ここでは、グルタチオンの還元型によって誘発されるヒドラの摂食反応を定量化するための簡単なアッセイについて説明します。このアッセイは、触手の頂端とヒドラの口との間の距離を測定することに依存しています。
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この記事について
サマリー
要約
Hydraは、獲物を捕らえるための神経系と化学感覚を持つ最も原始的な生物の一つです。獲物の生物の動きは、ヒドラからの線虫嚢胞と呼ばれる刺すような細胞の機械感覚放電を引き起こし、それが獲物に挿入されます。ヒドラの摂食反応は、触手を丸めて獲物を口に近づけ、口を開けて獲物を飲み込むことを含み、負傷した獲物から放出された液体に存在するGSHによって引き起こされます。これまで知られていなかったヒドラの摂食応答の分子メカニズムを解明するためには、摂食応答を測定するためのアッセイを確立する必要があります。ここでは、触手の頂端とヒドラの口との間の距離を測定し、GSHの添加前後のその距離の比を決定する摂食応答の定量化の簡単な方法について説明します。この比率は、相対的な触手の広がりと呼ばれ、摂食反応の尺度を与えることがわかりました。このアッセイは、飢餓状態のヒドラが毎日給餌されたヒドラと比較して強化された摂食反応を示す飢餓モデルを使用して検証されました。
概要
Hydraは、獲物を捕獲するための神経系と低分子グルタチオン(GSH)を検出するための化学感覚を持つ最も原始的な生物です。線虫、甲殻類、昆虫の幼虫、オタマジャクシ、孵化したばかりの魚など、さまざまな動物を食べます1。これらの獲物生物の動きは、ヒドラからネマトシストと呼ばれる刺すようなカプセルの機械感覚的な放出を引き起こし、それが獲物2に挿入されます。負傷した獲物から放出された液体中に存在するGSHは、その後、触手を丸めて獲物を口に近づけ、口を開け、その結果として獲物を飲み込むなど、ヒドラの摂食反応を活性化します。ドーパミン3、グルタミン酸4、GABA、グリシン5、NMDA受容体6、アラトトロピン7などの複数の分子が、ヒドラの摂食反応に関与していることが示されています。また、GSHによって誘発される化学感覚反応は、飢餓状態のヒドラが摂食反応の増強を示すような動物の摂食状態によって調節されることも示されています1。このようなGSH感度の増加は、飢餓下ではヒドラがより高い感度で獲物を見つける必要があるため、生物学的に関連しています。
GSHによって誘発される摂食反応は顕微鏡下で明確に観察することができますが、一般的に摂食反応の観察を測定するために使用される方法は非定量的です。ほとんどの場合、ヒドラの口が開いたままの時間が摂食反応の尺度として採用されました8,9。一方、別のケースでは、定量は、摂食反応を示す集団からのヒドラの数に基づいていました10。しかし、ヒドラポリープの口の開口時間を観察するのは面倒で、観察中の口の向きの方向などの制御不能なパラメータによって誘発される変動の影響を受けます。同様に、摂食反応は定量的パラメータであるため、集団ベースのアプローチは、個々の観察者の意見または観察バイアスによって引き起こされる変動/エラーの影響を受けます。これらの問題を回避するために、ヒドラ(Hydra vulgaris Ind-Pune11)の摂食反応を相対的に定量化する方法を開発しました。これは、触手の頂端がヒドラポリープの口からの距離に基づいています。
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プロトコル
摂食応答1.ハイドラ文化と測定
- アルテミア毎日それらを供給し、中に含まれる培地（1mMのTris-HCl緩衝液、pHは7.6、1のNaCl、1mMのCaCl 2、0.1mMのKClと0.1mMのMgSO 4）し、それらを保持することにより、培養中ヒドラポリープを維持12時間明、12時間暗サイクルの下で18℃、ガラスボウル12前述したように。
- 摂食応答を測定するために、一つは24ウェルプレートの1ウェルに5~6触手を有するヒドラポリープ成熟移す。それを傾けることによってウェルから残留培地を除去した後、すぐに新鮮な培地500μlを加える。
- ヒドラ培地中の9100μMのグルタチオン溶液を調製する。グルタチオン溶液は酸化されやすいので、常に各実験のために新たに調製したグルタチオン溶液を使用する。
- 画像記録のための条項を持つ顕微鏡のイメージングプラットフォームにプレートを転送します。行動oは、そのような暗い背景を使用してくださいfはヒドラポリープは明らかに対照的な背景に画像化することができる。
- 部屋は観察し、変動強度、空気流及び騒音の光からヒドラフリーの挙動を撮像するために使用される。でも、グルタチオンが存在しない場合に - このような妨害はまたヒドラポリープは触手の収縮を示すことが原因となることがあります。
- ポリープは5分間リラックスすることができます。
- ポリープは行動が明確に画像化することができることをよくかかるの中心領域に沿って配置されていることを確認してください。ポリープはウェルの端にある場合には、ピペットを用いて培地をフラッシュすることによって、中心に持ってきて、もう一度それがリラックスすることができます。
- リラックスした状態でヒドラのイメージをキャプチャします。これは、ゼロ時点で観察されます。
- 迅速にウェル内に、3μMの最終濃度に到達するために9μMグルタチオン溶液を加える。実験の目的及びヒドラで示される反応に応じて、グルタチオンおよびチュウの異なる濃度範囲を試験必要とされる適切な濃度のSeを示す。
- すぐに4-5分ごとに15〜30秒後にグルタチオン溶液とキャプチャ画像を追加した後、タイマーを起動します。タイムラプスイメージング中倍率設定を変更しないでください。
- 穏やかにウェル内の動物の位置を最小限に顕微鏡の視野内に乱されることを均一な流れとグルタチオン溶液を加える。ポリープは、グルタチオン溶液を添加した後に広範囲に移動する場合は、画像キャプチャのための視野内にポリープをもたらすために非常に穏やかにプレートを移動させる。
- 対照実験では、同一の他の全てのパラメータを保持しながら媒体グルタチオンを欠く使用。
- 午後1時前に摂食応答の程度に概日リズムの可能性のある影響を避けるために - その日の前半に上記の実験の手順をすべて実行してください。
- GNU画像処理プログラム（GIMP）を使用して撮影した画像のそれぞれを開きます。 触手とhypostomeのそれぞれの先端部間の距離を決定するために測定>メニュー>ツールから利用できる「測定」ツールを使用します。口の開口部は、画像のいずれにおいても観察されている場合は、開いた口の中心と触手の先端部間の距離を決定する。触手の広がりとしてこの距離を参照してください。
- グルタチオンの暴露の前後に各ポリープの平均触手スプレッドを計算します。その後の時点の各々でそのまでゼロ時点での平均触手スプレッドの比を計算する。この比は、相対的な触手の広がりと呼ぶことにする。
- 少なくとも20ポリープのための測定を繰り返します。
2.メソッドバリデーション使用飢餓モデル
- 飢餓のために、別のガラスボウルに少数のヒドラポリープを転送し、5日間のためにそれらを餌を与えないでください。同じようなサイズのボウルにアルテミアを毎日、数ポリープの対照群を養う。実験の両方からメディアを変更して培地中の真菌の増殖を避けるために、毎日ボウル。
- 実験の日に、1時間アルテミアとヒドラの対照群を供給し、メディアからすべての食べ残しや死者アルテミアを除去した後、その後の実験のためにこれらのヒドラを使用しています。
- 飢餓および制御ヒドラポリープのそれぞれの測定値を交互による観察時に任意のバイアスを避けるために、以前のステップ1に記載の方法により対照群と比較して、ヒドラ飢餓ヒドラの摂食応答を測定する。
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結果
グルタチオンは、ヒドラが獲物を飲み込むの目的のために、口の方に触手のカールを呈するようになります。触手のようなカールが近いhypostomeに触手の先端両端をもたらします。これは触手の広がりの減少、または触手とhypostome（ 図1）の先端部間の直線距離が生じる。相対触手広がり、または平均触手の比率は、前に広がり、グルタチオンを添加した後、時間の経過とともに減少し、複数のポリープにわたって平均。触手相対スプレッドは、グルタチオンを欠く培地を添加した後、しかし、一時的にのみ低下させ、約分（ 図2）の単位の値となる。飢餓は、グルタチオン1,13によって誘導された摂食行動の増強を引き起こすことが知られている。ここで説明する摂食行動を測定する方法は、飢餓モデルによって検証した。触手は、グルタチオンたsignificantlを追加した後、1分を広めるyは満腹基（σp = 1×等しい分散を有する2 t検定を適用することにより、10 -16）（ 図3）と比較して、飢餓グループの下位。 ...
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ディスカッション
ヒドラに摂食行動することは後生動物の中で最も祖先の化学感覚システムのいずれかを表します。刺胞アシスト獲物捕獲後にリリース甲殻流体中のGSHの存在はずっと前に1を検出されたが、GSHRタンパク質も推定されるコード遺伝子/ sのどちらも、ヒドラから現在までに特徴付けられている。いくつかの試みがヒドラ8、14、15結合タンパク質GSHを特徴付けるために行われている。しかし、これらの推定上の受容体タンパク質の同一性は送り反応に寄与する可能性が曖昧な、非常に少数の他の分子成分が残り、報告されている日付16、図17は 。動物界で唯一特徴付けGSHR金魚18からである。そのようなGPCRシグナル伝達カスケードの種々のタンパク質の阻害剤としてだけでなく、高度な分子生物学技術（RNAiを介した遺伝子サイレンシングおよびCRISPR-Cas9介在ゲノム編集）を使用するなど、古典的な技術は、捕虜を提供することができますヒドラにおけるGSHシグナル伝達カスケードの分子成分の同定のための電波の強いツール。受容体のような改変された発現および機能の評価可能な読み出し及びGSHシグ...
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
著者は、ビデオ制作におけるK. P. Madhu、Nita Beliappa、そしてインド科学教育研究研究所のメディアセンターのスタッフに感謝しています。この研究は、インド政府バイオテクノロジー省のセンター・オブ・エクセレンス・プログラムからSGへの資金提供、およびインド政府科学技術省からRKへのポスドクフェローシップによって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| パナソニック冷却インキュベーター | MIR-254-PE | ||
| 顕微鏡 | ライカ | S8AP0 | |
| 用カメラ | EC3 | ||
| 還元型グルタチオン | Sigma | G4251 | 4°Cで保存 酸化を避けるために、ボトルを開封前に室温に戻してください |
| 画像編集プログラム | GIMP | Version 2.8 |
参考文献
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