リモート四肢虚血プレコンディショニング：げっ歯類における神経保護技術

ほとんどの生存率は、おそらくすべて、代謝ストレスに直面した組織は、亜致死虚血^1,2の周期で前コンディショニングによって改善することができます。実用的な面で虚血プレコンディショニング（IP）は、その後の虚血性発作のような組織の経験より深刻なストレッサー、前に、亜致死虚血に対する組織の暴露です。動物モデルでは、IPは、脳、網膜、心臓や肺^3-6に印象的な保護を提供します。それに対応して、脳卒中患者における観察は、以前の一過性脳虚血発作、より良い臨床転帰^7,8との間のリンクを示しました。 IPは、非虚血性傷害⁹から網膜の光受容体を保護します。

多様な組織および傷害におけるIPの有効性は、それが全ての組織に存在する細胞生存の生来の機構を活性化していることを示唆しています。心筋の虚血プレコンディショニングはアップレギュレーションを介して保護効果を有することが示唆されていますアデノシンの放出を介して、またはミトコンドリアATPカリウムチャネル^10,11の開口部を介して多くの代謝経路を調節することが知られている低酸素誘導因子（HIF）、の。アデノシン放出およびATPカリウムチャネルは、脳虚血に関与しているですが、これまでの虚血性コンディショニングの神経保護機構の調査は、抗興奮毒性への変更、抗アポトーシスおよび抗炎症経路^12,13に焦点が当てられてきました。全体的に、神経細胞を保護するための虚血性コンディショニングの分子過程の理解は限られています。

リモート虚血プレコンディショニングの試みは、重要度の低い組織における虚血を生成することにより、離れた非常に重要な器官（心臓、脳、肺）を調整します。後肢を用いて遠隔虚血プレコンディショニング（RIP）は、脳卒中^14-17のげっ歯類モデルにおいて神経保護的であることが実証されています。我々が記載された方法は、簡単かつ信頼性のある非侵襲PROTを提供しますRIPを誘導するためのocol。

RIPプロトコルの大部分は、上部の後肢に位置大腿動脈の識別を容易にし、手術用クランプや止血帯のアプリケーションのためにアクセスすることができたためと思われる、後肢を伴います。脳と皮膚保護の研究のための侵襲性四肢虚血性の研究では、虚血は鼠径靭帯から大腿動脈を分離し、大腿動脈^2,15,18をクランプすることにより誘導されます。

四肢cuffingまたは大腿動脈クランプのいずれかに起因する虚血は、パルスの損失、酸素の減少と皮膚温度の低下などの四肢での変化により確認されています。リモート虚血は、レーザードップラーまたは超音波ドップラー^17-19を用いて、パルスの消失によって確認することができます。皮膚温度は関係が^20,21非線形であるが、ドップラーの代替として使用することができます。正確な温度記録は、研究所や缶では一般的です簡単にリモート虚血性の研究に組み込むこと。

手術をクランプ大腿する代わりに、止血帯を使用して、虚血の誘導です。止血帯アプリケーションは、血管クランプを用いて達成されるものに匹敵する虚血を作り出します。 Kutchner ら 。非侵襲的な止血にクランプ侵襲大腿動脈を比較し、両方の方法が四肢への血流を停止し、皮膚フラップ虚血¹⁸の形成外科モデルにおける皮膚損傷を減少が見出さ。脚または腕のいずれかをCuffingと収縮期血圧上にカフ圧を上昇させることは、ブタおよびヒト^17,19,22における虚血性損傷に対する保護であることが見出されています。

別の止血帯は、虚血性血圧カフ又は弾性バンド^17,22,23の使用を含む、リモート誘導に近づきます。しかし、虚血を誘導する弾性バンドを使用することは、潜在的に圧力の無秩序な量を生じさせる、危険な方法であります500 mmHgの上の圧力上昇と手足は、ヒト²⁴に記録されています。また、ゴムバンドを使用して、四肢虚血は、エバンスブルー色素、筋線維の透過性²⁵ の in vivoマーカーによって評価されるように、バンド²³の除去後のラットの筋肉の損傷につながります。対照的に、止血帯に制御された圧力の送達は、血圧計^17,19,22,26に接続された血圧カフを用いて達成することができます。

本研究では、光受容体変性の光損傷モデルは、リモート虚血プレコンディショニングの神経保護効果を実証しました。リモート虚血は、光損傷の直前に誘導し、網膜の機能試験によって確認されるように、その後の光受容体の変性を防止することができました。付属のビデオでは、非侵襲的なリモート虚血のアプリケーションのデモンストレーションを行います。

倫理文は：プロトコルは、5657＃AECシドニー大学の動物ケアのガイドラインに従います。麻酔は、動物倫理委員会（シドニー大学、AEC＃5657）によって承認されました。

1.機器の準備

1. リアルタイム皮膚温度トラッキングを使用してください。コンピュータ、およびデータ集録ハードウェアのスイッチをオンにします。
2. オープン温度記録ソフトウェアと30〜35の間°Cと100ミリ秒毎にサンプリング周波数に温度設定を調整します。
3. オプション：コア温度を確保するために挿入し、直腸温度計は37.5℃で安定しています。

手動血圧計の2キャリブレーション

1. 250〜550グラムのラット用サイズ2カフをsphygmomanometer.Useする新生児腕カフを接続します。アダプタは、血圧計のカフチューブを接続する必要があるかもしれません。
2. どちらかが大気開放弁を緩めるか、適応からカフチューブを切断することにより、カフを収縮または。は圧力いないことを確認し、チューブ内に残り、圧力計の針は楕円形/矩形の内側にゼロにかかっています。
3. チューブ、圧力計とカフの間の圧力を確認してください。それは圧力計で100 mmHgのを読み取るまでインフレ電球の穏やかなポンプにカフを膨張させます。圧力が一定のままで確認してください。ゆっくりと空気放出値を開くことによって、カフを収縮させます。

3.動物の準備

注：光損傷を受けることがある動物は、リモート虚血前の晩暗い適応を必要とします。光損傷を受けた動物は、暗い飼育（：暗サイクル（5ルクス）12時間の明）が必要

1. 覚醒または麻酔げっ歯類のいずれかでリモート虚血を実行します。動物は健康な筋肉の緊張を持っていることを確認してください。十分な筋肉の存在があることを確認するために、上部の後肢をつまんで、これを確認してください。光損傷に対するRIPによって誘発される保護は、生後6ヶ月まで坐ったラットでテストされています。
2. Rのための麻酔の準備IP
   1. 60ミリグラム/ kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンの腹腔内注射でラットを注入します。足を拡張し、足の下の皮膚をつまんで麻酔の深さを確認してください。それが深く麻酔された場合、動物には反射を持っていません。麻酔下ながら角膜の乾燥を避けるために、人工涙液を適用します。
   2. 熱パッドまたは37.5℃の一定の体温を維持するために、循環水加熱器チューブのいずれかに配置ラット。下肢「フットパッドを上に向けて腹臥位にラットを配置します。どちらの右または左肢は、リモート虚血を受け得ます。
3. RIPのための目を覚まし準備
   注：動物実験AWAKE 2人が必要です。一人は動物を拘束し、二人目は、手動血圧計を運営しています。実験者は、拘束がハンドラの負傷のリスクを高めるような手順を実行するために自信を持っている必要があります。リモート虚血を受けたラットは、Tを調整されなければなりませんOマニュアル拘束。直感ガイドラインに応じて手動拘束は数週間にわたって5分の最大30秒から進行する必要があります。マニュアル拘束に順応しない臆病な動物が目を覚まし、実験から除外されるべきです。最後に、手動の拘束を正確にRIPの調査結果を解釈するために使用されなければならない動物へのストレス（および潜在的に研究に交絡を紹介）および偽コホート（炎症のないカフの配置）を引き起こす可能性があります。
   1. 15cmのX 30〜50センチメートル片にタオルをカットし、後肢の上部に頭をカバーする、ラットの脊椎に垂直な短辺を配置します。
   2. ラットの胴体の下の短い辺をしっかりタックとタオルの残りの長辺でラットをラップし始めます。仰臥位で腕の下に包まれた動物を保護します。ラットを左腕の下に保持されている場合は、タオルから、ラットの右肢を解放します。

4.アプリケーションO皮膚温度プローブF

1. 虚血を受け、フットパッドの肌のプローブを配置することであるラットの足を拡張します。温度プローブと皮膚との接触を最大化するために、皮膚のプローブを配置します。しっかりとフットパッドにプローブを押して、紙テープでプローブを取り付けます。
2. 温度記録ソフトウェアで温度を追跡することによって、皮膚のプローブの配置を確認してください。皮膚温度は30-34℃の間であり、安定していることを確認してください。 1-2分間皮膚温度を追跡します。温度が不安定になったり、30℃以下であれば、皮膚のプローブを調整します。

5.リモート虚血

1. カフを収縮し、空気圧バルブが閉じていることを確認します。足を伸ばして、ゆるく上側後肢にカフを取り囲みます。位置に緩めたカフを維持するために、脚と下位桁を拡張するために人差し指と親指を使用してください。
2. 160 mmHgのに麻酔動物のカフ圧を上げ、目を覚​​まし動物increで180 mmHgでのカフ圧ASE。
   注：ラットの麻酔血圧が120〜140 mmHgでの範囲であり、ときに意識し160 mmHgのに上昇します。適切な圧力に達すると、タイマフット温度記録を開始します。
   注：足の温度が一定の圧力の5分後に2°Cでドロップする必要があります。
3. 虚血を通して、動物の「ひざ」は、上記カフの位置を維持します。カフ圧は、数分後に落下し始める、またはラットの手足が動いている場合。
4. 繰り返しポンプの所望のカフ圧の繰り返しショートバーストを維持するために、短いバーストのインフレ電球ポンプ
5. リモート虚血は5分間と15のために連続的に送達することができます。虚血再灌流プロトコルが介在する5分間の再灌流との5分間の虚血の2期間を含みます。
6. 空気圧バルブを緩めて、カフ圧を収縮。虚血プロの過程で温度変化を確認してくださいトコール。カフをリリース。
7. 傷害実験を続行します。麻酔の影響下に動物を加熱パッド上に配置する必要があります。歩行まで、動物を監視し続けます。動物は歩行まで、筐体に戻すことはできません。

6.ライト傷害 - 網膜変性モデル

1. 暗い一晩（12-15時間）、動物を適応させます。すぐにリモート虚血コンディショニングまたは偽リモート虚血（動物拘束）は、次の食料と水でパースペックスハウジングに動物を配置します。
2. 24時間午前9時パースペックスハウジングの上方に位置する蛍光灯（千ルクス）のスイッチをオンにします。露光に続いて、7日間の環状照明を暗くするために動物を返します。

7.ポストリモート虚血手順

1. 電図（ERG）とビジョンの評価：
   注：ERGセットアップとフラッシュプロトコルはBrandliストーン^26に従いました。
   1. 暗い一晩（12-15時間）、動物を適応させます。下（それぞれ、60ミリグラム/ kgおよび5mg / kg）ケタミンとキシラジンの腹腔内注射によって動物を麻酔赤色照明を暗く。散瞳（硫酸アトロピン1.0％）、角膜麻酔（proxymetacaine 0.5％）。
   2. 眼は角膜にすぐに低下し、角膜の水和（カルボマーポリマー）を適用します。角膜の水和を維持するために20分間隔でアイゲルを適用します。
   3. 安定したERG記録を支援するために、眼球の周りにゆるく結ぶ糸を描画します。直腸プローブを用いて温度を監視し、37から37.5℃の動物の体温を維持します。
   4. 全体野積分球内部のヘッドの位置を調整します。
      注：全体野は、LEDからの目に均一な聖霊降臨祭の点滅を提供し、完全にプログラム可能な光刺激です。
   5. 軽く角膜や口に挿入された直径2mmの銀/塩化銀ペレット電極に触れるカスタムメイド4ミリメートルのプラチナの正極を用いて、網膜電位を記録します。ステンレス製針の両方の電極を参照臀部に皮下に挿入。
   6. 2 kHzの取得速度と0.3-1,000ヘルツ（-3 dB）とのバンドパス設定で記録信号、（ADインスツルメンツ）。安定したERG記録が録音を開始する前に、被験者に10分の暗順応に動物を確立した後。
   7. 以前Brandliストーン²⁶で説明したように、フラッシュのプロトコルに従ってください。
      1. フラッシュの持続時間をプログラム（我々が点滅し、持続時間が1〜2ミリ秒を使用）、および-4.4ログスコットcd.sm ^-2〜2.0にその強度を設定します。網膜機能を測定するために明るいフラッシュ（2.0ログスコットcd.sm ^-2、1ミリ秒）を使用します。本研究では、制御、光傷害およびRIPの光損傷との比較です。

8. TUNELアッセイ

1. フェノバルビタールの過剰投与（100mg / kg）の腹腔内注射によって動物を安楽死させます。目を摘出し、4％パラホルムアルデヒド中で固定します。
2. cyroprotecting前にPBS中で目を洗ってください一晩スクロース30％（w / v）の中で目。 OCT化合物に目を埋め込み、クリオスタットを用いて20μmの矢状切片に切断。
3. Maslim らのプロトコルに従ってDAPI染色で網膜切片のTUNELアッセイを実行します^。27
4. 網膜のTUNELのカウントのために蛍光顕微鏡を使用してください。 TUNEL細胞は、外顆粒層（ONL）から記録しました。光受容体核を含んで網膜の最外層。本研究では、TUNEL数は、各処置群について5目で、それぞれの目のために三連で行いました。
5. 制御、光損傷および光傷害+ RIPラット群の平均を比較統計に一方向ANOVAを使用してください。

160 mmHgの上方に上昇した血圧カフは、 図1Bに明らかに見られるように、後肢への血流を停止します。組織酸素化の欠如は、虚血-再灌流プロトコル（ 図2）のために、動物の足の温度を低下させるが得られました。足の温度（33℃）は、コア温度よりも低くかつ確実にカフ圧の上昇（31°C）、カフが収縮したときに上昇（32℃）の間に減少しました。単一千ルクスの光損傷は遠隔虚血プレコンディショニングの有無にかかわらず上昇アルビノラットを暗くするために送達されました。網膜機能を記録し、電（ERG）を用いて評価しました。

ERGは、 図3に示すように、光刺激に網膜の内側及び外側の神経細胞に由来する電気的応答の合計である。ERG波形が光伝達（最小ガーゼ後の約10ミリ秒から生じる初期の負のピークを有していますTフラッシュ）内網膜（光フラッシュ後の最大約80ミリ秒）からA波と大きな正のピークと呼ばb波と呼ばれます。通常の薄暗いから暗順応ERGは、ラットは明るい2.0ログcd.sm -2フラッシュ（ 図3A）に大きな感光体と内網膜反応を示した上げました。一週間の光損傷後のERG記録は光受容体の損失を反映して、コントロールと振幅の相対で深刻な減少がありました。 図3Bを参照してください。虚血は、光損傷から感光体を保護する直前の2×5分間の再灌流プロトコルを使用して、虚血後肢をプリコンディショニング。 RIP ERG振幅はA波を参照してください（ 図3C）にわずかに低下して、単独の光損傷よりも大きかったです。網膜の凍結保存されたセクションでのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識（TUNEL）アッセイRIP REL受光損傷した動物におけるアポトーシス細胞の減少を確認しましたするative偽処理光損傷動物（ 図4）。

図1に見られるように後肢に虚血の誘導は、カフの正しい配置に依存している。「膝」の下方に配置されたカフは、光損傷から感光体を保護しない減少ERG振幅に反映されるように、 図3Dは、参照してください。

結論として、投与されたときに正しく後肢虚血は、光損傷から網膜神経細胞を保護することができました。

図1：カフの配置および160 mmHgの上記カフ圧の効果は（A）カフ圧上昇の前後肢足を表示します。 （B）は 160 mmHgで、上記カフ圧の上昇の間に足を表示します。 「Kの上にカフの位置に注意してください。旧姓"。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図2：足の温度はカフ膨張中に低減される虚血中に皮膚温低下し160 mmHgので2×5分間の後肢のカフの膨張。 （A）2×5分のRIP足の温度変化のグループの平均を表示します。 （B）は 2×5分間の虚血のトレース（C°）代表足の温度を表示します。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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図3：光損傷ラットに比べERGで示されているようにRIPは網膜機能を維持し 、24時間の損害網膜の光受容体のための明るい光への露出を。 ERGは、光刺激に対する電気的応答（マイクロボルト[μV]）のように内側と外側の網膜の健康を測定します。 2.0ログcd.sm -2（A）に見られる光刺激に対する正常な網膜応答。小さ ​​いERG振幅（B）で明るい光の結果から、感光体の損傷。 RIPは、光損傷（C）以下の光受容体を救出することができました。 RIP時に間違ったカフの配置は、傷害（D）から感光体を保護することはできません。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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図4：TUNEL +細胞数。光損傷、傷害+ RIPのグループの結果を比較した棒グラフは、網膜（8,000ミクロン）の全スパンを横切ってカウントしたRIP。TUNEL +細胞にアポトーシスの減少を示しています 。上部パネル：TUNEL +細胞群の平均は、RIP処理されたラットのために低かった（210±4.9、n = 5）を単独で光損傷に比べて（255±10、n = 5）で、P <0.01、一元配置分散分析。損傷を受けていない網膜（無光損傷）が非常に低いいた（3.0±1.4、n = 5）でアポトーシス細胞。 （A）優れた光損傷した網膜の代表画像。 （B）、優れたRIP-光損傷した網膜の代表画像。 （C）劣っ光損傷した網膜の代表画像。 （D）劣っRIP-光損傷した網膜の代表画像。 これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。

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