PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

サマリー

jove_content<この論文では、原子間力顕微鏡(AFM)を使用してタンパク質の光受容体の構造を調査する方法について説明しています>PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping(PF-QNM)は、マイカ表面上の無傷のタンパク質二量体を明らかにします。

要約

原子間力顕微鏡（AFM）は、表面の力応答を調べるために、カンチレバーに取り付けられたピラミッド型チップを使用しています。先端部の偏向は、画像地形に変換することができるレーザ及びセクタ化検出器での10〜pNで測定することができる。振幅変調または「タッピングモード」AFM画像を生成するためにその共振周波数で振動させながら表面に断続的に接触するプローブを含む。流体セルと組み合わせて使用​​し、タッピングモードAFMは、そのような生理学的に関連する条件の中のタンパク質などの生体高分子のイメージングを可能にします。タッピングモードAFMは、プローブと経験の浅いユーザーのために挑戦することができ、スキャンパラメータの多数の頻繁な調整を手動でチューニングする必要があります。高品質な画像を得るために、これらの調整は最も時間を消費である。

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は力responを測定することにより、画像を生成する試料との接触のすべてのポイントのためにそれ自体の曲線。 ScanAsystソフトウェアでは、PF-QNMを自動化することができる。このソフトウェアは、与えられたサンプルに対して自動的に設定点、駆動周波数、スキャン速度、ゲイン、およびその他の重要なスキャンパラメータを調整する。のみならず、このプロセスは壊れやすいプローブおよびサンプルの両方を保護しない、それは非常に高い解像度の画像を得るのに必要な時間を減少させる。 PF-QNMは、流体中のAFMイメージングのための互換性があります。したがって、それは生物学的に関連する材料を画像化するための広範な用途を有する。

本論文で提示した方法は、光合成Rから、細菌の赤色光感光体RpBphP3（P3）の画像を得るため、PF-QNMのアプリケーションについて説明しその明順応状態にあるオオウズラタケ 。この方法を使用して、個別のタンパク質P3の二量体および二量体の凝集体は、イメージング緩衝液の存在下で雲母表面上に観察されている。適切な表面の調整及び/又は溶液の濃度は、この方法に一般に、他の生物学的に関連する高分子および軟質材料に適用することができる。

概要

原子間力顕微鏡（AFM）は、1986年の発明（ 図1）ので、表面、薄膜、単分子の構造的および機械的特性を調査するために非常に重要なツールとなっている^。1-3液晶セルを使用して、方法が有している生体高分子の研究や生理学的に関連する環境下であっても、生きている細胞で特に有効になる。非接触モードAFMによる一般的に不適切であることから^4-10タッピングモードAFMは、伝統的に、表面に軟質材料または緩く結合した分子を画像化するために使用されている横方向の力による被害にカンチレバーことにより、試料に加わる^。11タッピング·モードAFMは、実質的に先端が断続的に表面に触れたのではなく、一定の接触することによってこれらの力を低減します。このモードでは、カンチレバーが表面に垂直なその共振周波数で又はその付近で振動される。同様に、AFMモードに連絡することを、トポグラフィーは肛門ですのxy（距離）の関数としてのzピエゾの動きをプロットすることによってyzed。

カンチレバーダイナミクスは時や共振の近くで非常に不安定になることができます。従って、それらは、「定常状態」状況の外側を自動化することは非常に挑戦的である。具体的には、これらのダイナミクスは、サンプルの特性および走査環境の両方に依存します。 （より）硬い表面に吸着柔らかい分子の場合、分子に適切にチューニングされたフィードバック·ループは、表....

プロトコル

1コンピュータおよび顕微鏡のセットアップ

1. N ₂気筒のバルブを開き、エアテーブルはフローティングとレベルされていることを確認するためにノブを調整します。
2. このために、コンピュータ、コントローラ、および光ファイバーライトをオンにします。
3. AFM / LFMモードにスキャナを設定し、AFMの頭の上にカメラを中心に。
4. オープンソフトウェア。実験の下で、実験グループの下に実験カテゴリ「ナノメカニカルプロパティ」、「定量的ナノメカニカルマッピング」を選択し、「流体中PeakForce QNM」。負荷実験と[設定]をクリックします。
5. ステージの表面を見るために、Z対物レンズを用いて、カメラをフォーカスします。ピエゾを粗いアップ/ダウン使用すると、約1mmのAFMヘッド開口部の表面の下にステージを移動します。

雲母表面の調製

1. きれいなサンプル支持ディスク（直径15mm、厚さ0.8mm）の表面上に接着剤のステッカーを押します。マイカV-4を押してください接着剤へのグレードのディスク（25×25×26ミリメートル）がしっかりと取り付けまで。
2. それは完全に無に気泡が付着しているの確保マイカ上に透明なテープ片をこする。均等に切断するように一方の側からマイカオフテープを引き出します。雲母が平らであることを保証するために、必要に応じて繰り....

結果

その明順応状態で感光体タンパク質の代表的なAFM画像を、P3は、 図3及び図4に示されている。新たに切断されたマイカ基板（ 図3A）は 、タンパク質吸着に適した、平坦面である。ネガティブコントロールとして、クリーン雲母の画像を収集することは、いくつかの理由のために重要である。まず、液晶セルは、清潔さを保証し、これまでの実験からの残留物質が表面を汚染しません。第二に、プローブの品質をテストする。プローブが汚れていたり、変形している場合、これはスジなどの画像に表示されたり、ノイズとしての地位を提示します。最後に、清浄な雲母画像は、プローブが適切に将来の実験のために調整することができる確認する。

表面被覆率（ 図3B、C）適切であれば、単一の感光体タンパク質二量体はPeakForce QNMを用いて観察することができる。矢印は個別の二量体を知らせる。アスタリスクは、タンパク質凝集体を意味する。ザ·タンパク質試料、堆積時間、及び撮像緩衝液のイオン強度の濃度.......

ディスカッション

AFMは、生理学的に関連する条件下でタンパク質および他の生物学的巨大分子を画像化する十分な能力、走査型プローブ顕微鏡法である。 X線結晶学およびNMRと比較して、AFMの一つの制限は、同じ解像度、特に横方向の解像度を達成することができないことである。任意の表面上の分子を分析するためにAFMを使用する場合、データが分析されるとき、分子の画像上表面とプローブの影響も考慮しなければならない。取得した画像上のプローブの影響のデコンボリューションは、適切なソフトウェアに完了することができる。実験的な結果と比較する理論モデルを開発することも非常に有用であることを証明することができます。

本論文では、細菌の赤色光感光体のAFM像は、RpBphP3（P3）は、（ 図3）提示されている。顕微鏡アセンブリおよびソフトウェアの動作の説明は、使用される特定の楽器のモデルに固有のものですが、マイカタンパク質試料調製手順は、一般的であり、任意のAFM実験に適用することができる。

このプロトコルのいくつかの重要なステップ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Tris-HCl	フィッシャーサイエンティフィック	O4997-100
NaCl	Acros Organics	7647-14-5
MgCl2	Acros Organics	7791-18-6
マルチモード 8 AFM	Bruker-Nano	492-008-011	Nanoscope V コントローラーと J スキャナーを装備
プローブ	Bruker-Nano	SNL-10、ScanAsyst-Fluid+
タッピングモード 流体セル	Bruker-Nano	MTFML
Mica V-4 Grade	SPI供給	1150503	25 x 25 x .26 mm
サンプルサポートディスク	nanoSurf	BT02236
ペトリ皿	Plasta-Medic, Inc.		100 mm x 15 mm
マイクロピペッター	デンビルサイエンティフィック	XL 3000i
RpBphP3			引用文献に従って調製
ナノスコープソフトウェア	Bruker-Nano
光ファイバー ライト	デジタル インスツルメンツ Inc.	F0-50
Pelco AFM ディスクグリッパー	Ted Pella Inc	1668	12 mm
1 ml シリンジ	McKesson	102-ST1C
Eppendorf チューブ	デンビル サイエンティフィック	C2171
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1	Schrodinger, LLC