マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術

サマリー

ここでは、接着性マクロファージ細胞株による蛍光粒子の食作用を蛍光測定法を用いて定量化するプロトコールを紹介します。この方法により、粒子の内在化とそれに伴うアクチン重合のハイスループット定量が容易になります。

要約

蛍光分析の目的は、食作用および他の細胞プロセスを分析する効率的な、費用対効果の高い、高スループットの方法を提供することです。この技術は、細胞の種々の特性を調べるために、接着性および非接着性の両方の細胞型の、さまざまに使用することができる。食作用を研究する場合、蛍光技術は、マクロファージなどの貪食細胞型を利用し、蛍光が蛍光パンブルーの存在下で消滅させることができ、オプソニン化粒子を標識した。 96ウェルプレート中の付着マクロファージのメッキに続いて、蛍光粒子（緑色または赤色）が投与された細胞は、時間の種々の量のために貪食させる。蛍光粒子の内在化に続いて、細胞が内在化されていない、または単に細胞表面に付着している細菌からの蛍光シグナルの消滅を促進するトリパンブルーを用いて洗浄される。パンの洗浄の後、細胞を固定し、PBSで洗浄し、NDの細胞の核を標識するのに役立つDAPI（核青色蛍光ラベル）、で染色した。核（青）または粒子（赤/緑）蛍光のプレート読み取りを通して、簡単な蛍光定量によって、我々は緑の相対蛍光単位の比率調べることができます：青を、セルごとに内部移行し、蛍光細菌の量の貪食指数が示す決定する。洗浄のために96ウェル方式とマルチチャンネルピペットを用いたアッセイの持続時間は、データ収集の最後に、食作用の端部から、45分未満である。フローサイトメトリーを同様に使用することができるが、蛍光法の利点は、高スループット、サンプルの最小限の操作および細胞あたりの蛍光強度の迅速な定量化と評価の迅速な方法である。同様の戦略は、非接着細胞、生標識細菌、アクチン重合、および蛍光を利用する本質的に任意のプロセスに適用することができる。そのため、蛍光法は、低コスト、高throughpのための有望な方法であり、細胞プロセスの研究ではUT機能を提供します。

概要

蛍光シグナルの定量は、広く、フローサイトメトリー、PCRに至るまでの科学的方法の多数で使用される共焦点顕微鏡法、およびELISAを多重化分析をFRETされている。蛍光イメージングと定量化は、広範なアプリケーションがあり、様々な細胞プロセスの定量分析のための素晴らしいツールとなることができます。蛍光マーカーとその信号を使用すると、10年間で革命をもたらしてきた、蛍光プレートリーダーの出現は、細胞プロセスの間に放出される蛍光のハイスループット定量化が容易になった。

蛍光分析は、食作用の定量化に大きなツールとして役立つことができる。食作用は、1800 ¹メチニコフによる食細胞の発見以来研究されてきた。長年にわたり、種々の方法が、細菌、ウイルス、真菌および寄生虫病原体^2-5侵入に対する自然免疫防御に必須のこの重要なプロセスを調べるために利用されている。その後、内在化粒子（手動でまたはソフトウェアを用いて^）6~8の計数によって定量した貪食された細胞を可視化するために、定量化に利用顕微鏡および立体解析技術の従来の方法。定量分析のために単独で、顕微鏡を使用するいくつかの欠点は、細菌の手動カウントが労働集約的であり、観察者の偏りが発生しやすくなることである。食作用の定量化に使用される別の方法は、細菌培養プレート上（食作用の後）細胞溶解物からの細菌のメッキの微生物学的手法であるが、この方法は、殺菌メカニズムと部分的に内在化細菌の....

プロトコル

注：このプロトコルは、我々の以前に発表された研究¹²で使用される食作用およびアクチン重合の定量化などの複数の用途に使用することができる。プロトコルの改変が種々に向いて、 表1の細胞型および粒子が正常に過去の研究で利用した。ファゴサイトーシスまたはアクチン重合の定量化のためのこのプロトコルの標準的な使用は、 図1に示されている。

図1：食作用およびアクチン重合の定量化のための蛍光分析のダイアグラム細胞は、メッキ処理し、付着させた後、緑色蛍光（FITC）で標識された粒子は、食作用のために細胞に添加する。この反応は、トリパンまたはantibiによって停止される耳の洗浄（非内在化粒子を除去するため）、および固定を4％パラホルムアルデヒドを用いて行われる。その後、細胞を赤色蛍光アクチン標識（ローダミンファロイジン）、青色蛍光標識....

結果

このプロトコルを使用して、食作用およびその後のアクチン重合を定量化する2つの主要な方法は、連続または同期化された食作用を観察することです。

顕微鏡分析（ 図1B）は、蛍光光度計が記録されているものと同等の蛍光像を示している（また、 図1を参照）。 図1Bにアクチンの赤色蛍光、FITCの緑色の268蛍光がHKOP Eをラベルです大腸菌 、核DAPI染色、および3つのすべての269蛍光体の合成画像一緒に。この画像は、効果的な食作用、アクチン重合、および非内在化粒子の効果的なパン270消光を示している。

J774細胞は、デキストランビーズを内部される場合には、それぞれ図2AおよびCに見られるように、オプソニン化および非オプソニン粒子の連続食作用は非常に匹敵する。興味深いことに、アクチン重合以下opsonoph非オプソニン化粒子の内在以下アクチン重合（

ディスカッション

蛍光技術の主要な制限は、実験の分散、ならびに十分に洗浄し、非接着細胞の使用に関連する細胞の喪失である。

分散は、実験を実験からの粒子の同一の番号を維持する正確な方法ではないストック溶液の調製時に秤量し、ピペッティングなどの蛍光粒子の変化によるところが観察される。 （ - ;粒子がすぐに追加および削除t = 0の対照）実験間の変動の問題に対処するために、データは％の食作用として、例えば、相対的な用語で表現または対照からの変化を折り畳むことができる。分析のこの形式は、再現性のトレンドを生成し、制御から％の食作用の値は、実験から実験に似ています。データ分析のこの種類は3-6の実験反復して統計的有意性を促進する。蛍光技術は、効果的に観測された傾向dは検討して再生するために使用することができ十分なデータ分析を利用の場合、その変動性のespite。技術のマスタリングで、それは一日に約半96ウェルプレート、または600の処理を実行する単一の科学者のために可能である。

細胞の損失は、主に、非接着細胞タイプを用いた研究において観察されている。こ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 μm黄緑色の蛍光蛍光Fluo-Spheres;	分子プローブ	F8852	は50&muを組み合わせます。50&muのll opsonizing reagent 37oC で 30 分間
Heat killed E. coli BioParticles フルオレセイン コンジュゲート	Molecular Probes	E2861	recomposition (5 mg) in 50 μPBSのlと50&muと組み合わせます。l オプソナイジング試薬を 37 °C で 30 分間;C
オプソナイジング試薬	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
以下のアイテムは多くのブランドで販売されていますが、この調査で使用したアイテムは次のメーカーのものです。
RPMI 細胞増殖培地	Gibco		10% FBS および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを添加; 37°C で温熱;C 使用前のC
蛍光プレートリーダー - Fluostar Omega	BMG Labtech
パラホルムアルデヒド (16%)	フィッシャー・サイエンティフィ	ックAA433689M	前に4%に希釈
96ウェルプレート	グライナー	655097	クリアまたはブラックまたはクリアボトム - ブラックプレート
マルチチャンネルピペット (8 - 12チャンネル)
試薬リザーバー
1x PBS
マイクロチューブ(0.6 ml)
腎臓(10 ml)