過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色は広く、筋肉の研究および診断に使用されている免疫組織化学的手法である。また、血液サンプルの診断ツールとして利用されている。技術は無色シッフ試薬、それにより深いマゼンタ生成物を生成物と反応アルデヒド基を生成する多糖類内のユニットを酸化したサンプルに過ヨウ素酸ナトリウム溶液を適用することによって機能する。この手順のステップは、図1に示されている。汚れが多糖部分を有するグリコーゲン、糖タンパク質、糖脂質、ムチン、または他の分子を含む多糖類マゼンタで何をオン。

PAS染色は、多くの場合、筋線維におけるグリコーゲンレベルを測定するために使用される。筋肉組織切片彼らはしっかりとスライドに付着し、複数の洗浄と染色工程に耐えるような技術に最適です。グリコーゲンは、高い需要があり、タイプII筋線維、速筋の中で最も存在する最大パフォーマンス^1,2のためのグリコーゲンを必要とする迅速なATP産生のために。グリコーゲンは、グリコーゲンホスホリラーゼ酵素の作用を介して遊離グルコースに分解することができるグルコースの分岐ポリマーである。栄養不足や高エネルギー需要の時代にしながら、休息と栄養自給の時代には、グリコーゲンは、グリコーゲン合成のプロセスを経て補充される。グリコーゲンは、グリコーゲン分解によるグルコースに分解される。血液サンプル上で、早ければ1950年の臨床医科学者が調査してきたように、PAS染色からは、様々な疾患^3-7のグリコーゲン含有量を分析する。例えば、ポンペ病、真正グリコーゲン貯蔵において、疾患白血球は健常対照⁸と大きく異なるグリコーゲンを大量に蓄積する。

このビデオ資料は、末梢血単核細胞（PBMC）健常なヒト被験者の静脈血からのサンプル上で使用するためのPAS染色の適合したバージョンを示す。 PBMCsは主にTリンパ球のリンパ球およびBリンパ球のファミリー、ならびにナチュラルキラー細胞および単球のような他の免疫細胞を含む。最初の精製工程は、赤血球、好中球、および他の顆粒球を除去する。この技術は、全血塗抹標本を使用する場合と比較して、PAS陽性細胞のより堅牢な列挙を可能にするリンパ球の濃縮された割合のデータを提供する。

図1：PBMC上のPAS染色の段階の方法論によって、工程（A）まず、PBMCの単離はFicoll勾配を介して達成されるが、左側のパネルには、遠心分離前の準備を示し、右側のパネルには、遠心分離後にそれを示してPBMCを含む軟膜チューブの中心に観察される。（B）単離されたPBMCは、ホルマリン、エタノール固定剤ソリューを用いてスライド上に固定されているる。スライドを穏やかにプラスチック洗浄瓶からの蒸留水で洗浄する。（C）スライドは、次に、グリコーゲンを溶解するアミラーゼ溶液で満たされた100mlビーカー途中に配置される。スライドを穏やかにリンスした。（D）スライドは糖の酸化が起こる周期的な酸溶液で処理される。スライドを軽くすすぐ。これは、過剰の過ヨウ素酸を除去し、酸化工程を停止します。（E）シッフ試薬をスライドに添加される場合には、酸化工程中に作成されたアルデヒドと反応する。この無色の試薬は、その後、深い赤マゼンタ製品になります。スライドを静かに過剰シッフ試薬を除去するために洗浄する。

ヒト血液サンプルを用いた研究がコンコルディア大学倫理審査委員会、証明書番号10000618.によってコンコーディア大学倫理審査委員会、証明書番号2010BERGによって承認されたマウス筋肉の作業を承認されました。

全血から1 PBMC単離

注：無菌技術と製造業者滅菌装置を使用してバイオセーフティキャビネットには、この手順を行ってください。

1. 慎重に50ミリリットルの滅菌コニカルチューブにヘパリン化（抗凝固剤）採血管からの全血を10〜15ミリリットル注ぐ。マイナー血液の流出の場合は、クリーニングティッシュを使用してのddH ₂ O、70％EtOHで拭いてください。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS 1X）pHが7.4と1：1の比率にコニカルチューブ内の血液を希釈します。最大総容量は30ミリリットルを超えないようにしてください。
3. 気泡を避け血清学的ピペットガンを使用して穏やかに混合。
   注：血aを避けるためにチューブを反転させて混合しないでください遠心分離中キャップとその後の浸透でccumulation。
4. 新しい50ミリリットル容量のコニカルチューブに、（ 材料および機器の表を参照）フィコール-パックの13ミ ​​リリットルを追加します。ラックにチューブを直立してください。
5. トランスファーピペットを用いて、希釈した血液を取る、上部付近のチューブの内壁に転送ピペットチップをタッチします。ゆっくりと安定した圧力で、スクロースの層の上に血液層を形成する管の内壁に沿って血液を移す。すべての血液が転送されるまで、この手順を数回行います。
6. 5に培地加速度を設定したスイングローターで700×gで30分間室温でチューブをしっかりと遠心チューブにキャップをし、ZEROに設定された減速。
7. ゆっくりとチューブを取り出し、層を乱すことなく、バイオセーフティキャビネットにそれを取り戻す。
8. 慎重にPBS /プラズマAの間に置かれたPBMCが配置されているバフィーコート（薄曇った白層）を、収集、ndはフィコール層をトランスファーピペットを使用して。スクロース層を収集回避し、赤血球細胞層を乱さない。
9. 新しい50ミリリットルの滅菌コニカルチューブに軟膜を転送します。これは、すべてのPBMCを収集するステップ1.8を繰り返し数回を取ることができる。
10. PBMCとのチューブにpH7.4のPBSを追加し、45ミリリットルのマークに埋める。徹底的にチューブを振る。ボルテックスしないでください。
11. 1を洗う：9に設定された最大加速と減速の両方で480×gで15分間遠心操作は、円錐管の底にPBMCのペレットの形成を観察します。
12. 漂白剤の10ミリリットルプラスチックビーカーにPBS（上清）を捨てる。
13. 優しく凹凸面（ すなわち、空のラック）に対して「ラッキング」によって細胞ペレットを緩めます。ボルテックスしないでください。
14. チューブに新鮮なPBS pHが7.4の25ミリリットルを追加します。複数の管が処理されている場合は、このステップで一緒にペレットをプールする。
15. ウォッシュ2：遠心分離機480のXGのWiで12分間チューブ9に設定された最大加速と減速の両方目。
16. 漂白剤のスプラッシュプラスチックビーカーにPBS（上清）を捨てる。
17. 凹凸面にゆっくりと「ラック」（ すなわち、空のラック）。ボルテックスしないでください。
18. チューブに新しいPBSの25ミリリットルを追加します。
    1. 50μlの細胞を取り出し、生存能力カウント用のマイクロ遠心チューブに移す。
    2. 穏やかに混合するには、上下パンブルー（生存能力染色）とピペットの等しい量（50μl）を追加します。
19. 10μLを取り出し、1ml当たり細胞の生存率をチェックするために、血球計数器に転送します。細胞/ mlの数を記録します。
20. 細胞の所望の量を取り出し、9に設定された最大加速と減速の両方で480×gで12分間遠心操作を行なう。
21. 漂白剤を入れたビーカーにPBS（上清）を捨てる。
22. 凹凸面にゆっくりと「ラック」（ すなわち、空のラック）。 8を追加チューブにPBSを0μlの。

2. PBMCスライドを作る

1. 顕微鏡スライド上に細胞を80μlのを置きます。別のスライドの助けを借りて、ドロップを塗抹またはスライドの両端に40μlの各2滴を配置。
2. 乾燥するために生物学的安全キャビネット内でスライドしたままにします。つや消し側の鉛筆でスライドにラベルを付けます。

3.スライド上のサンプルの修正

1. 4.5ミリリットルの99％エタノール、37％ホルムアルデヒドの0.5ミリリットルを混合して固定液を準備します。
2. スライドを乾燥した後、新たに作製した固定液2 mlを取り出し、スライドの表面全体を覆​​うようにスライドの上に注ぐ。
3. 1分間のスライドで解決策をしておきます。水道水で1分間のスライドをすすぎ、空気乾燥に任せる。

4.ネガティブコントロールのためのアミラーゼのソリューションを作る

1. アミラーゼ粉末を0.25gを取り、ジ50mlに溶解静め水。清潔な100mlビーカー内の溶液を注ぐ。
2. スライドの半分は治療を受け、残りの半分は、未処理のままにした後、室温（ 図1C）で15分間インキュベートするようにビーカー中でスライドを浸す。
3. アミラーゼ治療を受けているスライドのどちら側にメモしておいてください。治療群と対照との間の境界を示すスライドの背面に線を引きます。
4. アミラーゼ溶液を除去し、空気乾燥したスライドを残してのddH ₂ Oでスライドを洗浄します。

5.過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色および撮影を行う

NOTE：PAS試薬は吸入により毒性があり、腐食性であるため、ステップは、化学ドラフト内で行われる必要があり、廃棄物が適切に機関のガイドラインに従って廃棄しなければならない。

1. 平らな面にスライドを置き、試料上で定期的な酸溶液の1.50〜2.00ミリリットルを注ぐ。 Incuba室温で5分間テ。
2. 蒸留水のいくつかの料金のスライドを洗浄します。
3. スライドにシッフ試薬の1.50〜2.00ミリリットルを注ぎ、15分間室温で静置する。
4. 5分間蒸留水でスライドを洗浄し、空気乾燥に任せる。
5. スライド上の10μlの取り付けメディアを適用し、二つの小さなカバーガラスでカバーし、または50μlのを適用し、一つの大きなカバーガラスを使用しています。
6. 一晩乾燥させて、カバースリップの端に明確なマニキュアを適用します。

6. 100X対物レンズを用いて双眼光学顕微鏡で画像を得る

試薬及び基本技術を検証するために、PAS染色をマウスヒラメ筋切片に、製造業者の指示に従って行った。染色は犠牲と同じ日に行われた染色の最後のステップで、切片をキシレン中で固定した。ヒラメ筋は9〜35％のグリコーゲン陽性細胞を含むことが知られている。染色された筋細胞は、2つのセル内の異なるPAS陽性と特長点状顆粒、および細胞膜（ 図2A）の境界を定める連続線を示した。点状の顆粒の存在は、グリコーゲン貯蔵と一致して、正の筋細胞を定義するために使用された。アミラーゼの試料の処理は、彼らがグリコーゲン（ 図2B）であることと一致している点状の顆粒を削除しました。

図2：PAS-染色されたマウスの筋肉切片を光学顕微鏡で分析した。マウスのヒラメ筋切片をPASで染色した。いくつかのサンプルは、アミラーゼで前処理した。（A）PAS陽性粒子は、筋細胞の内部で見えた。筋肉切片はアミラーゼで前処理したとき（B）少ないPAS陽性細胞が観察された。細胞膜の周りの染色はアミラーゼ処理（スケールバー= 100μm）の後に残った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

膜染色シグナルもアミラーゼ処理後に残った。予想されるようにアミラーゼを治療しながら、非アミラーゼ筋節のPAS陽性細胞の割合は、37％であった筋肉切片では有意に少ない、約5％のPAS陽性細胞（ 図3）を有していた。

次に、PAS染色プロトコルの項で説明するように修正された技術を用いて、健常なヒト被験者の静脈血からPBMCに対して実施し、 図1に示された。洗浄工程を注意深く行った場合PBMCはよく接着した。 PAS染色したPBMCを染色パターンの様々な表示された。顆粒と小さなセル（5μm）を容易に観察された。びまん性染色パターンを有するより大きな細胞の割合も観察された（ 図4A、及び挿入図A.1-6 図4B）が減少した。

図4：PBMCは上のヒトPBMCにおける素酸-シッフ（PAS）染色（A）PAS染色を行った。二種類の細胞が観察された。非アミラーゼ処理したスライドで（A.1-6）小さなセル（5〜AT）はグリコーゲンと一致マゼンタ粒子を示した。これらの細胞は、細胞休止することができた。非アミラーゼ処理細胞における大きなセル（5μm以下）は、びまん性PAS陽性染色を持っていた。これらの細胞は、リンパ球を活性化することができた。（B）PBMCを前PAS信号を減少染色、15分間、アミラーゼで処理した。 7別の健康なヒト被験者の代表。（C）PASとhematoxy林染色は、全血のスライド上で行う。矢印は、多くの赤血球（スケールバー=10μm）を囲まれたPBMCを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

PAS陽性の割合は小さい細胞については98％、より大きなセルのための40％であった。アミラーゼ処理は、小細胞た（p <0.001）でPAS信号を排除し、著しく7％（ 図5）に大きなセルでPAS信号を減少した。

図5：PAS陽性PBMCの定量 PAS陽性であったPBMCの割合は、アミラーゼ前処理なしかで代表スライドからカウントした。小型の細胞の98％がPAS陽性であった。大きなセルの40％は、pだったPASのためositive。アミラーゼ処理は、小細胞た（p <0.001）でPAS信号を排除し、著しく7％た（p <0.001）、より大きな細胞におけるPAS信号を減少した。

PBMCを有していることを確認するためにもグリコーゲンの量の定量化を提供する第2の、独立したメソッドは10,11を使用したグリコーゲン、および以前に他の細胞型12にJoveのに掲載されました。 PBMCを低張緩衝液中に溶解させ、 図6のキャプションに簡単に記載されるようにグリコーゲンを分離した。

図6：加水分解酵素による酵素消化を使用してグリコーゲンの測定 。グリコーゲンは、製造業者の指示に従って測定した。簡単に説明すると、プロトコルは、不溶性物質のペレット化に続いて、1×10 6 PBMCの低張溶解を伴うそれは、グリコーゲンが含まれています。ペレットを洗浄し、分光光度法により測定し、標準曲線と比較したグルコースをもたらす加水分解酵素で消化した。細胞溶解物は、加水分解緩衝液で示される比率で希釈した。データは3回の実験の代表である。グリコーゲンの有意なレベルは1で検出された：1希釈した（p = 0.02）、及び溶解液として滴定この信号は、さらに希釈した。

不溶性グリコーゲンを数回洗浄した後、加水分解酵素を用いて消化した。消化から得られたグルコースの量は、分光光度法を用いて測定し、標準曲線と比較した。百万個のPBMCをグリコーゲンの1.19μgのを持っていた。細胞溶解物として滴定グリコーゲン信号はさらに（ 図6）で希釈した。

著者らは開示するものは何もない。