非侵襲的気管挿管と成体ラットにおける完全な胸腺摘出

サマリー

げっ歯類の胸腺摘出術は、免疫学研究において貴重な技術です。 ここでは、ミニ胸骨切開術と非侵襲的挿管および陽圧換気を使用して、周術期の罹患率と死亡率を最小限に抑えるための成体ラットの胸腺全摘出術のプロトコルについて説明します。

要約

新生児げっ歯類における胸腺摘出は、免疫学的研究のために設立され、信頼性のある手順です。しかし、成体ラットに、胸膜破壊からの出血と気胸の合併症は、かなりの死亡率をもたらすことができる。このプロトコルは、ミニ胸骨切開と気管内挿管を利用したラット胸腺摘出の簡単な方法です。挿管は、非侵襲的かつ容易に再現可能な方法で達成し、気胸を防ぐために陽圧換気及び胸膜の中断を最小限にするように注意胸腺切開するために十分な時間を可能にする制御された気道を可能にしている。まだ胸腺の完全な可視化を提供しながら、1.5センチメートル胸骨切開は、縦隔船舶や胸膜との接触を減少させる。縦隔の露光に続いて、胸腺の倍率で鈍的切開によって除去される。胸膜腔は、次に手術用接着剤の塗布に続いてプレ気管筋の縫合閉鎖によって封止されている。ザ·胸部は、その後皮膚の縫合閉鎖が続く胸骨の縫合閉鎖、によって閉鎖される。免疫組織化学（IHC）隔組織の染色、およびフローサイトメトリーによるナイーブT細胞の欠如によって証明されるように、すべてのthymectomiesが完了した、と手順96％の生存率であった。最小限の合併症を伴う完全な胸腺は、胸腺欠損成体ラットにおけるさらなる免疫学的研究のために所望される場合に適している。

概要

1960年代初頭以来、胸腺は、中央免疫寛容の開発におけるその重要な役割のために認識されてきた。げっ歯類の胸腺摘出は、リンパ球分化、自己寛容、および同種移植及び腫瘍転移の設定で免疫寛容における胸腺の役割を定義する上で不可欠な手順であることが証明された。ラットの胸腺の除去は、T細胞の枯渇またはネイティブナイーブT細胞の再出現することなく定義されたT細胞集団の養子移入を含む研究を可能にする。

新生児げっ歯類におけるThymectomiesは、信頼性の高い成果¹で吸引技術を使用して達成することができる。成体ラットにおいて、この技術は、おおよそ20％の死亡率と関連しており、しばしば不完全な胸腺²になる。一貫して、成体ラットにおける完全な胸腺摘出を達成するために、胸骨正中切開を介して縦隔のオープン露光が必要とされる。しかし、この6％ ^{の2- 4} -手順1.5の範囲の全体的な死亡率につながる気管損傷、出血、および気胸を含む合併症に関連している。

最後の20年間胸腺摘出技術の改善は、周術期合併症を減少しており、生存率が改善している。陽圧換気を可能に気管内挿管は、気胸率⁵軽減されている。挿管の方法は、以前に直接声帯の可視化を使用して、より侵襲性の低い方法に気管に開いた露出の範囲を説明した。挿管手順に関連する合併症は心臓穿刺または上大静脈の裂傷から生じる気管損傷、声帯破裂、意図しない食道挿管、および出血があります。また、胸膜ライニングに下胸腺ローブのすぐ近くには、気胸になることができます。

ここでは、技術を説明平滑末端エンド血管カテーテルおよび経皮的気管照明を用いて気管内挿管の簡単な方法で以下の低侵襲性2cmの皮膚切開を通して胸腺。胸腺摘出1.5センチ胸骨と縦隔を密封し、出血、呼吸器合併症の発生率を最小限にする手術用接着剤の用途に三層の閉鎖を伴う。胸腺及びIHC染色に胸腺組織の欠如後のCD4 ⁺及びCD8 ⁺ナイーブT細胞の消失によって証明されるように、この方法では、確実に完全な胸腺になる。手術時間とペリ手続き死亡率は最小限に抑えている。

プロトコル

注：ラットの使用を含むすべての実験手順は、デューク大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って行われた。

気管挿管カニューレの作製

1. ペンチを切断と2インチ14のG angiocathether針の針端をカット。
2. 針の内腔がラジオペンチで閉じピンチ。
3. ペンチ、オープンルーメン部のエッジまで挟持部を切断し、次いで、30で残りの端部の両側縁をカット - 針縁に対して45°の角度。
4. ストレートスリップジョイントプライヤーのオープンエリアにカニューレの4ミリメートルとわずかに上向きの曲線が最後に形成されるまで上向きに引っ張る - ボトム3を配置します。
   注：これは気管（ 図1）にカテーテルを演出容易にするであろう。
5. カニューレの最後で縁を下に滑らかにするために細かいサンドペーパーを使用してください。
6. 血管カテーテルチューブに鈍化楽器を返します。チューブは鈍化針より少し短いことを確認してください。

2.手術前の手順

1. 動作領域にわたって10倍の倍率に設定されて手術用顕微鏡を配置することによって、手続きのためにサイトを設定します。
2. 動作領域での温暖化パッドを配置し、クリーンな吸収パッドでカバーしています。
3. 手術野の近くに心拍数及び血液酸素モニタをセットアップする。
4. 重量ベースの薬剤の服用（ 例えば、術後の鎮痛剤、抗生物質、またはリンパ球枯渇抗体）のためにラットを秤量する。
   注： - 450gの典型的な成体ラットは、350の間で重量を量る。
5. 誘導チャンバーを用いて気化し、3％イソフルランO _2（3 L /分）と落ち着いたラットは、活性炭を含有する廃棄麻酔掃気システムにベント。気管内挿管のために必要な深い麻酔を提供するために、麻酔誘導のために5分を許可する。
6. 挿管や手術を進める前に皮下ラットにカルプロフェンまたはMeloxicane（4.4ミリグラム/ kg）を管理します。
7. 挿管前に麻酔したラットの首と胸を剃るために電気バリカンを使用してください。

3.挿管

1. 挿管カニューレの先端に潤滑少量（ 例えば、KYゲル）を擦って挿管のセットアップを準備します。コネクタチューブを通してイソフルランガスの流れを開始するために人工呼吸器の電源をオンにします。
2. 挿管装置にラットを移し、その上側切歯（ 図2A）によって金属棒にラットを一時停止する。
   メモ：一部の挿管装置は、オンラインで購入することができます。ここに示したモデルは、ブタンのトーチを用いて2×4インチの腰部片の切片の周囲に成形アクリル板を使用した自家製であり、補強材をクロロホルムで取り付けられている。バー（又は金属ワイヤ）はsの上に配置されたマスキングテープの上に穴を穿孔することによって取り付けられている分裂やクラックを防止するためのアクリルのIDE。
3. 首（ 図2B）の腹側表面2からセンチメートル-柔軟な高輝度光源1を配置することによって、ラットの首をトランスは、照らす。
4. 優しく上向きと下の歯の側に舌を引っ張って生徒標準パターン鉗子のペアを使用してください。片手の親指と人差し指の間に把持舌を舌の下側端部に対して鉗子の一方の側の平坦な内側面を配置している。を押して、腹側に喉頭（ 図2C）の喉頭蓋と開口部を露出させる。
5. 声帯を視覚化し、血管カテーテルのハブが切歯に触れるまで気管内にオープン声門を通して前方に挿管カニューレの上向き、平滑化終了を導く。
6. 金属スタイレットを取り外し、イソフルランで換気を開始するために血管カテーテル口に麻酔チューブを取り付けます。
   注：典型的な酸素FLO人工呼吸器のワット率は3％イソフルラン3 L /分である。
   1. 14 mmHgの - 〜12の圧力を達成し、ボリューム制御人工呼吸器モードで60呼吸/分の速度で人工呼吸器を設定します。 3cmのH ₂ Oの正の呼気終末圧（PEEP）を使用
7. 気管内チューブの適切な配置を確実にするために人工呼吸器に同期してバイラテラル胸壁の拡張を観察する。
8. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、ラットの目に獣医師推奨の眼軟膏を適用します。
9. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、ラットの目に獣医軟膏を適用します。
10. 布テープのストリップでラットの頭部に気管内チューブを固定します。気管内チューブと麻酔薬の流入チューブの間にしっかりと接続を確認してください。
11. ラットの足への血液の酸素と心拍数のモニターを接続し、監視を開始します。への反応がありません確認することにより、適切な麻酔を確認電子ピンチ。

4.開胸と胸腺摘出

1. 手順の全体のための標準的な無菌操作に従ってください。
   1. 作業領域と手術台を清掃し、70％エタノール溶液で消毒する。
   2. 手順中の無菌手術用手袋を使用して、手順の間使用されるすべての機器と材料をオートクレーブ。
   3. 全体胸の部分に - イオジンを適用し、それを乾燥させます。その後、ガーゼに70％エタノールで皮膚の表面をきれいに。無菌手術野を露出するように穴をカットする透明なプラスチックのラップでラットをカバーしています。
2. 上部の胸部に胸骨上切痕を識別します。胸骨上切痕上記3ミリメートルと鈍先端がシェイはさみを使って胸骨正中線に沿って遠位延長 - 2の起動皮膚を通して2cmの正中切開を行います。
3. 鈍先端がシェイはさみを使用して再度胸骨上切痕から1.5センチメートル胸骨正中切開を行います。 Kただゆっくり胸骨、事前の下にはさみの下端をEEP。
4. 前気管ストラップの筋肉（胸骨舌骨と胸骨甲状筋）を明らかにすることだけ分離胸骨とオープンの下に小さなアルムリトラクターを挿入します。ブラントグレーフェ鉗子を用いて予備気管ストラップの筋肉を分離してください。注：この時点で、気管を見ることができ、挿管チューブが気管の内側に視覚化されるべきである。
5. 分離ストラップの筋肉と胸骨の下に小さなアルムリトラクタの突起を配置します。胸腺の優れた面を露出させるために開創器を開きます。
6. 胸腺組織の側縁を解放し、下胸腺ローブを公開する細かいデュモンの鉗子を使用してください。
7. 上大静脈、鎖骨と頸動脈血管との接触を避けるように注意しながら、オープンな切開部位に優しく上方に胸腺を引き、胸腺、肺の間の微妙な胸膜ライニングの中断を最小限に抑え。
8. Tと彼は血管が解剖された胸腺と明らかにし、それらを分割するために、マイクロはさみを使用しています。必要に応じて止血するための容器に圧力を保持するために綿棒を使用してください。
9. 切開部に下胸腺のローブを提供し、その後急激に後部アタッチメントを溶解。そのまま胸腺を取り外し、慎重に不足しているセクションの削除胸腺を検査。
   注：小胸リンパ節、胸腺を可視化し、多くの場合、周囲の胸腺組織から区別することが困難であることができる。これらは、胸腺組織に似た外観を持つ個別の丸いノードになりますが、胸腺との連続性になりません。
10. アルムリトラクターを取り外し、2 5-0マクソン縫合糸を中断して胸骨とsternothyoid筋肉を閉じます。
11. 陽圧換気下縦隔を密封するために、縫合糸両端の外科用グレードのシアノアクリレート組織接着剤の2滴を適用する。
    注：これは気胸や血腫の発生率を減少させる。
12. STを閉じる2とのernumは、切削針に4-0絹縫合糸を中断。下層の筋層を避けるために、ちょうど胸骨の下に針を案内するように注意しながら、リブ間の隙間を通って針を挿入します。
13. 実行中の4-0ナイロン縫合糸で皮膚層を閉じます。術後の麻酔の回復期間を短縮するために、この時点でイソフルランを中止する。
14. 生理食塩水で湿らせたガーゼで切開部位と周囲の皮膚を清掃してください。
15. 切開部をシールするために切開を介してシアノアクリレート接着剤の2滴 - 1、続いて局所麻酔用ブピバカイン（0.25％）数滴を適用する。
16. ラットは独立した呼吸努力の兆候を示しているし、その四肢を動かし始めるまで換気を続けます。ラットを抜管し、それが温暖化パッド上に置かケージに近い観察下に回復することができます。
17. ブプレノルフィンの管理（0.01から0.05 mg / kgを）皮下ラットにすぐに手術後および48時間のPOごとに8〜12時間を繰り返すST-動作可能（通常は5合計用量）。手術後24および48時間で、カルプロフェンまたはMeloxicane（4.4 mg / kgを）皮下（術前の投与量を含む3総投与量）を管理。
18. ラットがケージの周りを移動されるまで監視し続ける。呼吸困難の兆候では、再挿管と胸の再探索を行う。
    1. それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。
    2. 完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
19. スキン層の縫合糸は1週間手術後に削除します。

結果

この手順は、成体のルイスラット（n = 26）で行った。平均動作時間が15±3分であった。術中死亡はなかった。平均挿管時間 - 挿管装置にラットの配置から換気の確立には、 - 45±5秒であった。 24匹のラットは、術後の日（POD）POD 4 14. Oneラット開発呼吸困難を経て呼吸困難や出血の証拠のない操作から完全に回復を持っていたし、縦隔を探索するために再手術を受けた。ラットは、肺の虚脱ローブを有することが見出された。肺の再膨張後、縦隔は、陽圧換気下手術用接着剤で再密閉し、胸を再び閉じた。ラットは、それ以上の呼吸器の異常に完全にして回復した。一匹のラットは、原因不明のPOD 7日に死亡した。

ポスト胸腺摘出の縦隔は保持胸腺のために検査し、削除胸腺組織は、Vだったisually不足しているセクションを検査し、後に組織学的に検討した。剖検時に、胸部組織をヘマトキシリン​​ - エオシン（H＆E）染色によって調べた。サイトケラチンのための免疫組織化学（IHC）は、次いで胸腺組織の正常であるとして、特にH＆Eによる核染色のより高いレベルのセクションに焦点胸部リンパ節（LN）から残...

ディスカッション

完全な胸腺摘出のた​​めの本プロトコルは、合併症を最小限に抑えるように設計外科グルー·アプリケーションとの3層切開の閉鎖と低侵襲性アプローチを提供します。胸腺の完全な除去は、ナイーブT細胞の喪失によってサイトケラチンための縦隔リンパ系組織のIHC染色によって実証された。

、胸膜と胸腺の下葉の密接な関係に起因する心とそのほとんどが周術期の合併症によるものが20％、 - 成体ラット胸腺摘出の手順は、1.5に至るまでの死亡率によって複雑にされています主要な縦隔船舶^2-4。気管を穿刺する開放気管挿管技術は、6％の死亡率が^2を有している。非侵襲性の気管挿管の使用は、Naおよび共同研究者によって報告されている。しかし、生存率は⁵報告されていなかった。ここに記載されているように調製カニューレ挿管経皮的気管照明で一貫して成功した挿管のために声帯の明確な可視化を可能にします。いいえ高度な機器は^{、2,5- 8}他の報告された非侵襲的技術と異なって提示された方法、必要ありません。血管カテーテル針の末端を平滑化し、最後...

材料

図2<>/strong小動物麻酔システムを参照してください ハーバーチューブ高強度糸 コン

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2インチ 14 G 血管カテーテル
手術用顕微鏡	ツァイス
ウォーミングパッド
足センサー付きげっ歯類の心拍数と血中酸素化モニター	ハーバード装置	ST1 72-8010, ST1 72-8098 (ラットフットセンサー)
挿管装置(上部に金属棒が付いたプラスチック)
誘導ボックス、イソフルランタンク、O<サブ>2<サブ>タンクを備えた	ド装置	ST1 72-6420
付き小動物用人工呼吸器	CWE	12-02000 (人工呼吸器)および12-04000 (マウス/ラット用外部バルブアセンブリ)
光ファイバーイルミネーター	ドラン・ジェンナー	EEG 2823M
学生標準パターン鉗子	ファインサイエンスツール	91100-16
ファインストレートハサミ	ファインサイエンスツール	14060-09
鈍い先端シアはさみ	ファインサイエンスツール	14105-12
小さなアルムリトラクター(胸骨用)	ファインサイエンスツール	17008-07
鈍いグレーフ鉗子	ファインサイエンスツール	11050-10
ファインデュモン鉗子	ファインサイエンスツール	11254-20
5-0 マクソン縫合糸	エチコン
4-0 シルク縫合糸(カッティングニードル付き)	エチコン
6-0 ナイロン縫合	エチ
シアノアクリレート接着剤(エンダーミル)
潤滑ジェル	アコーンアニマル健康	NDC 17478-162-35