単離とマウス大動脈の切除。心血管疾患の研究で多彩なテクニック

Summary

大動脈の病理は、重篤な罹患率と死亡率につながる可能性があるため、疾患の進行と潜在的な治療法の研究が必要です。ここでは、研究者が心血管疾患の調査を支援するために、マウス大動脈を分離して切除するプロトコルを紹介します。

Abstract

心血管疾患は、心臓および/または血管の疾患を表す広義の用語です。酸素化された血液を体に供給する主要な血管は大動脈です。大動脈は、アテローム性動脈硬化症や動脈瘤などの疾患に罹患する可能性があります。これらの疾患を調査する研究者は、大動脈を直接観察して疾患の進行を特徴付け、潜在的な治療法の有効性を評価することから利益を得るでしょう。このプロトコルの目標は、心血管疾患を研究する研究者を支援するために、大動脈の適切な分離と切除を説明することです。大動脈の分離と切除により、研究者は肉眼的な形態学的変化だけでなく、必要に応じて組織学的変化を見るために組織を保存して染色することもできます。大動脈は、タンパク質や遺伝子の発現を評価するための分子研究に利用され、目的の標的や作用機序を発見することができます。この手法は、技術とコストに固有の制限があるため、イメージングモダリティよりも優れています。さらに、新たに単離され切除された大動脈から一次単離された細胞により、研究者はin situおよびin vitroアッセイをさらに行うことができます。大動脈の分離と切除には、動物を犠牲にしなければならないという制限がありますが、この場合、大動脈疾患の研究で最も用途の広い技術であるため、利点は害を上回ります。

Introduction

大動脈は、酸素化された血液及び身体の他の同様の部分とボディを供給する血管機能において重要な役割を果たしている疾患に感受性である。一般的な大動脈疾患は、食事、喫煙と座りがちな生活¹を含む、遺伝的要因と環境要因の結果であるアテローム性動脈硬化症や動脈瘤が含まれる。アテローム性動脈硬化症は、一般的に、慢性高脂血症²の患者で見つかった大動脈壁にカルシウムおよび脂質ベースのプラークの沈着である。動脈瘤は、最終的に^3を破裂させる可能性があり拡径続い大動脈血管壁の菲薄化の構造成分の分解によって特徴付けられる。

動物モデルは、病気や潜在的な治療法の有効性のメカニズムを研究するために使用される重要なツールである。心血管の研究に使用される一般的な動物モデルは、特に、血管および代謝障害を調査研究そのようなアポリポタンパク質E遺伝子ノックアウトおよび低密度リポタンパク質受容体遺伝子ノックアウトマウス⁴などの脂質レベルを変化させる遺伝的に改変されたマウスを含む。疾患及び治療の有効性の機構を評価するための方法の大部分は大動脈の単離および切除を含むであろう。

大動脈は、ローカライズされ単離されると、形態学的分析は、このような動脈瘤の存在、典型的には、直径⁵で50％以上の増加として定義されるように、決定することができる。 in situ分析必要が完了したら、大動脈を、さらなる分析のために切り出すことができる。切除された大動脈は、タンパク質および/または遺伝子発現アッセイまたは分子的研究を行うために急速冷凍することができ、4％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、後で、包埋し、組織学的分析のために染色した。大動脈の組織学的分析は、そのような構造劣化、プラーク形成、および白血球の浸潤として大動脈疾患の共通の特徴を示すことができる ^{6,7。さらに、切除された大動脈は、その後in vitro試験7のさまざまな目的で使用することができ、内皮細胞および平滑筋細胞を含む初代細胞株を単離することができる。}

現在、大動脈疾患のこの深いキャラクタリゼーションを提供するだけでなく、さらなる心臓血管疾患を研究するためのツールを研究者に提供するための他の方法はない。例えば、磁気共鳴画像のような画像診断法は、コンピュータ断層撮影および超音波検査は、形態学的に大動脈を評価するための最も近い方法であるが、これは、小動物では困難であり、適切な技術と装置を得ることが⁸に高価である。不死化細胞株は、しかしながら、これらの細胞の人工的な性質は、細胞のライフサイクルおよびアポトーシス⁹への影響を研究に制限されている疾患および治療 ​​の有効性の潜在的なメカニズムを調査するために購入することができる。

の全体的な目標この原稿は、心血管疾患の調査にマウス大動脈の無菌分離および切除を実証することである。

Protocol

全ての動物手順は、シンシナティ大学の制度的動物実験委員会の承認を得て、および国立衛生研究所（NIH公開番号85から23から実験動物の管理と使用に関する指針に従って行った）1996年改訂。

1.マウスの準備

1. 麻酔薬のsupratherapeutic線量に動物を暴露することにより安楽死させる、イソフルランは効果に吸入さ。侵害刺激としてつま先のピンチを経由して第一の安楽死を確認してください。安楽死、ダイヤフラム切断の二の方法は、今後のステップで発生します。代替方法が安楽死が得られる付与に使用することができる。
2. Sanitizie水分のポイントに70％エタノールで、最初のカットが行われる腹部に沿って毛皮を噴霧することにより、マウスの外面は、そのように毛皮は、エタノールで濡れていると緩ん/ドライ毛は入力しないでください地域。
3. シュール上でマウスをレイアウト上下の付属と仰臥位での外科ボードは、外側に延長した。
4. サージカルテープを使用してボードへの安全な付属。

ハートと大動脈の2の分離

1. マウスの適切な位置決めした後、検索し、胸骨の剣状突起のすぐ下腹部の皮膚を隔離するために鉗子を使用しています。
2. まっすぐに肌を持ち上げて緊張を作成し、腹膜や胸腔の劣る部分の優れた部分を露出させ、表面的な皮膚を除去するためにハサミを使用しています。
3. 剣状突起を持ち上げると肋骨下の余白に沿ってプロセスのすぐ下の横切開を行うことで、腹腔を入力します。
4. 心臓や大きな血管をlacerateしないように注意してくださいという、横隔膜を経由、胸腔内にアップ解剖。
5. 胸郭の前方部分を除去するためのステップ2.3頭側で行われた横方向の切開を拡張します。もし必要に応じて、鈍的切開を使用して前胸壁から心臓を解放。
6. 材料を吸収するために滅菌ガーゼを使用して余分な血液や体液の胸腔を清掃してください。エリアをより見やすくしたら、より良い心と大動脈を露出させ、肺を削除します。

ハートと大動脈の3灌流

注：このステップにとても直前に行い、心穿刺によって血液を入手します。

1. 無菌の氷冷1×リン酸緩衝溶液（PBS）10mlで10 1ccシリンジに充填し、シリンジに25ゲージの針を取り付ける。
2. 静かに心臓の左心室に針を挿入します。
3. 灌流からの圧力の蓄積を軽減するために右心房をカット。 3分 - 2の上にマウスに注射器の内容物を灌流。
4. 灌流液を吸収するために右心房の開口部で滅菌ガーゼを使用してください。

大動脈の4.絶縁と切除

1. ペーが完了するとrfusion、胸腔内の視野を曇り、残りの流体を吸収するために滅菌ガーゼを使用しています。
2. 恥骨の領域に切開を延長、腹壁を通して尾側に切断することによって胃腸の内容を公開します。二国間釘付けまたは削除することができ、皮膚のフラップを作成するために下肢に向けてさらなる切開を拡張します。
3. より良い大動脈を可視化するために、肝臓、膵臓、胃、脾臓、および腸のローブを削除します。大動脈は、腎動脈の枝で表面的であるように、腎周囲領域の近く解剖ときは注意してください。
   注：正確な中で、このステップを実行し、消化管の汚染の傾向を増加させ、細菌に富んでいるような方法を入学。
4. 1×PBSで領域をすすぎ、滅菌ガーゼで吸収して、すべての流体を除去。
5. 無菌microscissorsとマイクロピンセットを使用して、背骨の背側と腹側に食道から大動脈を分離する。それは、鈍的切開し、このための解剖顕微鏡を利用した使用するのが最適です。
   注：大動脈を単離する際に、腸骨分岐部に尾開始し、尾側に解剖頸動脈と腕頭動脈の頭側頭側の洗浄とキャビティの背側表面から大動脈を分離移動したり、開始します。どちらの方法が適切であると研究者の快適性に任されています。
6. 大動脈壁の一部を除去しないように注意してくださいという細かいmicroscissorsを使用して血管周囲の脂肪組織を削除します。これは、大動脈平滑筋細胞を培養する際に、線維芽細胞の混入の可能性を最小限に抑えることが不可欠である。

Results

手続きが完了すると、まだ添付腎動脈と胸部と腹部の空洞（ 図1A）に下降、心から発信無傷で大動脈があるでしょう。ここからは、大動脈は、腹部大動脈瘤（ 図1Bおよび1C）の研究での診断である形態学的変化を定量化するために、その場で画像化することができる。その後、大動脈を取り出し、固定し、組織学的変化を見るために染色することができる。大動脈の一般的な共通染色はヘマトキシリンおよびエオシン染色（ 図2Aおよび2B）である。加えて、大動脈の構造的完全性を定性的エラスチンバンド（ 図2C及び2D）を見てVerhoffバンGeison染色を用いて定量することができる。代わりに、組織学的分析を得るための、点滅することが研究者は、その後のタンパク質とリボ核酸expreための大動脈を凍結するssion。研究者のための最後のオプションは、初代細胞分離を得るために、大動脈を使用することである。これらの細胞は、...

Discussion

大動脈疾患は重大な全身性病変を引き起こし、重症の場合は死に至る可能性があります。現在、治療の選択肢は限られているため、この分野での継続的な研究が必要です¹⁰.マウスモデルは、疾患の進行と潜在的な治療選択肢をさらに研究するのに理想的です⁴。したがって、この原稿で説明されている方法を無事に完了すると、研究者は疾患の進行と薬効を測定するためのツールを得ることができます。

この手法は、結果を最適化するためにいくつかの方法で変更できます。手術用ルーペまたは解剖顕微鏡を使用すると、マウスの解剖学的構造と血管系の詳細を視覚化したり、大動脈から周囲の脂肪組織を除去したりするのに役立ちます。さらに、特定の作業に専用の手術器具を使用すると、ツールの寿命を延ばすことができます。たとえば、皮膚を切るにはハサミを使用し、肋骨を切るにはハサミを別々に使用するのが理想的です。心臓を灌流するときは、穴が残る大きなゲージの針とは対照的に、穿刺の周囲で組織を閉じることができるため、小さなゲージの針を使用することが好ましいです。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
イソフルラン	Med-Vet International	#RXISO-250
70%エタノール	フィッシャー	07-678-001
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
サージカルテープ	3M	1527-1
滅菌ガーゼ	Dukal Corporations	1312
25ゲージ針	BD
10mlシリンジ	BD	309604