方法論記事

の高分解能電子顕微鏡ヘリコバクター·ピロリ CAG IV型分泌系線毛

DOI：

10.3791/52122

⸱

2014年11月21日

 ,  , 
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

この記事について

サマリー

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ここでは、Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS)として知られる発癌性細菌オルガネラを可視化する方法を説明します。 Cag-T4SSは、鉄の利用可能性のさまざまな条件に応じて、ピロリ菌の表面で異なる方法で生成されることがわかりました。

要約

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ヘリコバクター・ピロリは、人間の人口の半分のヒト胃ニッチにコロニーを形成するらせん状のグラム陰性菌です1,2。 ピロリ菌は胃がんの主な原因であり、がん関連死の世界で2番目に多い原因です3。 胃疾患のリスク増加と関連している病原性因子の1つは、ピロリ菌の染色体内の40kbの領域であるCag病原性島であり、IV型分泌系と同族のエフェクター分子であるCagAをコードしています4,5。 Cag-T4SSは、CagAとペプチドグリカンを宿主上皮細胞5,6に移す役割を担っています。 Cag-T4SSの活性は、サイトカイン発現のアップレギュレーション、炎症誘発性経路の活性化、細胞骨格リモデリング、発がん性細胞シグナル伝達ネットワークの誘導など、宿主細胞生物学に多数の変化をもたらします5-8。 Cag-T4SSは、内膜と外膜にまたがり、細胞から細胞外空間まで伸びるサブアセンブリコンポーネントで構成される高分子マシンです。 Cag-T4SSの細胞外部分は「毛膜」5と呼ばれます。 多くの研究により、Cag-T4SS線毛は宿主-病原体界面9,10で形成されることが実証されています。 しかし、この重要なオルガネラの生合成を調節する環境的特徴は、ほとんど不明のままです。 最近、鉄の利用可能性が低い条件がCag-T4SSの活性と線毛生合成を増加させたことを報告しました。 ここでは、ヒト胃上皮細胞と共培養する前に、さまざまな鉄の利用可能性の条件下でピロリ菌を増殖させるための最適化されたプロトコルを紹介します。 さらに、高分解能走査型電子顕微鏡分析により、鉄制限条件下で示される超毛様化表現型の可視化のための包括的なプロトコルを提示します。

概要

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ピロリ菌感染は、胃がん1の重大な危険因子です。 しかし、疾患の転帰はさまざまであり、宿主の遺伝学、ピロリ菌株の遺伝的多様性、宿主食などの環境要素など、多くの要因に依存します11。 以前の報告では、ピロリ菌感染、鉄欠乏症(血中フェリチンおよびヘモグロビン濃度の低下によって測定)、およびIL-8分泌を含む炎症性サイトカイン産生の増加との間に相関関係が存在することが確立されています。これは最終的に胃疾患の進行の増加につながります12。 急性ピロリ菌感染は、宿主の栄養鉄吸収能力を損なう低塩素酸症とも関連しており、最終的には鉄の恒常性の変化につながります13。 これらの臨床知見は、胃ニッチ内の鉄の利用可能性が疾患の転帰における重要な要因である可能性があることを示唆しています。 実際、ピロリ菌感染の動物モデルでは、食事による鉄の摂取が少ないと胃疾患が悪化することが実証されています14。 これらの動物の鉄レベルの低下は、ピロリ菌が細菌の複製に必要な鉄を得るために鉄獲得応答を誘導することを必要とします。ピロリ菌は、宿主細胞内の鉄輸送を攪乱して、CagA依存的な方法で細菌の複製を促進する能力を持っています15。 興味深いことに、cag病原性島は鉄応答性転写因子Fur1....

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プロトコル

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1. H.ヒトの胃上皮細胞と鉄可用性と共培養の様々な条件でピロリ菌の成長

  1. H.を選択これらの研究のためのピロリ菌株のPMSS1それが無傷のCAG病原性島を有しており、機能しているIV型分泌系を表現しているため。また、ネガティブコントロールとして同質遺伝子ケージ変異体（PMSSIΔCAGE）を利用する。 5％CO 2存在下、37℃で24時間、5％ヒツジ血液（血液寒天プレート）を補充したTSAプレート上で細菌を成長させる。
    注：試薬を準備し、材料および装置の表で概説したような材料を組み立てる。各試薬の最終的な濃度は、括弧内に記載されています。
  2. 滅菌綿棒を用いてプレートからの細菌をこすりや部品から製造された改質ブルセラブロス中に接種し（材料および機器の表を参照）およびコレステロールを補った。 37で一晩培養液をインキュベート毎分（rpm）200回転で振とうしながら、5％CO 2を補充した室内空気中のC°。
    NOTE：コレステロール起因血清が複雑であるという事実のために、ウシ胎児血清の代わりに使用されている。結果のばらつきの原因となるようなヘムなどの栄養素の鉄の多数の供給源を含む。
  3. 細菌培養の日に、12ウェルプレート（ウェル当たり約1×10 5細胞）でポリ-D-リシン....

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結果

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本稿では、鉄利用能を変化させる条件はH.を調節する能力を有することが実証されているホスト病原体の界面でのピロリ菌 CAG-T4SS線毛生合成。 、H。単独の培地で培養した場合ピロリ菌は 3線毛/セルの平均を形成している。ときにH.ピロリ菌は、鉄で栽培されて枯渇細菌の増殖（ 図1）サブ阻害性である（合成キレート剤ジピリジルを使用）の条件は、細菌が作り出す数々のCAG-T4SS線毛（〜7線毛/セル）とき、人間の胃の細胞と共培養（ 図2）。栄養鉄の外因性源が存在する場合には逆に、CAG-T4SS線毛の形成が抑制される（FE試料中の1未満線毛/細胞、1未満線毛/ FE +ディップサンプル中の細胞）（ 図2）。宿主-病原体界面での線毛の定量化は、鉄制限、Hの状態であることを明らかにしピロリ菌は、CAG-T4SS線毛た（p <0.000の2倍の増加を示す 1）培地のみで増殖した細胞と比較して11％（p <0.05.......

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ディスカッション

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鉄は、細菌性病原体を含む人生のほとんどの形態、必須の微量栄養素​​である。侵入微生物の生存を制限するための努力では、脊椎動物のホストは「栄養免疫」18として知られるプロセスで栄養鉄を隔離する。これに応答して、細菌性病原体は、その周囲を感知し、そのような鉄獲得システム、毒素および毒素分泌機構19,20などの病原性機能の精緻化を調節するためにグローバルなシグナル伝達分子として鉄を使用するように進化してきた。

ピロリ菌は、鉄、亜鉛、および22を成長させるようなヘム、ヘモグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン23として代替鉄源を使用することができるマグネシウムなどの微量栄養素を必要とする。H.ピロリ菌は 、最も成功した病原体のように、それは、ホスト21からの栄養素の鉄を除去を助けるために病原性因子の幅広いレパートリーを進化してきました。一つの毒性因子、CagAは、エフェクターmolecuルCAG-T4SSのは、それが容易に栄養鉄源として細菌.......

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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この研究は、退役軍人省のキャリア開発賞1IK2BX001701と、国立トランスレーショナルサイエンス推進センターからのCTSA賞UL1TR000445によって支援されました。 その内容は著者の責任であり、必ずしもNational Center for Advancing Translational SciencesまたはNational Institutes of Healthの公式見解を表すものではありません。 走査型電子顕微鏡実験は、NIHの助成金CA68485、DK20593、DK58404、DK59637、およびEY08126の支援を受けたVUMC Cell Imaging Shared Resourceを使用して部分的に実施されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
変性ブルセラブロスペ
プトン(10 g / L)Sigma70172
動物組織の消化物(10 g / L)Sigma70174
酵母抽出物(2 g / L)Sigma92144
デキストロース(1 g / L)SigmaD9434
塩化ナトリウム(5 g / L)サーモフィッシャーS271-10
コレステロール(250X)(4 ml / L)Life Technologies12531018
塩化第二鉄(100または250 uM)Sigma157740-100G
ジピリジル(200 uM)SigmaD216305-100G
修正RPMI
RPMI + HEPES(1X)Life Technologies22400-121
シ胎児血清(100 ml / L)Life Technologies10438-026
電子顕微鏡の準備パラ
ホルムアルデヒド(2.0%水性)電子顕微鏡科学15713
グルトアルデヒド(2.5%水性)電子顕微鏡科学16220
コジル酸ナトリウム(0.05 M)電子顕微鏡科学12300
四酸化オスミウム(0.1%水)電子顕微鏡科学19150
エタノール(絶対)シグマE7023
コロイド銀塗料電子顕微鏡科学12630
SEMサンプルスタブ電子顕微鏡科学75220
カバースリップサーモフィッシャー08-774-383
IL-8 分泌評価
Quantikine IL-8 ELISA キットR&DシステムズD8000C
カゼインからのウカ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
  2. Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141

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