開発 in vitroでモデル系エクウス caballusのIgE

Summary

現在の研究は、ウマのFcεRIα遺伝子を持つラット好塩基性白血病細胞のトランスフェクションに基づく遺伝子操作アッセイシステムの開発と応用を説明しています。トランスフェクションされた細胞は、アレルギー反応のメディエーターの放出がIgEと抗原によって活性化される機能的な受容体を発現します。

Abstract

IgEとその高親和性Fc受容体（FcεRI）との相互作用とそれに続く抗原性チャレンジは、IgE媒介性アレルギー反応の主要な経路です。IgEとFcεRIの間の高い親和性結合とB細胞によるIgEの連続的な産生の結果として、アレルギーは通常生涯を通じて持続し、現在のところ恒久的な治療法はありません。馬、特に競走馬は一般的に近親交配されており、哺乳類の一種であり、過敏反応を発症する傾向が非常に強く、パフォーマンスに深刻な影響を与える可能性があります。馬のアレルギー感作に対する生理学的反応は、人間と犬で観察されたものを反映しています。この論文では、ウマ系に関連するアレルギー反応のメディエーターの放出を定量的に評価するためのin situアッセイシステムの開発について説明します。この目的のために、ウマFcεRIαをコードする遺伝子を親ラット好塩基球白血病(RBL-2H3.1)細胞にトランスフェクションし、表面上に発現させました。トランスフェクションされたウマα鎖の遺伝子産物は、内因性ラットβ鎖およびγ鎖¹と機能的な受容体複合体を形成した。得られたアッセイシステムは、ウマIgEによる感作および抗原チャレンジ後のウマFcεRIαトランスフェクトRBL-2H3.1細胞から分泌されるメディエーターの量の評価を容易にしましたβ-ヘキソサミニダーゼ放出を読み取り値として使用します2^、3。メディエーターの放出は、抗原の100 ng ^ml-1で36.68%±4.88%でピークに達しました。このアッセイは、ヒトおよびイヌのアレルギー反応の研究に使用された以前のアッセイから改変された^{ものである4, 5}。また、このタイプのアッセイシステムは、診断ツールの開発やアレルギー疾患における潜在的な治療介入戦略の安全性評価に複数の用途があることも示しました^6、2、3。

Introduction

アレルギーは、数千年前から知られている。喘息治療はエーベルス·パピルス（〜1550 BCE）として知られている古代エジプトの医学のテキストで説明して^7を治療するための薬草療法を検討した。

今日アレルギーはTヘルパー細胞2型（TH _2）免疫系のアームはアレルゲンと呼ばれる、環境抗原に応答して、免疫グロブリンE（IgE）抗体の産生を操縦するI型過敏性反応、に分類される。 IgEの合成を高めるタバコの煙やディーゼル排気微粒子中の粒子がそうであるように、これらは^9、インターロイキン-4およびインターロイキン13 ⁸を含む一般的に免疫系の細胞と相互作用し、炎症誘発性サイトカインの合成および分泌を刺激する多様な物質である^10。

過去50年間で先進国におけるアレルギー症状の上昇はの効果の組み合わせに起因している「衛生仮説^」11によって提案されたように、TH ₂サイトカインによって支配プロファイルに対する免疫応答をシフトするために組み合わせる環境汚染物質、より衛生的な環境へのトレンド、。

上述したように、人間がアレルギーに悩まさ唯一の哺乳類ではありません。注目すべき馬と犬はまた、古典的なアレルギー反応を開発することができますし^、12の調査によると、人間のように、馬アレルギーは遺伝的要因と環境的要因に起因する、ことを示している。結果として、これらの動物は、一度臨床症状がで設定したアレルギーの遺伝的および環境的な原因、病気への感作からの進行、および可能な介入戦略との間の相互作用を研究するための優れたモデルを提示

1887年に、Stömmerは、馬の心血管系に対するヒスタミンの効果がある、人間と馬の喘息¹³の間の類似性を記述した最初の人だった人間¹⁴のものと非常に類似している。馬はまた、年間¹⁵米1150億ドルの賭け売上高は720億ドル、米国の価値がある競馬産業の礎である。

ほとんどの現代的な競走馬以降1878からレディアン·ブラントによって繁殖アラビア馬の数が少ないの子孫である。現代の競走馬は、一般的にパフォーマンス能力を選択するために近交系されている。彼らは、アレルギー反応をマウントするそれらの感受性であるそのうちの一つ、遺伝性疾患になりやすいです。彼らはまたも、最も深刻なアレルギー人間¹⁶よりも1000倍高い血清IgEレベルを持っている。馬アレルギー反応は、通常、虫刺され過敏症^{（IBH）17、18}として明示されている。IBH結果は皮膚炎に起因刺されに属ヌカカで昆虫を形成する。ウマのアレルギー性​​疾患の別の形態は、これは肺と気道で明らかにされて、再発性気道閉塞（RAO）である。それは、喘鳴やラボによって特徴づけられるOR演算呼吸。 RAOは、一般的に胞子を成形することに応答して発生し、別の調査がこの^20を確認していないが、高アレルゲン特異的IgEレベルは、一つの研究¹⁹にRAOに罹患している馬に記録された。

ウマアレルギーに関する研究の試みモニタリングにおける、および抗ウマのIgEモノクローナル抗体^{（mAb）21,22を}開発することによって、馬のIgEを中和することを中心に展開し、さらに²³による研究では、馬の高親和性Fc受容体のαの細胞外ドメインの生産を議論ウマ血清IgEを検出し、定量する試みで、チェーン（FcεRIα）受容体。 Ledin ²⁴による関連研究では、自己/非自己免疫原を使用して免疫系をプライミングすることにより、血清IgEを中和することを目的とした新しいアプローチについて説明します。すべてのこれらの研究は、しかし、それらのプロトコルの安全性と有効性を試験するための効果的なアッセイを欠いていた。この記事では、我々は今そのようなアッセイsysを提示βヘキソサミニダーゼ放出馬システム、関連する診断および治療戦略の研究に適用可能なTEMは、細胞メディエーターの脱顆粒の指標として、ウマFcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞で評価した。このプロトコルは、異なる種由来のIgEに対する高親和性受容体のIgE結合ドメインをコードする遺伝子でトランスフェクトしたRBL細胞の工学を記述する先の刊行物^{25、4、5、2、3}に基づいている。プロトコルは、結果は、三連の実験の平均値±標準偏差として提示されているβヘキソサミニダーゼ放出アッセイを実行する方法について説明します。

放出アッセイは、最初Siraganianによって開発され、人間のアレルギーを研究するために^25をフックした。博士ルーベンSiraganian率いる研究室グループは、RBL細胞株を開発した。これらのRBL細胞は、ヒトFcεRIαを表現するために開発され、プロトコルが⁴によって出版された。最後のピースアッセイのハプテン4-ヒドロキシ-3-を標的IgEの可変領域をマウス遺伝子の下流に、その重鎖遺伝子をクローニングすることにより、IgE抗体の産生を記載しノイバーガー²⁶の論文でのpSVプラスミドの開発に付属 - ニトロフェナセチル（NP）、得られたキメラ抗体は、完全に機能した。また、RBL細胞の表面上のその受容体をクローニングしながら、同じハプテンを対象とした全てのIgEを開発する能力は、好塩基球細胞の脱顆粒を測定するための有用なプロトコル作るアッセイの標準化をもたらした。

アッセイは、長所と短所を持っています。このアッセイの利点は、任意の哺乳動物系で使用される適応性である、我々の研究室は、ヒト、イヌおよびウマのシステムにおいて脱顆粒をテストするためにそれをこのように使用されており、これは、生物のIgEの合成およびその受容体をクローニングすることによって、単純に達成可能であるRBL細胞の表面上に。

一方、アッセイの短所は、RBL細胞は、それらを同じアッセイ内の脱顆粒のレベルの変化を与えること、熱的、機械とPH変化に非常に敏感であるということです。それは、このように強くアッセイは常に三重に繰り返された後、平均がそれらから取られることをお勧めします。また、RBL細胞は、彼らのメンテナンスが煩雑になっ、延長時間（> 10週間^）27組織培養で残っている場合、非放出表現型へシフトする傾向がある。彼らはまた、光学顕微鏡からは見えませんし、細胞の形態を変化させないマイコプラズマ細菌による感染症になりやすいですが、劇的に彼らの脱顆粒レベルを変更します。このように定期的なマイコプラズマ試験が必要とされている。

Protocol

細胞株の1）準備：

1. 馬のFcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞株の開発：
   1. 単層細胞株についての基本的な組織培養技術を用いて、pEE6プラスミドを使用して、親RBL-2H3.1細胞をトランスフェクト、ウマFcεRIα遺伝子（GenBank：Y18204.1）を有する^28。 1.2×10 ⁷細胞ml ^-1の濃度で細胞の0.8ミリリットルにプラスミドDNA2μgのμlの^-1を追加します。その後すぐに氷上で10分間インキュベート0.4cmのelectrocuvetteを使用して、250V、960μFで細胞をエレクトロポ。
   2. その後、蛍光IgE抗体とそれらをタグ付けすることによって、FACSを通して残りの生きた細胞をソートし、ジェネティシンG418硫酸0.4グラムを含む培地を使用して形質転換細胞を選択します。捜査^2、3のための馬FcεRIα細胞株を発現している結果としてRBL-2H3.1を使用してください。
2. プレ検定抗体感作性：
   1. 5細胞mlの細胞密度に培養培地中に再懸濁細胞を、その後洗浄する^-1。
   2. 1 ngのml ^-1の最終的な濃度に懸濁した細胞への関心のIgEを追加した列1-6で96ウェルプレートに100μlの細胞をプレートし、37℃+ 5％CO ₂ + 90％でインキュベート16時間、相対湿度。インキュベーション時間の後、および放出アッセイを行う前に、ウェルの集密度及び細胞接着のために顕微鏡下で、ウェルをチェックしてください。

2）放出アッセイ：

1. 細胞を洗浄する。
   1. 穏やかな細胞洗浄を可能にするために、37℃の温放出緩衝液（25mMのPIPES、120mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カリウム、0.04 mMの塩化マグネシウム、および1mM塩化カルシウム）。
   2. 、細胞培地を除去するためにプレートをフリックと暖かい100μlを加えることにより、細胞を洗浄37℃で、放出緩衝液。二回繰り返します。
2. 抗原チャレンジ：
   1. 0.1、0 ngのmlと^-1の抗原の段階希釈（NIP-HSAまたはDNP-HSA）を調製NGミリリットル^-1、1 ngのmlで^-1、10 ngのmlを^-1、100 ngのmlで^-1、千ngのミリリットル^-1 10,000 ngのリリース·バッファ内ミリリットル^-1および37℃で温めて。
   2. 第二の細胞の洗浄後、メディアを破棄し、抗原溶液100μlで置き換え。同じ行のウェル（例えばA1-6）が同じ抗原濃度がそれらに追加されていることを確認してください。
   3. 0 ngのml ^-1の抗原を添加することにより、行Aにおける負の制御を設定します。陽性対照として使用する細胞を溶解するために、行H細胞におけるトリトン緩衝液（5％トリトンX-100）に続く行（BG）ダウン増大抗原濃度を追加する。細胞がそのメディエーターを放出できるように20分間37℃でインキュベートする。
3. 個々のウェルコントロールの設定：
   1. インキュベーション後、プレートのもう半分（井戸A1-6井戸A7-12へ、等）への細胞上清50μlを移す。上清の残りを50μlを破棄して、列1-6のセル内の全メディエーターの割合として列7-12に各ウェルにリリースメディエーターの量の測定を可能にするためにトリトン-X緩衝液50μlと交換。
4. 酵素基質：
5. 50（クエン酸緩衝液に添加することにより2mMのにまで希釈されたDMSO中で調製した50 mMの4-ニトロフェニルN-アセチルβ-Dグルコサミニド0.2 Mクエン酸、0.2 M酢酸ナトリウム、pH 4.5）βヘキソサミニダーゼ基質のμlを添加するすべてのウェルにβヘキソサミニダーゼ酵素による4-ニトロフェノールへの基質の変換を容易にします。 2時間、37℃でプレートをインキュベートする。

5. 反応を停止する。
   1. 各追加150μlのトリス緩衝液（1 Mトリス-HCl、pHを9）により反応を停止ならびに緩衝液の高いpHは、反応を停止させ、黄色に4-ニトロフェノールをオン。
6. 結果を読み込むと分析する：
   1. 黄色の吸光度を測定するために405nmでプレート分光光度計を用いてプレートをお読みください。以下の式を用いて放出βヘキソサミニダーゼの割合を算出した。

2. 平均値を行ごとに取得された後、各ウェルにこの数式を適用します。 A1およびA7が96ウェルプレートのウェルの位置を表す。 agai（総メディエーター放出に相当）βヘキソサミニダーゼ放出の割合のグラフをプロットします抗原濃度^2,3 NST。

Results

親RBL-2H3.1細胞およびウマFcεRIα受容体遺伝子でトランスフェクトされたものが最初にマウスIgE抗DNP-HSAで感作し、DNP-HSA抗原でチャレンジした。マウスIgEは、両方の細胞株における内因性ラット受容体に結合し、したがってメディエーター（ 図1 A）を放出するために、両方の細胞株の放出生存度を試験するための対照として働く。これは重要な検査であり、細胞培養における延長（> 10週間）経過時に、RBL-2H3.1細胞を非分泌表現型²⁷に向かってドリフトするので、日常的に行われるべきである。馬FcεRIα受容体を発現する細胞は、5.76パーセント±45.99パーセントのピークメディエーターの放出を有していた親細胞が、4.79パーセント±51.54パーセントのピークメディエーターの放出を支持した。その後馬のIgE抗NIP-HSAで感作し、NIP-HSA抗原（ 図1B）でチャレンジし、これらの同じ細胞株。親細胞があるので、メディエーター遊離を受けなかった馬IgEは、内因性ラット受容体に結合しない。馬のIgE抗NIP-HSAで感作し、...

Discussion

要約すると、この調査の結果は、馬FcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞は馬のIgEで感作し、抗原によって挑戦されたとき、彼らは内部のメディエーターの合計量の4.88パーセント±36.68パーセントのピークメディエーター放出を与えることを示した馬FcεRIαを発現していないRBL-2H3.1親細胞に比べて細胞、。

したがって、このアッセイは、in vitroでの馬のアレルギー反応を調査し、研究するための有用なツールを提供します。そのことができ、従って、肥満細胞/好塩基球系統の細胞によって放出さメディエーターの量の測定は、アレルギーを引き起こす物質を評価すること、またはIgE /受容体遮断薬を研究するかどうか、馬アレルギーの研究を進めることが期待できる。

このアッセイは、同じ目的のためにヒトおよびイヌのアレルギー^4529を研究するためにそれを使用して、以前の出版物からの馬のアレルギーを研究するために変更されました。操作された細胞株人間と犬のFcεRIαを表現sがこのようなIgE /受容...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1馬Fc&epsilonを発現する;RIα	-	-	実験室で生産
馬IgEの反NIP-HSA	-	-	実験室で作り出
96の井戸の版	のΣ	CLS3595	-
多チャンネルのピペット	Anachem	-	-
インキュベータ	ーギャラクシーR	-
-4Hydroxy-5-ヨード-3-ニトロフェニル酢酸	ケンブリッジの研究の生化学	N-1070-1	NIP-OHは、実験室でNIP-HSAを作るためにヒト血清アルブミンと結合された
ジニトロフェニル ヒト血清アルブミン	シグマ	A6661	略称DNP-HSA
プレート分光光度計	Anthos Labtec HT2	-
パイプ	シグマ	P1851	-
塩化ナトリウム	グマ	S7653	-
塩化カリウム	シグマ	P9333	-
塩化マグネシウム	シグマ	M2670	-
塩化カルシウム	シグマ	C1016	-
トリトン x100	シグマ	X100-4
-ニトロフェニル N-アセチル -&β;-D-グルコサミニド	シグマ	N9376	「ヘキソサミニダーゼ」というストック溶液は、DMSO
ジメチル スルホキシ	シグマで調製された 50mM でした	D2650	-
クエン酸	シグ	マ251275	-
酢酸ナトリウム	シグマ	S7670	-
トリス	シグマ	T5941	-