過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Summary

過ヨウ素酸シッフ染色は、組織の多糖類含有量を可視化する技術です。この記事では、ヒト静脈血から精製された末梢血単核細胞での使用に適した過ヨウ素酸シッフ染色プロトコルを示しています。このようなサンプルは、リンパ球や免疫系の他の白血球に富んでいます。

Abstract

過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色は、筋肉生検や血液サンプルの診断ツールとして使用される免疫組織化学的技術です。グリコーゲン、糖タンパク質、糖脂質などの多糖類は明るいマゼンタを染色し、組織内の陽性細胞と陰性細胞を容易に列挙できます。筋細胞では、PAS染色を使用してさまざまな種類の筋細胞のグリコーゲン含有量を測定し、血液細胞サンプルでは、PAS染色はさまざまな状態の診断ツールとして研究されています。血液には、免疫系に属する白血球が一定の割合で含まれています。免疫系の細胞がグリコーゲンを持ち、それをエネルギー源として利用するという考えは、あまり研究されていません。ここでは、ヒト静脈血の末梢血単核免疫細胞に適用できるPAS染色プロトコルの適応バージョンについて説明します。PAS陽性顆粒を有する小細胞およびびまん性PAS染色を有する大細胞が観察されました。アミラーゼによるサンプルの処理により、これらのパターンが解消され、染色の特異性が確認されます。酵素分解に基づく別の技術により、サンプル中のグリコーゲンの存在と量が確認されました。このプロトコールは、血液由来リンパ球の多糖類含有量を研究する血液学者や免疫学者にとって有用です。

Introduction

過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色は広く、筋肉の研究および診断に使用されている免疫組織化学的手法である。また、血液サンプルの診断ツールとして利用されている。技術は無色シッフ試薬、それにより深いマゼンタ生成物を生成物と反応アルデヒド基を生成する多糖類内のユニットを酸化したサンプルに過ヨウ素酸ナトリウム溶液を適用することによって機能する。この手順のステップは、図1に示されている。汚れが多糖部分を有するグリコーゲン、糖タンパク質、糖脂質、ムチン、または他の分子を含む多糖類マゼンタで何をオン。

PAS染色は、多くの場合、筋線維におけるグリコーゲンレベルを測定するために使用される。筋肉組織切片彼らはしっかりとスライドに付着し、複数の洗浄と染色工程に耐えるような技術に最適です。グリコーゲンは、高い需要があり、タイプII筋線維、速筋の中で最も存在する最大パフォーマンス^1,2のためのグリコーゲンを必要とする迅速なATP産生のために。グリコーゲンは、グリコーゲンホスホリラーゼ酵素の作用を介して遊離グルコースに分解することができるグルコースの分岐ポリマーである。栄養不足や高エネルギー需要の時代にしながら、休息と栄養自給の時代には、グリコーゲンは、グリコーゲン合成のプロセスを経て補充される。グリコーゲンは、グリコーゲン分解によるグルコースに分解される。血液サンプル上で、早ければ1950年の臨床医科学者が調査してきたように、PAS染色からは、様々....

Protocol

ヒト血液サンプルを用いた研究がコンコルディア大学倫理審査委員会、証明書番号10000618.によってコンコーディア大学倫理審査委員会、証明書番号2010BERGによって承認されたマウス筋肉の作業を承認されました。

全血から1 PBMC単離

注：無菌技術と製造業者滅菌装置を使用してバイオセーフティキャビネットには、この手順を行ってください。

1. 慎重に50ミリリットルの滅菌コニカルチューブにヘパリン化（抗凝固剤）採血管からの全血を10〜15ミリリットル注ぐ。マイナー血液の流出の場合は、クリーニングティッシュを使用してのddH ₂ O、70％EtOHで拭いてください。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS 1X）pHが7.4と1：1の比率にコニカルチューブ内の血液を希釈します。最大総容量は30ミリリットルを超えないようにしてください。
3. 気泡を避け血清学的ピペットガンを使用して穏やかに混合。
   注：血aを避けるためにチューブを反転させて混合しないでください遠心分離中キャップとその後の浸透でccumulation。
4. 新しい50ミリリットル容量のコニカルチューブに、（ 材料および機器の表を参照）フィコール-パックの13ミ ​​リリットルを追加します。ラックにチューブを直立し....

Results

試薬及び基本技術を検証するために、PAS染色をマウスヒラメ筋切片に、製造業者の指示に従って行った。染色は犠牲と同じ日に行われた染色の最後のステップで、切片をキシレン中で固定した。ヒラメ筋は^9〜35％のグリコーゲン陽性細胞を含むことが知られている。染色された筋細胞は、2つのセル内の異なるPAS陽性と特長点状顆粒、および細胞膜（ 図2A）の境界を定める連続線を示した。点状の顆粒の存在は、グリコーゲン貯蔵と一致して、正の筋細胞を定義するために使用された。アミラーゼの試料の処理は、彼らがグリコーゲン（ 図2B）であることと一致している点状の顆粒を削除しました。

図2：PAS-染色されたマウスの筋肉切片を光学顕微鏡で分析した。マウスの.......

Discussion

このビデオ記事の重要なステップは、細胞の洗浄およびアミラーゼ治療中であった。スライドを洗浄しながら、重要なステップは、プラスチック製のスクイーズ洗浄瓶を使用して、水が軽くスライド上のサンプルを介して実行させると、サンプル上に直接狙っていなかった。少しでも直接水圧は、細胞がスライドをオフに来てしまいます。もう一つの重要なステップは、±アミラーゼ条件に同じスライドを使用することであった。 PBMCをスライドに付着させた後、スライドを注意深くのでスミアの半分だけがアミラーゼ溶液に曝露したビーカーに入れた。血液細胞は、このようにわずかなタイミングのばらつきに起因し発生する可能性が交絡変数を最小限に抑え、同じスライドからであるため、この手順はロバスト制御を提供します。細胞は無処理とよく立ち往生ので、例えばポリ-L-リジンまたはポリエチレングリコールコーティングに関わる追加費用と時間が保証されないであろう。

TRを通してアミラーゼの最適な活性をoubleshootingを決定した。筋肉切片のためには、アミラーゼの最適活性は、インキュベーションの1時間以内に観察されたことが注目された。短い時間.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
過ヨウ素酸シフキット	Sigma-Aldrich	395B	使用前に室温に戻してください。このキットの材料は有毒で有害です。注意してください。
&α;-ブタ膵臓	由来アミラーゼ Sigma-Aldrich	A3176
双眼顕微鏡	カールツァイス顕微鏡	Axio Lab A0
グリコーゲンアッセイキット	シグマ・アルドリッチ	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	スクロースの非イオン性合成ポリマー。
遠心分離機			PBMCの分離には、スイングバケットを使用しました。