PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

サマリー

jove_content<この論文では、原子間力顕微鏡(AFM)を使用してタンパク質の光受容体の構造を調査する方法について説明しています>PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping(PF-QNM)は、マイカ表面上の無傷のタンパク質二量体を明らかにします。

要約

原子間力顕微鏡（AFM）は、表面の力応答を調べるために、カンチレバーに取り付けられたピラミッド型チップを使用しています。先端部の偏向は、画像地形に変換することができるレーザ及びセクタ化検出器での10〜pNで測定することができる。振幅変調または「タッピングモード」AFM画像を生成するためにその共振周波数で振動させながら表面に断続的に接触するプローブを含む。流体セルと組み合わせて使用​​し、タッピングモードAFMは、そのような生理学的に関連する条件の中のタンパク質などの生体高分子のイメージングを可能にします。タッピングモードAFMは、プローブと経験の浅いユーザーのために挑戦することができ、スキャンパラメータの多数の頻繁な調整を手動でチューニングする必要があります。高品質な画像を得るために、これらの調整は最も時間を消費である。

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は力responを測定することにより、画像を生成する試料との接触のすべてのポイントのためにそれ自体の曲線。 ScanAsystソフトウェアでは、PF-QNMを自動化することができる。このソフトウェアは、与えられたサンプルに対して自動的に設定点、駆動周波数、スキャン速度、ゲイン、およびその他の重要なスキャンパラメータを調整する。のみならず、このプロセスは壊れやすいプローブおよびサンプルの両方を保護しない、それは非常に高い解像度の画像を得るのに必要な時間を減少させる。 PF-QNMは、流体中のAFMイメージングのための互換性があります。したがって、それは生物学的に関連する材料を画像化するための広範な用途を有する。

本論文で提示した方法は、光合成Rから、細菌の赤色光感光体RpBphP3（P3）の画像を得るため、PF-QNMのアプリケーションについて説明しその明順応状態にあるオオウズラタケ 。この方法を使用して、個別のタンパク質P3の二量体および二量体の凝集体は、イメージング緩衝液の存在下で雲母表面上に観察されている。適切な表面の調整及び/又は溶液の濃度は、この方法に一般に、他の生物学的に関連する高分子および軟質材料に適用することができる。

概要

原子間力顕微鏡（AFM）は、1986年の発明（ 図1）ので、表面、薄膜、単分子の構造的および機械的特性を調査するために非常に重要なツールとなっている^。1-3液晶セルを使用して、方法が有している生体高分子の研究や生理学的に関連する環境下であっても、生きている細胞で特に有効になる。非接触モードAFMによる一般的に不適切であることから^4-10タッピングモードAFMは、伝統的に、表面に軟質材料または緩く結合した分子を画像化するために使用されている横方向の力による被害にカンチレバーことにより、試料に加わる^。11タッピング·モードAFMは、実質的に先端が断続的に表面に触れたのではなく、一定の接触することによってこれらの力を低減します。このモードでは、カンチレバーが表面に垂直なその共振周波数で又はその付近で振動される。同様に、AFMモードに連絡することを、トポグラフィーは肛門ですのxy（距離）の関数としてのzピエゾの動きをプロットすることによってyzed。

カンチレバーダイナミクスは時や共振の近くで非常に不安定になることができます。従って、それらは、「定常状態」状況の外側を自動化することは非常に挑戦的である。具体的には、これらのダイナミクスは、サンプルの特性および走査環境の両方に依存します。 （より）硬い表面に吸着柔らかい分子の場合、分子に適切にチューニングされたフィードバック·ループは、表面のための帰還発振につながる可能性があります。さらに流体中の動作は、カンチレバーのチューニングが複雑になる。温度の変化又は流体レベルが一定の設定点の再調整、ゲイン、および他の撮像パラメータを必要とする。これらの調整は非常に時間がかかり、ユーザにとって困難である傾向がある。

ピークフォース定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は、タッピングモードAFMのように、断続的にサンプル（ 図2）と接触させることにより横方向の相互作用を避けることができます^{。12-15 <}/ SUP>しかし、PF-QNMは、非共振モードとタッピングモードAFMよりもはるかに低い周波数で動作します。これは、タッピングモードAFM、流体の存在によって悪化特にチューニングの課題を排除します。 PF-QNMで、画像は、接点の全ての点において力応答曲線を取ることによって収集される。 ScanAsystソフトウェアの追加により、スキャンパラメータの¹⁵調整が自動化することができ、高解像度の画像であっても、経験の浅いユーザーがほんの数分で得られる。ユーザはAFM​​に慣れになると、自動化されたパラメータのいずれかまたは全てが、画像品質を手動で微調整するために実験者を許可し、いつでも無効にすることができる。創業以来、PF-QNMは。分子下レベルでのバクテリオロドプシン、膜タンパク質、および他の天然タンパク質をマッピングするために適用されたバクテリオロドプシンのために^16-18、タンパク質の柔軟性とX線結晶構造の間の直接的な相関関係があります^。12 PF -qnMは、高解像度の生細胞を研究するために利用されている^。19,20さらに、PF-QNMデータは、細胞の整合性と機能に重要である赤血球膜内の構造と力学の間の重要な接続を明らかにしています^。21

私たちは^、22 bacteriophytochromes（BphPs）と呼ばれる赤色光の光受容体の構造を調べるために^AFM、23を含む、走査型プローブ顕微鏡（SPM）の方法を使用している^。24,25彼らが共有シグナリングエフェクターモジュールなどにに連結された光検出モジュールから構成されヒスチジンキナーゼ（HK）として^。26光センシングモジュールは、一般的に構造変化のシグナル伝達エフェクターモジュールに達し、全体のタンパク質の全体的な変革につながる一連の光子を吸収すると構造変化を受け、ビリン発色団が含まれていますこの変換に基づく^24,27-29、二つの異なる光吸収のあるBphPs、赤と遠赤色光吸収状態のtatesは、​​Pr及びPfrのと表記。 PrはほとんどBphPsため、熱的に安定な、暗順応状態である。のPr /のPfR光変換の分子基盤は完全に起因するこれらのタンパク質の限定された構造の知識に理解されていない^28。 Dから一つの構造を除いてデュランスは 、これらのタンパク質の³⁰すべての公開X線結晶構造は、暗順応状態にあり、エフェクタードメインを欠いている。無傷BphPs効果的核磁気共鳴（NMR）によって研究することが大きすぎると、X線結晶学のために（特に、明順応状態で）、その完全な形で結晶化することが困難なことで有名である。 BphPsは最近、赤外蛍光タンパク質マーカー（IFPの）ように操作されている。これらのタンパク質の³¹構造解析が有効IFP設計で支援を促進することができます^。32-36

この記事の焦点は、手順を提示することであるPF-QNMを介して液体セルAFMを用いBphPsの撮影。この方法は、光合成細菌RからbacteriophytochromeのRpBphP3（P3）の明順応状態の研究によって証明されるオオウズラタケ 。ここに提示AFM手順は、タンパク質の画像化のための便利で簡単な方法、ならびに他の生物学的巨大分子である。この方法では、個別の分子の構造の詳細は、上位理系実験セッションのような短時間で収集することができる。断面積を測定し、さらに次元解析を完了を通して、実験データは、有用な計算モデルと比較することができる^。37-42

プロトコル

1コンピュータおよび顕微鏡のセットアップ

1. N ₂気筒のバルブを開き、エアテーブルはフローティングとレベルされていることを確認するためにノブを調整します。
2. このために、コンピュータ、コントローラ、および光ファイバーライトをオンにします。
3. AFM / LFMモードにスキャナを設定し、AFMの頭の上にカメラを中心に。
4. オープンソフトウェア。実験の下で、実験グループの下に実験カテゴリ「ナノメカニカルプロパティ」、「定量的ナノメカニカルマッピング」を選択し、「流体中PeakForce QNM」。負荷実験と[設定]をクリックします。
5. ステージの表面を見るために、Z対物レンズを用いて、カメラをフォーカスします。ピエゾを粗いアップ/ダウン使用すると、約1mmのAFMヘッド開口部の表面の下にステージを移動します。

雲母表面の調製

1. きれいなサンプル支持ディスク（直径15mm、厚さ0.8mm）の表面上に接着剤のステッカーを押します。マイカV-4を押してください接着剤へのグレードのディスク（25×25×26ミリメートル）がしっかりと取り付けまで。
2. それは完全に無に気泡が付着しているの確保マイカ上に透明なテープ片をこする。均等に切断するように一方の側からマイカオフテープを引き出します。雲母が平らであることを保証するために、必要に応じて繰り返します。
3. グリップ支持ディスク、円形ピンセット（ディスクグリッパー）一対のクリーンアップマイカ側、およびスキャナの上に置きます。マイカは、AFMヘッド開口のレベル以下である必要があります。

雲母表面の3流体セル組立·イメージング

1. 流体セル、O-リング、シリンジアダプタ、ホースアダプター、および100％エタノールにおける吐出ホースをすすぐ。 DI水中で流体セルをすすぐ。すべての部分が空気を完全に乾燥させます。
2. きれいな流体セルのポートにホースアダプターを押し込みます。静かに平らな頭ピンセットを用いて流体セルの中心くぼみにOリングを押してください。
3. プローブ保持クリップを軽く春を押して、GROOVから離れてそれを回す先端の電子。
4. フラット頭ピンセットでアウェイチップからの長い先端に探針をつかみ。セルの中心に面した先端の溝にプローブを配置します。春を押して（ 図1B）、それを確保するために、プローブを介して保持クリップを調整します。
5. それは完全に（ 図1C）に後退されていることを確認するために、AFMのクランプを確認してください。
6. 流体セル、Oリングを置き、マイカサンプルの上に、下に向けてプローブ。流体セルは、AFMのスタッド上に休息できるようにします。ステージ上で流体セルを安定させるためにクランプを下げます。目視検査がしっかりと支持円板と流体セルとの間で圧縮Oリングを示すまで、顕微鏡でのダウンスイッチを押します。
7. モニターを見ながら、画面上の流体セルの上部を可視化するための粗調整ノブを当てる。
8. X / Y調整ノブとZ対物レンズを用いて先端の鮮明な画像があるまで顕微鏡を移動します。先端はAPPますメタリック、黄金の三角形のような耳。顕微鏡でのダウンピエゾレバーを使用して試料表面に近い先端を移動します。先端の反射に焦点を当てています。その反射の関係で実際のカンチレバーのないことを確認してください。この段階では、それらが密接に合致するが、完全にオーバーラップしないべきである。
9. 無菌1mlシリンジにシリンジアダプタを取り付けます。シリンジアダプタに噴射ホースの一端を取り付け、緩衝液容器内のホースのもう一方の端を置きます。完全にシリンジのプランジャーを拡張します。
10. 流体セル上のホースアダプターにホースを取り付けます。流体が完全に中央チャンバーを満たすまで、慎重プランジャーを押してください。気泡が存在しない保証するためにセルをチェックします。顕微鏡上に流体セルからこぼれる流体が存在しないか確認してください。隆起した固体支持体上に注射器を置きます。
11. 画面上のレーザー（拡散赤い点）を見つけるために、カメラフィード、X / Yは、翻訳のノブを使用してください。レーザーMOVEMの使い方ENTコントロールノブは、先端にレーザーを移動します。
12. 顕微鏡上に表示される和信号が最大になるまで細かく（ - 6値= 4）、レーザーとミラーを調整します。
13. （±0.1）を限りなくゼロに近づけて顕微鏡に表示されて垂直方向と水平方向の偏向を低下させるために左後方側のノブやスキャンヘッドの左上側を使用して象限ダイオードの角度を調整します。
14. ソフトウェアでは、取得のオプションを選択します。最低でも、選択の高さ（トレースとリトレース）、ピーク力誤差、および変形。他のオプションはユーザ依存し、実験者が所望する特定の情報に基づいて調整することができる。
15. 各取得ウィンドウにおけるRT飛行機フィットのための「行」を選択します。高さの窓でのOT飛行機フィットのための "none"を選択します。まだ行っていない場合は、ゼロにXとYオフセットと走査角度を設定します。
16. 1ヘルツ、256行あたりのサンプル、ScanAsyst自動制御にスキャンレートを設定してください個人、そしてオフにScanAsystオートZ限界に。 500nmのZ制限を変更します。 1μmのスキャンサイズを設定します。
17. 従事クリックしてください。この時点で、先端が表面に近づく。先端が近づいている間に、画面の左下隅にZピエゾ電圧変化を観察する。先端が範囲外になった場合、チップと再アプローチを撤回。これが失敗した場合、先端が成功したアプローチを有するために変更する必要があります。先端が係合されると、ラインがイメージを構成します取得の各ウィンドウに表示されるように開始します。
18. 1×1μmとマイカの画像を取り、雲母表面がきれいで平らであることを保証するために、ゆっくりと拡大表示します。が表示されたら、画像を保存するための連続キャプチャをクリックします。ズームインし、必要に応じて表面を動き回る。

4。タンパク質の沈着とイメージングのための試料の調製

1. 精製されたタンパク質試料^38を入手し、氷上に保つ。冷凍庫で保存する場合は、上のサンプルを解凍する5分間氷。
2. 冷蔵イメージング緩衝液を用いて溶解0.0010ミリグラム/にタンパク質を希釈する。ここで使用される画像バッファは15 mMトリス塩酸（pH = 8.0）、150mMのNaCl、および15mMのMgCl ₂である。
3. 冷蔵イメージング緩衝液で4室（100×15 mm）のペトリ皿を埋める。溶液の少なくとも5mlで各チャンバーを埋める。静かにピペットに取り付けられた先端を希釈したタンパク質溶液を混合する。
4. すでに準備雲母の表面に希釈したタンパク質溶液200μlを適用します。 30秒後に、円形ピンセット（ディスクグリッパー）を有するタンパク質/雲母表面を拾う。実験台にサンプルを平行に保持します。
5. 試料を保持しながら、直ちに試料をペトリ皿の流域に平行であることを保証しながらペトリ皿（ ステップ4.2）の第一象限に含まれる緩衝液中に試料を浸す。 1秒後、サンプルを削除します。
6. 流域にサンプルと平行に保持するために継続ペトリ皿の、残りの3つの象限のためのステップ4.5を繰り返します。
7. 余分な水分を吸収し、顕微鏡のステージ上にディスクを転送するために乾いたほこりのない布でディスクを置きます。布で実際の表面に触れないでください。サンプルを乾燥させないようにしてください。
8. 3.16 -を繰り返して、3.6を繰り返します 。

マイカ上の5。イメージングタンパク質

1. 画面の左側にあるチェック·パラメータ·ボックスをクリックしてください。ばねの大きさと先端半径は、使用されているチップに基づいて設定されるべきである。
2. 従事クリックしてください。同様にマイカ撮像処理（ ステップ3.17）に、先端的なアプローチとしてのzピエゾウィンドウを観察します。
3. イメージスキャナの少なくとも2つの連続パスのための同じ領域を許可します。収集された各画像を保存するための連続キャプチャをクリックします。
4. 新しい領域にスキャナを移動、および/または必要に応じて画像サイズを変更します。
5. 自動化されたソフトウェアは、調整が終了した後特定の画像サイズのスキャンパラメータは、ソフトウェアをオフにします。
6. 手動で微調整するために画像の焦点を走査速度、zは限界、行数、および電圧を調整する。画像の焦点が合って遠くなった場合は、元の開始位置を返すように背面のソフトウェアをオンにします。タンパク質上で拡大しながら画像の解像度を高めるために、走査速度を減少させ、比例ラインの数を増やす。
7. 実験後、100％エタノールによる液細胞をきれいにし、DI H ₂ Oですすぎ液体セルが完全に乾燥することができます。
8. 生データ画像を処理するためのデータ·ソフトウェアを開きます。まず、平坦化アイコンをクリックして画像を平坦。ゼロ^番目の順序を選択して実行]をクリックします。画像によっては、平面適合は適切に平坦な画像を得ることが必要であり得る。この場合、平面フィットアイコンを選択し、カーソルを使用して、画像の平坦な領域の平面を描く。実行]をクリックします。必要に応じて繰り返し
9. SELタンパク質の寸法を測定するための電気ショック療法の断面]タブをクリックします。カーソルで線を引く、分析する分子または領域の上に移動します。複数のエリアについて、この手順を繰り返し、ソフトウェアがオーバーレイを生成します。画像やその他のソフトウェアおよび描画プログラムに互換性のある形式で画像を生成するために使用されるデータをエクスポートします。

結果

その明順応状態で感光体タンパク質の代表的なAFM画像を、P3は、 図3及び図4に示されている。新たに切断されたマイカ基板（ 図3A）は 、タンパク質吸着に適した、平坦面である。ネガティブコントロールとして、クリーン雲母の画像を収集することは、いくつかの理由のために重要である。まず、液晶セルは、清潔さを保証し、これまでの実験からの残留物質が表面を汚染しません。第二に、プローブの品質をテストする。プローブが汚れていたり、変形している場合、これはスジなどの画像に表示されたり、ノイズとしての地位を提示します。最後に、清浄な雲母画像は、プローブが適切に将来の実験のために調整することができる確認する。

表面被覆率（ 図3B、C）適切であれば、単一の感光体タンパク質二量体はPeakForce QNMを用いて観察することができる。矢印は個別の二量体を知らせる。アスタリスクは、タンパク質凝集体を意味する。ザ·タンパク質試料、堆積時間、及び撮像緩衝液のイオン強度の濃度...

ディスカッション

AFMは、生理学的に関連する条件下でタンパク質および他の生物学的巨大分子を画像化する十分な能力、走査型プローブ顕微鏡法である。 X線結晶学およびNMRと比較して、AFMの一つの制限は、同じ解像度、特に横方向の解像度を達成することができないことである。任意の表面上の分子を分析するためにAFMを使用する場合、データが分析されるとき、分子の画像上表面とプローブの影響も考慮しなければならない。取得した画像上のプローブの影響のデコンボリューションは、適切なソフトウェアに完了することができる。実験的な結果と比較する理論モデルを開発することも非常に有用であることを証明することができます。

本論文では、細菌の赤色光感光体のAFM像は、RpBphP3（P3）は、（ 図3）提示されている。顕微鏡アセンブリおよびソフトウェアの動作の説明は、使用される特定の楽器のモデルに固有のものですが、マイカタンパク質試料調製手順は、一般的であり、任意のAFM実験に適用することができる。

このプロトコルのいくつかの重要なステップ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Tris-HCl	フィッシャーサイエンティフィック	O4997-100
NaCl	Acros Organics	7647-14-5
MgCl2	Acros Organics	7791-18-6
マルチモード 8 AFM	Bruker-Nano	492-008-011	Nanoscope V コントローラーと J スキャナーを装備
プローブ	Bruker-Nano	SNL-10、ScanAsyst-Fluid+
タッピングモード 流体セル	Bruker-Nano	MTFML
Mica V-4 Grade	SPI供給	1150503	25 x 25 x .26 mm
サンプルサポートディスク	nanoSurf	BT02236
ペトリ皿	Plasta-Medic, Inc.		100 mm x 15 mm
マイクロピペッター	デンビルサイエンティフィック	XL 3000i
RpBphP3			引用文献に従って調製
ナノスコープソフトウェア	Bruker-Nano
光ファイバー ライト	デジタル インスツルメンツ Inc.	F0-50
Pelco AFM ディスクグリッパー	Ted Pella Inc	1668	12 mm
1 ml シリンジ	McKesson	102-ST1C
Eppendorf チューブ	デンビル サイエンティフィック	C2171
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1	Schrodinger, LLC