脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

サマリー

脊髄損傷は、深刻な罹患率および高い死亡率を引き起こす外傷性状態である。本研究では、具体的に、神経幹細胞の移植に続いて、マウスにおける脊髄損傷の挫傷モデルを記述する。

要約

脊髄損傷は、神経学的機能障害の複合体により特徴付けられる壊滅的な臨床症状である。脊髄損傷の動物モデルは、損傷に対する生物学的応答を調査し、潜在的な治療法を試験するための両方に使用することができる。外科的に露出した脊髄に送達挫傷又は圧迫傷害病理の最も広く使用されるモデルである。この報告では実験的な挫傷特定傷害パラメータの定義によって再現可能な損傷動物モデルの作成を可能にする無限ホライゾン（IH）インパクター装置を用いて行われる。幹細胞移植は、一般的に、この衰弱状態を硬化させるための潜在的に有用な戦略と考えられている。多くの研究は、幹細胞の種々の移植の効果を評価した。ここでは、CD1マウスにおける細胞の尾静脈注射に続いて、脊髄損傷のために適応する方法を実証する。 I）細胞標識のWi：一言で言えば、我々はのための手順を提供重要なトレーサー番目と、ii）マウスの術前治療、挫傷、脊髄損傷のiii）の実行、および死後の神経前駆体のiv）の静脈内投与。この挫傷モデルは、再生医療のアプローチでは、幹細胞移植の有効性および安全性を評価するために利用することができる。

概要

脊髄損傷（SCI）は、スポーツや暴力^1、自動車事故のような高エネルギー外傷によって引き起こされる最も一般的な損傷である落ちる。重度のSCIでは、傷害力は神経機能の突然の喪失を引き起こし、神経組織を破壊するか、損害賠償。外傷性SCIは、年齢の10と40年の間に若年成人に頻繁に発生します。それは非常に患者の心身の状態に影響を与え、社会²に莫大な経済的影響を引き起こす。急性期治療アプローチは、多くの場合、おそらくさらなる損傷^3-4を減衰させるために、コルチコステロイド、外科的安定化及び解凍の高用量に限定されず、SCI後の運動回復にこれらのメソッドの役割はまだ論争されている。急性組織欠損、外傷および複数の細胞型^5-6の変性の原因脱髄および死亡の二次機構の活性化に加えて。機能の回復の程度は、缶10は、損傷部位⁷で免れる白質の程度と相関させること。

SCIの動物モデルは、損傷に対する組織の生物学的応答を調査し、潜在的な治療法をテストするための両方に使用することができる。さらに、ヒト病理の有用な動物モデルだけでなく、その条件のいくつかの局面を再現しなければならないだけでなく、直接の臨床観察および実験上の利点を提供しなければならない。脊髄損傷の最も広く使用されるモデルは、外科的に露出させた脊髄⁸に送ら挫傷又は圧迫傷害を伴う。制御重量ドロップ挫傷の開発はSCI研究の歴史の中で重要なマイルストーンを表している。オハイオ州立大学脊髄研究センターは、コンピュータ⁹により制御される衝撃のパラメータを脊髄の特定の圧縮を誘発するために使用することができ、装置の技術的課題を追求してきた。これは、もともと利用のWiのために設計されました目のラット;後には、マウス¹⁰に向けて適用するように変更されました。この種のアプローチの利点は、損傷の生体力学を深く詳細に研究することができ、損傷のパラメータは、再現可能な実験モデルを得るために、より完全な方法で定義することができることであり、したがって、効果のより正確な評価を可能にする機能回復過程に治療をテストしました。

多くの研究は、SCIモデル¹¹における幹細胞の種々の移植の効果を評価した。我々は最近、数時間のマウスドナー^12-13の死後、サブ脳室帯（SVZ）から成体神経幹細胞を単離した。この手順では、SCIを硬化させるための再生医療のアプローチで有利であると思われる神経幹細胞と呼ばれる死後の神経前駆体（PM-のNPC）の集団を提供する。本論文では、デモンストレーションを行います：ⅰ）​​重要なトレーサーPKH26で細胞標識のためのプロトコル、II）SURG外傷性SCIで実行するiCalの手順、および標識された細胞のIII）静脈内（IV）投与。さらに、本研究で、我々は、移植された細胞は、脊髄損傷部位に移動し、主にタンパク質（MAP）2陽性細胞微小管関連に分化することを実証している。さらに、分化は、後肢機能の安定した回復の促進を伴っている。

プロトコル

注：すべての手順は、ミラノ大学の審査委員会によって承認されたと1986年11月（609分の86 / EEC）日付の欧州共同体指令に準拠して実験動物のためのイタリア語のガイドラインに会った。

移植用の細胞の調製

注：第5回とこれらの実験のために、培養中の第9回継代の間に使用した神経幹細胞;移植のために標識される前に、増殖および分化能力のための文化をテストします。 ^12を免疫細胞化学によって分化の程度を決定します。

1. 1×10 ⁶細胞/150μlの（移植マウスあたり1×10 ⁶細胞）の濃度に再懸濁細胞。細胞の過剰が注射器のロードのために必要とされるので、マウス当たり少なくとも1.2×10 ⁶細胞を準備します。
2. 10ミリリットルコニカルバイアル中の細胞を神経幹細胞培地^13を用いて3回洗浄する。それぞれにおいて洗浄工程、遠心分離により沈殿物を細胞（500×gで5分間、RT）。
3. 最後のスピンの前に細胞を数える。
4. 細胞（5分間500×gで）を遠心分離し、その後、すべての細胞を除去しないように注意しながらしかし上清のせいぜい25μLを残し、上清を吸引除去する。
5. 穏やかにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁に希釈Cの1ミリリットルを追加することによって、2倍の細胞懸濁液を準備します。
6. チューブ中の希釈剤Cの1ミリリットルにPKH26エタノール色素溶液4μlのを追加することによって、希釈Cで^{- （6} M 4×10）と分散させるためによく混ぜ、すぐに染色する前に、2X色素溶液を調製する。
7. 急速に2X色素溶液1mlに2倍の細胞懸濁液の1ミリリットルを追加して、すぐに（最終細胞密度が1.2×10 ⁷細胞/ mlおよび2×10になります^{- 6} M PKH26）ペッティングしてサンプルを混ぜる。
8. 1-5分間細胞/色素サスペンションをインキュベートする。
9. 2（等量のを追加することによって、染色を停止しますml）のHBSS中の1％BSA溶液で1分間インキュベートする。
10. 遠心細胞（500×gで10分間）し、上清を注意深く取り除く。
11. HBSSと遠心（5分間500×gで）の10ミリリットルで再懸濁細胞ペレット。
12. 未結合の色素の除去を確実にするために完全培地10mlで細胞ペレットを2回洗浄する。
13. 細胞の回収、細胞の生存率及び蛍光強度の評価のための完全培地10ml中で細胞ペレットを再懸濁する。細胞は移植のために必要な場合は、洗って、3.3×10 ⁵細胞/ 50μlの濃度で、滅菌生理溶液で再懸濁します。

外科2.準備

1. 清潔手術機器を殺菌。
2. 無菌エージェントで拭いて手術領域を用意。 IHインパクターデバイスを設定します。
3. デバイス、連続フロー誘導商工計量VetScavフィルタ付き活性ガスのスカベンジャー、酸素ジーン：麻酔機器を準備マウス用rator、低流量O ₂メーター。誘導室と手術中に使用されるマスクを清掃してください。
4. 2.5％酸素中の（v / v）のイソフルラン（1L /分）で動物を麻酔し、有効にする薬剤のためのフロー誘導後5分待ってください。ウィスカーがけいれんしているかどうかを確認してくださいまたはフットパッドをつまんに応じて、ゆっくり後肢撤退がある場合。手術中に、2.0％の酸素（v / v）をイソフルラン（1 L /分）にイソフルラン濃度を低下させる。

手術や移植のためのマウスの調製

1. 標準的な条件での実験（22±2℃、湿度65％、および午前8時午後8時から午前人工光）の前に少なくとも3日間のオスの成体CD1マウス（25-30 g）を保管してください。
   注：外科準備から縫合までの全手順は、約40分かかります。
   1. 動物を特定するには、耐水性カラーインクを用いて尾をマーク。
2. 電動式を使用してくださいでICクリッパーは、腰部領域に、約T2レベルで、首からのマウスの背部の毛をカットする。
3. ヨウ化物水溶液とエタノール（滅菌水中70％）を調製した領域を滅菌する。
4. 200μlのゲンタマイシン（滅菌生理食塩液中1 mg / ml）でのサブ皮膚の皮下（sc）注射で動物を治療する。
5. ブプレノルフィンの乾燥を防止し、注入するために、両方の動物の眼に眼科用潤滑剤を塗布（皮下、0.03ミリグラム/ kg）は、痛みを軽減する。

4.椎弓切除

1. 手術中に低体温症の問題を回避するために、暖かいスライド上にマウスを置きます。背側を上にして動物を置きます。
2. T7からT12に、関心領域にわたって、メスとの縦の切開を行います。
3. （通常は胸部背側のプロセス^番目の 5 ^番目と6の間のスペースにあります）標準鉗子を使用して皮膚や表在性の脂肪パッドを持ちます。
4. T6として容器の下にプロセスを数えるその後T7に移動。
5. 背骨の湾曲を高めるために、マウスの腹側の下に少しのベアリングを配置します。グレーフェ鉗子でそれをブロックすることにより、脊髄を固定する。
6. ラミナの連絡先メス先端の背側表面までメスを使用してT7およびT10椎骨レベルから両側性脊椎傍の筋肉をカットします。
7. T7からT10まで接合をオフにチェックするためにメスを使用してください。 T8とT9とげの突起との間の空間に停止します。マイクロハサミでT8-T9とT9-T10の間に組織をカット。
   1. T9プロセスを削除するには骨鉗子を使用してください。慎重にマイクロはさみで筋肉層を削り取ることで接合を公開します。骨が露出するまで続けます。
8. ラミナから筋肉を削除し、椎骨間の小さなスペースを開くために鉗子を使用してください。静かに、骨の下にマイクロはさみを入れ両側のラミナをカットし、ピンセットでこの部分を削除する。
9. fにラミナを削除コー​​ドを公開するorceps。背後にある任意のフリーまたはぎざぎざの骨片を残すしないように注意してください。骨鉗子でそれらを削除する。
10. 切開に近いかもしれ骨膜および任意の骨片や筋肉を削除するには、小さな先端鉗子を使用してください。
11. T9の背側プロセスの上半分を取り外し、IHインパクターデバイスプロトコルに進みます。

5. IHインパクデバイスプロトコル（挫傷）

1. IHインパクデバイスの安定化プラットフォームの中央にマウスを置きます。
2. 2関節の位置決めアーム（胸椎ための左腕、頸椎用右腕）によって安定化プラットフォームに接続された二つの歯鉗子で動物をブロックします。
3. 吻側椎体（T8）の側縁を把握する吻側アームを使用してください。
4. T10椎体を把握するために同じように尾側アームを操作します。
5. 装置内に安定化プラットフォームを置き、チップを下げる（直径0.75mm）とそれに触れることなく、可能な限りコードに近い。
6. 影響を開始する前に、先端を3回の完全な回転を持ち上げます。
7. 100mm /秒で60 kdynの力を提供するように設定インパクとの挫傷を実行します。

6.縫合糸およびポスト·介護

1. 4/0吸収性縫合糸で切開を縫合。削除ラミナのサイトで露出脊髄をカバー。小さな針によってカットの先端で組織を縫合。すぐ上および脊髄露出のサイトの下に2針を入れてください。
2. 根本的な筋肉をピンチオフすることなく、2または3フレックスクリップを使用して皮膚を閉じます。
3. 腰に注射生理食塩水を皮下2mlのマウス術後を水和。
4. 外科リカバリ中に低体温症を避けるために、バック予め温めケージにマウスを置きます。加熱パッド上のケージを置きます。
5. チェックすることにより、急性期後の傷害中にマウスを監視サイズ膀胱、縫合糸と動物の体重一日二回。優しく（流血、曇りまたは沈殿物を含む可能性が尿）尿路の感染症を避けるために、膀胱（7日間1日2回）絞る。
6. 損傷後5日間、食塩水注入（2日間2ミリリットル術後皮下注射）と抗生物質（皮下注射ゲンタマイシン0.2ミリリットル）で一日一回のマウスを扱う。
7. ブプレノルフィンと術後鎮痛のためのマウストリート（0.1 mg / kgをし、一日二回）3日間のけがを投稿してください。

細胞の7尾静脈注射

注：以下のステップで尾静脈に細胞を注入するための手順が示されている。細胞はまた、定位フレーム^15〜16を使用することにより脊髄内移植を投与し、または大槽¹⁷にすることができた。このような間葉系間質細胞のような他の細胞型は、この方法で移植することができることを考慮することが重要である（ 例えば 、骨髄間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、羊水細胞）。さらに、ナノ粒子のような他の治療の選択肢は、脊髄損傷後の尾静脈を介して注入することができる。

1. 使用前に針をきれいにする70％エタノールとPBSを使用してください。唯一の滅菌手袋と針と注射器を扱う。
2. 0.3ミリリットルのシリンジ（29 G針と0.33 1ccシリンジ）への細胞の試験管と負荷75μLで細胞を懸濁します。
3. 気泡が細胞懸濁液中に存在していないことを確認してください。細胞沈殿を避けるために水平位置に注射器を保管してください。
4. 尾静脈を拡張する加熱ランプの下にマウスを置きます。
5. マウスをつかみ、そっと細い青線で外側尾静脈を視覚化するために、マウスレストレーナーにそれを引っ張る。
6. アルコール綿で尾を清掃してください。静脈が可視化されると、左手の中指と親指の間に尾静脈をつかむ。
7. 水平線から15°の角度で表面に針を持参し、ベベルがアップしていることを確認してください。
8. 0.33μL/秒の速度で細胞50μlを注入。注入後、10秒ずつ針の後退を遅らせる。ゆっくりと針を撤回し、細胞懸濁液の可能流出に注意を払う。
9. 負荷の間のステップ7.1のように注射器を清掃してください。

8.行動試験と後肢機能

1. オープンフィールドでマウスを置きます。
2. バッソマウスのスケール^（BMS）18に従って運動機能とオープンフィールド試験で挫傷後の後肢の回復を評価します。
   注：神経機能は、4週間¹⁸のために、損傷後3日目から、定期的に評価されなければならない。

9.灌流

1. 実験期間の終了時に、ペントバルビタールナトリウム（65ミリグラム/ kg）を腹腔内注射により動物を麻酔。つの評価するためにつま先ピンチを使用して、E麻酔レベルは、マウスが侵害刺激に反応した後にのみ進むと。
2. 手術平面上仰臥位で動物を拘束。
3. ちょうど胸郭の下に外皮と腹壁を通してカット。肝臓からダイアフラムを区切ります。
4. 胸膜腔を露出させるために、振動板をカットするはさみを使用してください。
5. 襟の骨まで、胸郭の側面をカット。
6. 剣状軟骨をクランプし、頭の上に止血剤を配置するために止血剤を使用してください。
7. 鉗子で横平面上の心の底三分の一を持ってください。左心室に針を挿入します。
8. 心をクランプする止血剤を使用してください。これは、針を固定し、漏出を防ぐことができます。
9. 右心房をカットするはさみを使用してください。
10. PBSを動物を通じて（18ミリリットル/分）をポンプすることを許可する。 （;約70ミリリットルのPBSに相当する3-4分）バッファ注入期間を通じてこの圧力を維持する。心がきれいになるまで続けます。
11. ポンプを介して固定液（蒸留水で4％パラホルムアルデヒド、4％PFA）を可能にするためにストップコックを切り替えます。 4％PFAは、約8〜10分（300ミリリットル）のために動物を介してポンプを許可します。徐々に30ml /分の最大値に到達するまで圧力を増加させる。硬化肝臓は成功した灌流の最良の指標です。

10.組織の収集および処理、組織学およびIimmunohistochemistry

1. L1にT5から脊髄を解剖。次に、（4℃でO / N）4％PFAで6ミリリットルの組織をポスト修正。
2. クライオそれを保護し、凍結中の結晶の形成を防止するために、4℃で72時間、30％スクロース溶液中で同じ組織を置く。
3. クイックドライアイスを使用してコードを凍結し、-80℃で保管してください。
4. 15ミクロン厚のクライオスタットによるセクションとスライドガラス上にセクションを収集し、免疫細胞化学のために継続する。
5. 各sのPBS200μlのセクションをすすぐLIDE（3回、各5分間、RT）。
6. 200の10％NGSμlのRTで1時間、PBS中0.2％トリトンX-100で各スライドを透過。
7. 各スライドのために200μlのPBS（;各5分間、RT 3回）でセクションをすすぐ。
8. （; PBS中0.1％トリトンX-100を5％NGS）30分（RT）用スライドのブロッキング溶液を200μlとの非特異的部位をブロックする。
9. 4℃でO / N一次抗体200μlを各スライドをインキュベートする（5％NGS中で抗体を希釈し、PBS中0.1％トリトンX-100）。
10. 各スライドをPBS200μlでセクションを洗ってください（3回、各5分間、RT）。
11. RTで2時間、適切な二次抗体でインキュベートする。
12. 各スライドをPBS200μlでセクションを洗ってください（3回、各5分間、RT）。
13. 4 '、6- diamidin -2- phenilindole（DAPI）（1μg/ mlの最終濃度で、室温で10分間）、200μlの染色と核。
14. FluorSave試薬を用いてマウントし、共焦点顕微鏡により分析する。
    注：イン制御決定は、一次抗体は、同じサブクラスの関係のないIgGの同等の濃度の省略、交換する必要があります。微小管関連タンパク質2次抗体を使用した。

結果

移植された細胞の総数は、1×10 ⁶細胞で、尾静脈内に3つの連続した注射に分けた。我々は、リン酸緩衝液（PBS）50μlの3.3×10 ^5個の細胞を投与する。最初の注射は、第二6時間後に、傷害後30分以内に実行され、病変の後、最後の18時間であった。 PM-のNPCを投与するためのSCI後18時間の制限時間の選択は、この時点¹⁴で血液脳関門の最適な透過性によって決定した。幹細胞注射の効果を評価するためには、陽性対照の椎弓切除術の動物を有することが有用であろうた（n = 14）およびPBSを負の対照た（n = 14）のように動物に注射した。

PM-NPCは、後肢機能の回復を改善し、病変部位に移行し、MAP-2陽性細胞で分化

T9挫傷は、プログレッシブグラムに続く後肢機能の一過性の喪失を引き起こしたradual回復します（ 図1）。 2-3週間以内に、PBS処置負傷したマウスは、改善されたと後肢...

ディスカッション

本論文では、70 kdyne（重度）の力で無限ホライゾンインパクターを用いて、外傷性脊髄損傷の再現可能なモデルを得るための方法を記載した。大きな力パラダイム（80 kdyne）を使用して、我々は、残念ながら、より高いマウスの死亡率に関連付けられているより深刻な傷害を引き起こす可能性があります。この問題を回避するために、我々は一般的に、関数の緩やかな回復と低死亡率と再現性の病変に関連した適度な力のパラダイム（70 kdyne）を選択します。そのような安定した傷害を生産するためには、インパクプラットフォーム上で動物の正しい固定に特に注意を払うことが非常に重要です。特に脊髄インパクター先端部を中心としなければならず、インパクターの2つのアームは、互いに平行でなければならない。また、注意が脊椎骨を粉砕することができ、コードが鉗子の先端によって損傷を受けた可能性がある場合、インパクターピンセットで動物をブロックに注意する必要があります。アニマのポジショニング椎弓切除後のLが重要であり、この手順の間に、動物の取り扱いも非常に重要です。特別な注意も常に同じ場所で、同じ拡張子のために実行しなければならない椎弓切除手順に与えられなければならない。これらの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PKH26GL-1KT	Sigma	091M0973
インフィニットホライゾン(IH)インパクター装置	Precision Systems and Instrumentation, LLC	モデル 0400 シリアル 0171
ゲンタマイシン 10 mg/ml	ユーロクロン	ECM0011B	1 mg/ml 滅菌生理食塩水溶液中
イソフルラン-獣医 250 ml	メリアル	B142J12A
ブレファロリン POM OFT 10 g
スライドウォーマー	2Biological Instruments	HB101-sm-402
メス、サイズ10	ランス パラゴン	26920
スモール グレーフ フォーセプス	2バイオロジカル インスツルメンツ	11023-14
ロンゲール	メディコン インスツルメンツ	07 60 07
マイクロハサミ	2バイオロジカル インスツルメン
		13014-14
Reflex 7 創傷クリップ アプリケーター	2Biological Instruments	12031-07
7 mm Reflex 創傷クリップ	2Biological Instruments	12032-07
NGS	Euroclone	ECS0200D
Triton X 100	Merck Millipore	1086431000
Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2	Millipore	AB5622
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008
FluorSave 試薬	Calbiochem	345789
神経幹細胞培地			DMEM-F12 培地 (ユーロクロン) 2 mm l-グルタミン (ユーロクロン)、0.6% グルコース (Sigma-Aldrich)、9.6 gm/ml プトレシン (Sigma-Aldrich)、6.3 ng/ml プロゲステロン (Sigma-Aldrich)、5.2 ng/ml 亜セレン酸ナトリウム (Sigma-Aldrich)、0.025 mg/ml インスリン (Sigma-Aldrich)、0.1 mg/ml トランスフェリン (Sigma-Aldrich)、および 2 μg/mL ヘパリン (ナトリウム塩、グレード II;Sigma-Aldrich)、bFGF(ヒト組換え体、10 ng/ml;Life Technologies)およびEGF(ヒト組換え体、20 ng / ml;ライフテクノロジーズ)
DMEM-F12	ユーロクロン	ASM5002
l-グルタミン	ユーロクロン	ECB3000D
グルコース	Sigma-Aldrich	G8270-100G
プトレシン	Sigma-Aldrich	P5780-25G
プロゲステロン	Sigma-Aldrich	P6149-1MG
亜セレン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S9133-1MG
トランスフェリン	Sigma-Aldrich	T 5391
インスリン	Sigma-Aldrich	I1882
ヘパリン ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	H0200000
bFGF	Life Technology	PHG0024
h-EGF	Life Technology	PHG6045
Syringe 0.33 cc 29 G	テルモ	MYJECTOR
ブプレノルフィン	シェリングプラウSpA	TEMGESIC
アイジェル	バウシュ&ロム	脂肪酸