009).
  38. Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development. J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).
  39. Wit, J., et al. Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development. Neuron. 79, 696-711 (2013).

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