発生中にニワトリの胚を見てアクセスすることは困難な場合があります。私たちは、シンプルで費用対効果が高く、教室や研究現場で簡単に使用できるex ovo法を開発しました。この方法は、胚発生の後期段階(HH 40)への胚へのアクセスを提供します。
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この記事について
サマリー
要約
>jove_content<解剖学、発生学、発生生物学の研究は、主にモデル生物の使用に依存してきました。生きた胚の発生を研究するために、ニワトリなどのモデル生物がよく使用されます。ニワトリは、低コストでメンテナンスが最小限であるため、優れたモデル生物ですが、不透明な卵殻に囲まれているため、観察上の課題があります。胚が成長するにつれて胚を適切に見るためには、殻を窓にするか、取り除かなければなりません。ウィンドウ法とex ovo法の両方が、研究者が胚発生の研究を支援するために開発されました。ただし、各方法には制限と課題があります。ここでは、多くの臓器が発達したHH19段階から発生後期(HH40)までの胚発生を観察できる、ニワトリ胚のシンプルで最適化されたexovo培養技術を紹介します。この手法は、学部のクラスでも、胚操作が行われるより高度な研究室でも簡単に採用できます。
概要
Ex ovoの培養は、ニワトリ1、2の発達の研究において重要な役割を果たしてきました。この培養法は、神経疾患、四肢の発達、頭蓋顔面の発達の研究、および糖尿病に関連する奇形を調査するモデルとして使用されてきました3、4、5。
ex ovoのテクニックには多くのバリエーションがあります。最も一般的なアプローチは、発泡スチロールのカップ6,7,8またはガラスのボウル5を使用することです。これらの方法では、カップまたはボウルにラップを敷いて胚を抱きかかえ、カップに蓋をして、次いで胚を適切な湿度6のインキュベーターに入れる。ただし、この設定は技術的に困難な場合があります。最初の課題は、胚を抱きかかえるために使用されるラップです。このラップは扱いにくく、カップにあまり密着しないことがよくあります。この問題を解決するために、カップの周りにゴムバンドを配置して、ラップを所定の位置に保持します。それにもかかわらず、ラップはまだ滑る可能性があり、これは胚にとって致命的です。ラップは、胚の操作や観察中に使用される可能性のある鉗子や針によって破れたり穴が開いたりする可能性があります。最後に、このセットアップはあまり安定しておらず、学生は簡単にカップを倒すことができます。また、カップの高さは、胚を実体顕微鏡の下に置くことを非常に困難にしており、これはステージの高さに対する目的が限られています。これらの課題により、学部生が高度な発生生物学コースなどの教育研究室で生きたニワトリの胚を扱うことが難しくなっています。
ex ovo法における上記の課題は、研究者が胚のニワトリの発生を見るためにウィンドウ法9,10に目を向けることを意味しています。この技術では、胚を覆う卵殻に穴または「窓」が作られます。穴は、さらなる胚発生を可能にするために、テープまたはワックス9で再シールすることができる。ウィンドウ化法には、胚発生を見ることができる、メンテナンスが容易であるなど、いくつかの利点がありますが、いくつかの制限もあります。1つ目は、胚全体を見るためには(特に後期に)、窓をかなり大きくする必要があるということです。第二に、大きな窓は密閉するのが困難です。不適切なシールは、無菌性と生存性の問題につながります。溶融ワックスをシーラントとして使用すると、プロトコルに別の不便で厄介なステップが追加されます。したがって、ウィンドウ法は若い段階(HH 11 – HH 27)のニワトリ胚には理想的かもしれませんが、後期段階で胚全体を見ることは容易ではありません。
ここでは、ハイテク機器の必要性を回避し、実体顕微鏡での取り扱いが容易で、胚が顕微鏡操作を行うのに十分なサポートを提供し、研究者が発生の後期段階(HH 40-41まで)まで胚の成長全体を見ることを可能にする、改良された単純なex ovo培養技術11について説明します。ex ovo技術のこれらの進歩により、個々の個体は胚発生についてより完全な理解にアクセスできるようになりました。たとえば、後の段階への成長により、骨化、羽毛の発達、手足や目の発達の進行など、この時点まで発生しなかった発達過程を観察することができます。胚全体、胚外膜、血管系がはっきりと見えます。また、胚操作(阻害剤に浸したビーズを移植したり、組織層間に障壁を挿入したりする)など、より高度な研究を行うこともでき、研究者は後段階の胚での操作の影響を観察することができます。
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プロトコル
注：すべての物資を表1に記載されています。
1.鶏胚の保存
- ガルスは約40％の湿度で37°Cので水平ガルスと1日1回または2回卵を回し株の鶏の卵をインキュベートする。卵を回すと、卵殻に付着するの胚を防止することが重要である。
- 4 O Cで卵を保つ、前にそうでない胚は卵黄塊に腹側に位置され、さらにステップ3で卵を開くに破損しますように文化のセットアップに24時間で卵をオンにしないでください「停止」開発へのインキュベーション前せいぜい1週間程度が、これは理想的ではありません。
2.鶏胚をステージング
- ハンバーガーとハミルトン12ステージング表を使用して、ニワトリ胚を上演。 EX-OVO培養をセットアップするための理想的なステージは、HHステージ19-20（インキュベーションの3日前後）BECですこのause頭が53 HPFで回転直後にある。
注：HHステージ19-20は、以下の形態学的特徴によって特徴付けられる：体節の尾の大部分に拡張され、しかし尾の最後尾芽がカールされ、セグメント化されていないまま、尿膜が小さく、脈管構造を制限して、脚芽は翼の芽より大きく、目は無着色であるか、または灰色がかった色合いを持っている。
3.シェルから胚を削除する
- シェルから胚を削除する前に、70％エタノールでシェルをスプレーし、乾燥させます。これは胚を損傷するように急速に卵を入れないでください。
- 、卵の向きを変える慎重に下側に卵を割る（すなわち、インキュベーション中に腹だった側）と、滅菌に胚を解放しないように注意してくださいということは、ボート（88 X 88 X 23 mm）を量る。ダウンワイプ70％エタノールでボートを量る。卵黄袋が破損していないことを確認するために胚を点検。卵黄hの場合、破損それは生存しないであろうように、胚を破棄。
- それが実行可能であることを保証するために胚を観察。心臓が鼓動している、血管系が正常に表示され、明らかな異常は存在しない。量るボートのエッジが乾燥していることを確認してください。
- ピペットを用いて、感染を防ぐためにアルブミンの上にペニシリン/ストレプトマイシンを40μl（5000単位のペニシリン、1mlあたり5 mgのストレプトマイシン）をドロップします。
4.湿度商工会議所の準備
- キム·ワイプおよび/または無菌のプラスチック容器（12×12×6センチ）の底に綿で作られた吸収パッドの小さな積み重ねを置き、70％エタノールで拭い。
- キム·ワイプおよび/または綿（水約150ミリリットル）を湿らせるために、滅菌蒸留水を追加します。
5.例OVO文化の組み立て
- 湿ったパディングの上に胚を含む量るボートを置きます。その後、Tの上に正方形の無菌のペトリ皿（9.5 X 9.5センチメートル）の代わりの半分彼は緩い蓋を形成するためにボートを量る。
- その蓋付きのプラスチック容器をカバーしています。まだチャンバ内の良い空気の流れを可能にし、部分的なシール性を確保する、蓋の2コーナーを押し下げます。
- 慎重に所望の段階まで37 O C のインキュベーターにセットアップを置く。
- 制御された湿度のインキュベーターが使用できない場合、湿度を制御するのを助けるために培養器内の水の容器を置きます。湿度チャンバー内で、インキュベーター内のすべての水を殺菌し、インキュベーション期間中に必要に応じて補充する。 40％の湿度が理想的です。
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結果
方法OVOこれexは （ 図1Aおよび1B）開発の後期段階（HH 40-41）、開発の初期段階（HH 19/20）からの胚を観察することができます。 HH 19-20で培養物を設定するには、培養液中の胚の生存性を向上させます。生存性、培養中、ステージ21の後に非常に低い（53 HPF前）を回し頭に先立ち、胚が少なく、完全な胚が得られるように、取り外す上のシェルにより固執する傾向がある。一般的には、文化OVO EXにおける胚の生存性は高いHH 35-36（百分の90から100）までですが、それは（約40％がHH 40-41に生き残る）開発のより進行した段階で低下します。その開発は、これらの後期の段階で正常表示され、骨格のパターニング4,15影響を受けないことが示されているが、さらに、我々は、四肢骨化の度合いやタイミングが影響を受ける可能性があることを示唆しているこれらの後期段階で折り曲げられていることを観察した。これは驚くべきことではない骨化のためのシェルからのカルシウムの必要性を検討。対照と比較...
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ディスカッション
利点と課題を持っているの両方を培養し、ウィンドウイングOVO例 。ここでは、メソッドOVO発泡スチロールのカップEXとここに示した方法OVO私たちの最適化された元のウィンドウ操作方法の利点と課題を比較する。我々の方法は、学部教授の研究室のクラスで使用することがさらに非常に簡単に作る方法1、2、3、OVO伝統EXに操作と開発の後期段階にあるニワトリ胚の容易な観察 と私たちの改良を可能にします。
それが実行するのが簡単で、開発の後期段階（HH 41-42）に優れた生存性を持っているので、多くの研究者が鶏の開発を研究するためのウィンドウメソッドを好むが、それには限界がある。ステージHH 30の後のHHステージ30の後に全体の胚を表示する能力が限られとなっている最大のものは、卵殻の窓は、胚を移動し、成長を表示するために非常に大きくする必要がある。この大きなウィンドウは差分ですicult完全に（無菌性および生存性に問題につながる）にシールする...
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開示事項
著者は、この原稿に記載されている情報に関してには競合する経済的利益を持っていない。
謝辞
我々は彼の撮影中の作業と、この原稿のビデオ部分を編集するためのマウントセントビンセント大学のポール·ポワリエ、メディアプロデューサーを、感謝したいと思います。当社は、資金調達のためにカナダの自然科学工学研究評議会を承認。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Σ | P4458 | 凍結/融解を避けるために小さなアリコートを作る |
| スクエア ペトリ皿 | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| 重量を量 | ボート フィッシャー サイエンティフィ | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| ジップロック容器 | ジップロック | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
参考文献
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