グレースケール解析を用いたマウスの抜け毛の定量分析のための新たな手法

サマリー

脱毛症は、化学療法の副作用を含む多くの異なる状態で発生する可能性のある脱毛の一般的な形態です。 私たちは、標準的なゲルイメージャーを使用してグレースケール分析を行い、マウスの脱毛を定量化する方法を開発しました。これにより、有望な新しい脱毛症治療法の研究が容易になります。

要約

脱毛症は、男性型脱毛、多嚢胞性卵巣症候群、および円形脱毛症など、さまざまな条件で発生する可能性が脱毛の一般的な形式です。脱毛症は、癌患者における化学療法の副作用として生じ得る。本研究では、私たちの目標は、研究者が正確に評価し、脱毛症のこれらの様々な形態のための新たな治療アプローチを比較することができるようになりますマウスでの脱毛を、定量化するための一貫性と信頼性の高い方法を開発することであった。この方法は、マウスに黒（または灰色）の毛髪の量にラフ比例して発生する光吸収を測定する、マウスの画像を取得し、処理するための標準的なゲルイメージャを利用しています。このようにして定量化されたデータは、その後、標準的な統計的手法（ すなわち、ANOVA、T検定）を用いて分析することができる。この方法は、ワックスの化学療法誘発性脱毛症、円形脱毛症および脱毛症のマウスモデルにおいて試験した。このレポートでは、詳細なプロトコルは、PRESですマウスのC57BL / 6及びC3H / HEJ株からの検証データを含む、これらの測定を行うために取得済み。この新技術は、相対アプリケーションのシンプルさ、ほとんどの研究室で容易に利用可能である機器への依存、そして客観、主観的な評価よりも堅牢である定量的な評価を適用するなど、多くの利点を提供しています。マウスにおける毛髪成長の定量化の改善は、脱毛症モデルの研究を改善し、前臨床試験で有望な新しい治療法の評価を容易にする。

概要

脱毛（抜け毛）は複数の原因と心理的、感情的苦痛イベントになることができます。男性型脱毛症は35歳¹によって男性の約2/3に影響を及ぼし、脱毛症の最も一般的な原因である。抜け毛の同様のパターンは、多嚢胞性卵巣症候群の女性において観察することができる。これらの疾患の両方において、脱毛はアンドロゲン媒介性である。脱毛症はまた、人口²の1.7％に影響を与える自己免疫疾患、円形脱毛症、として発生する可能性があります。脱毛症は、化学療法³のようないくつかの医学的治療の副作用として発生する可能性があります。化学療法患者の割合が高い（65から85までパーセント）は、脱毛症^4,5ある程度の経験する。脱毛の心理的な影響は十分に化学療法の設定で研究されている。化学療法誘発性脱毛症、不安、抑う ​​つ、負の身体イメージをもたらすことができ、自尊心と^6,7-幸福の減少感を低下させた。高いPE女性のがん患者のrcentage（百分の47から58）は脱毛は、化学療法の最も外傷側面であると考えて、そして脱毛^4,6の恐れのための最大8％の下落治療。脱毛^8,9の心理的にも医学的結果を減少させるための治療をサポートするための男性ホルモン性脱毛症における証拠もある。同様に、円形脱毛症は、重度の心理的な影響^2、及び脱毛の斑点状の性質が脱毛の他のほとんどの原因はより不快化粧結果につながることが報告されている。

穏やかな抗アンドロゲン作用（ すなわち、スピロノラクトン）を有する薬剤が脱毛症の治療などの限られた成功を収めて使用されていたが、脱毛症のための最初の効果的な薬物療法は、ミノキシジル¹⁰だった。この血圧降下は、毛髪の成長を引き起こすの観察された副作用を有しており、現在脱毛症の多くの形態のための局所療法として使用される。しかし、応答はいくつかの科目だけ遅く表示で、しばしば不完全である脱毛ではなく、実際の再成長の¹⁰る。フィナステリドは、部分的な全身のアンドロゲン遮断を犠牲にしてアンドロゲン性脱毛症の改善で、その結果、ジヒドロテストステロンのII5α還元酵素をブロック変換を入力する競合的アンタゴニストである。長期的（10年）療法との回答率は50％前後¹¹である。全体として、この分野におけるかなりの研究にもかかわらず、脱毛のための適切な治療は依然として存在しない。

何十年もの間、科学者や臨床医は、臨床試験で頭皮毛髪の成長を測定する方法を検討した。脱毛症を治療する薬剤の開発により、毛髪の成長と、治療に対する特異的応答を測定する、信頼性の高い経済的な低侵襲手段に対する大きな必要性があった。脱毛障害を有する患者における毛髪密度の正確な定量化のための画像解析技術がtechniquの様々な方法を用いて、過去に一貫して有効な結果が得られた定義された頭皮領域¹⁴に毛量を定量化するためのデジタル画像¹²の解析、個々の毛髪及び皮膚病変^13、および顕微鏡走査の画像解析を含むエス。

上記の方法論は、臨床試験における発毛促進介入のための有効性の改善された評価を提供している残念ながら、これらの方法は、前臨床研究において、げっ歯類の研究に適用されていない。我々の目的は、研究者は、より正確に脱毛症の種々の形態のための新たな治療アプローチを評価し、比較することを可能にするであろう、マウスにおいて、脱毛を定量化するために一貫して信頼性の高い方法を開発することである。私たちは、茶色や黒い髪を持つマウスにおける毛髪密度の迅速かつ信頼性の高い定量化が可能になりますほとんどの実験室で容易に利用可能な機器を使用して方法論を開発した。この方法はwaxinから化学療法誘発性脱毛症、円形脱毛症、および脱毛症のマウスモデルにおいて試験されているグラム。詳細なプロトコルは、マウスのC57BL / 6及びC3H / HEJ株からの検証データを含む、これらの測定を実行するために提示されている。この技術は、毛幹中での顔料の光吸収を検出することに依存しているように、白マウス又はアルビノマウスにおける発毛を検出するために使用することができない。

プロトコル

倫理声明：動物に関わるすべての研究は施設のIACUCによって承認されなければならない（以下のデータについては、プロトコルは、モンテフィオーレIACUC、プロトコル＃11-6-240と＃13-7-100によって承認された）。撮影時まだそれらを維持する唯一の目的のために示されているように、動物が軽い麻酔を提供され、このプロトコルに必要ない痛みを伴う手続きはありません。

写真の1.取得

1. 印刷されたテキストと紙を用いたゲルイメージャのためのビューのフォーカスとフィールドを設定します。撮影した地域全体の光源の均一性を確認してください。均一性を確保するために、反射写真撮影のための光源を内蔵したゲルイメージャを使用しています。これはさらにグレースケールの分析には適していない動物のシルエットを作成すると同じように、透照光源を使用しないでください。
   注：これは関心領域（ROI）との意志を越え、光の平均化を提供する、やや焦点の外にマウスを置きます興味のある非常に小さい（ すなわち、<10ピクセル）の領域について量子的エラーを減らすのに役立ちます。関心の大きな領域は、このマイナーな焦点調節によって影響されず、またそれらは、動物の大きさの違いによって影響される。
2. これは急速な麻酔効果および迅速な回復を提供し、複数の動物を撮影するために最適であるように、：ケタミン（100mg / mlの）/キシラジン（20 mg / ml）で（1 2）を使用して動物を麻酔。
   注記：動物が静止画撮影を可能にするのに十分であるときに麻酔が確認された。動物は一般的に10〜15分以内にこの光麻酔から回復したように、獣医師は眼軟膏の使用をお勧めしていません。
3. （できるだけ平行に近い）の垂直配向ゲルイメージャーで麻酔した動物を置きます。
   1. 背写真の場合は、延長手足と腹臥位で動物を配置。
   2. 腹写真のために、動物が横方向に回転しないように注意しながら、仰臥位で動物を配置。
4. 撮影した領域でのグレースケール標準を置きます。
5. 閉じるアクセスドア。重要：周囲光露光の変化を導入することができる。
6. 取得の直線範囲内の関心領域を配置露光Fストップを設定する（Fストップを読み取る）。
   注：画像が飽和している場所ほとんどのシステムが表示されます。
7. 写真を撮る。
8. 変更標準および関心領域の両方を取得（参照の直線範囲内に留まるように、1からFストップを増加または減少させることによって、直線範囲内の関心領域を配置し、別の露出設定にFストップF-停止）。
9. 写真を撮る。
10. 撮影が完了すると、加温テーブルに動物を配置し、それらが伏臥を維持できるようになるまで監視。ケージに動物を返します。一度、すべての動物が完全に回復している動物施設への動物のグループを返します。

光の吸収2.定量

1. 使用した動物の画像上で関心のマーク領域は、ゲルイメージャのためのソフトウェアを提供した。
   1. 全動物の背ビューについては、可能な限り横方向に限り延長、下肢への上肢から延びる長方形または楕円形のイメージを使用するように、 図1Aに示すように、箱のいかなる部分も、動物の背中を越えて延びていない。
      NOTE：一つは、フリーハンド描画ツールを使用して、関心のある領域をマークできた。
   2. 骨盤領域をカバーする1と図1（b）に示すように胸のエリアをカバーする1：全体の動物腹ビューについては、2の長方形を使用しています。
   3. 必要に応じて、関心、 すなわち、薬剤投与の位置、マークのより小さな領域のために。
2. グレースケール吸収規格上の関心のマーク領域（複数可）。
3. 関心のマークされた領域のそれぞれからレコード吸収。

3.分析

吸収レベルobtaine関心領域の研究開発は、写真間の比較のために、バックグラウンドの標準に正規化する必要があるかもしれない。吸収への曝露の関係は両対数（ すなわち、関係がログ（曝露の間に線形である）とログ（吸収））である。この関係を用いて、関心領域の吸収は、吸収が異なる時点（試験プロトコル内、すなわち、連続測定）で撮影されたものを含む別の写真の間で直接比較することを可能にする標準的なバックグラウンド値に正規化することができる。これらの補正を実行するための手順は、オプションのステップ3.1および3.2に詳述されている。

1. グレースケールの吸収標準から得られた値を使用して、ログ対ログの（オプション）プロット曲線（露出）（吸収）。
2. 次のように（オプション）各写真の標準の変動を調整します。
   1. 秒で決定されるように（参照のためおよびFストップ（ステップ1.6で決定されるように）読み取るためFストップを選択1.8）をTEP。
   2. 読んでFストップは全く写真に標準の平均吸収を計算します。この平均値は参考基準値（RSV）である。
   3. （デルタ-ROI-1、デルタ-ROI-2 ... ..delta-ROI-X）規格（デルタ-S）のために、各定義されたROIのためにそれぞれの写真に写っている読書と参照F-ストップ設定間の吸収の差を計算する
   4. *（デルタROI-X / - F-ストップ+（F-ストップを読んで、標準の吸収RSV）を読んで補正吸収（ROI-X）=吸収（ROI-X）：次のように各ROIに対する補正吸収を計算しますデルタS）
3. 実験データをコンパイルし、連続変数（ すなわち、ANOVA、T検定）のための標準的な統計的手法を用いてデータ解析を行う。

結果

この技術は、C3H / HEJ生着マウス^、16円形脱毛症のマウスモデルを用いて検証した。これらの動物は、時間をかけて徐々に進行するグローバル脱毛を開発する。しかし、脱毛パッチで発生し、かなりの変動を導入し、定性的な評価を妨げ、次の1匹のマウスから異なる場合があります。このモデルは、有効性の評価として、マウスの異なる位置での光学密度の測定値の間の相関をテストする機会を提供した。

同じマウス上の非重複領域とは別のエクスポージャー、ROIの境界設定の変動、およびROIのを使用して対策が相関していた場合、最初の質問だった。マウスの背側表面上の長方形の対楕円形の規格（ 図4A）で定義されたROIを比較して見て有意な相関（P <0.0001）がありました。同様に高い相関関係は、動物上の異なる部位にとdiffeで見られた露光レベルを借り（図示せず）。これは、これらの測定の精度の高い程度を示す。矩形のROI（P <0.0001、 図4B）を使用して、バックの背側表面上のF-停止2...

ディスカッション

本報告書では詳細な説明は、げっ歯類で脱毛を定量化するための新しい技術の提供されています。この技術は、ほとんどの実験室で容易に利用可能である画像取得と分析のためのゲルイメージャ、機器を利用する。測定は、技術（ 図4から5）における小さな変化に対してロバストであることが示されており、治療モデルにおける視覚脱毛（ 図6）の程度によく相関している。これらの技術は、正常に脱毛¹⁷のための実験的治療の評価に用いられてきた。

げっ歯類で髪の成長を評価するための定量的なツールは、脱毛症の治療薬の研究を進める上で非常に貴重なことができます。脱毛症のための多くのマウスモデルは、それが困難な治療的介入の主観的評価に関する結果を基にすることができる固有の可変性を有している。同様に、フォームで結果を提供する定量的評価連続的な測定値のグループの平均値と標準偏差/標準誤差で要約することができ、標準的な統計的手法（ANOVA、T検定）を用いて試験することができる。この定量的評価は、一連の時間点にわたって応答を測定するために利...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
KODAK Gel Logic 100 Imaging System	Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA		写真を取得および分析するためのゲルイメージャーは、反射写真用の光源を内蔵している必要があります。
コダック/ティフェン Q-13 グレースケール	Imatest		グレースケール標準
C57BL/6J マウス	ジャクソン研究所、バーハーバー、メイン州		代表的な研究のための
マウス C3H/HeJ 生着マウス	クソン研究所、バーハーバー、メイン州の		代表的な研究のためのマウス