エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

サマリー

私たちは、胚マウスの内耳からの蝸牛外植片の分離と培養を説明する方法を提示します。 また、方形波エレクトロポレーションによる蝸牛外植片への遺伝子導入法も示しています。in vitro外植片培養と遺伝子導入技術を組み合わせることで、研究者は発生中の遺伝子発現の変化の影響を研究することができます。

要約

コルチのマウス器官内にある聴覚有毛細胞は、音の情報を検出し、中枢神経系に伝達します。機械感覚有毛細胞は、蝸牛の基底軸から頂端軸に沿って伸びる1列の内有毛細胞と3列の外有毛細胞に整列しています。ここで説明する外植片培養技術は、胚性マウスの内耳から蝸牛外植片を分離し維持するための効率的な方法を提供します。また、蝸牛外植片培養物内の感覚有毛細胞および非感覚支持細胞の形態および分子特性は、in vivoで観察されたものと類似しており、その固有の細胞環境内で研究することができる。蝸牛外植片は、細胞の仕様化とパターニングに関与する分子経路と遺伝経路の同定と特性評価のための重要な実験ツールとして機能します。トランスジェニックマウスモデルは遺伝子発現研究に有効なアプローチを提供しますが、かなりの数のマウス変異体が胚発生中に死滅するため、発生表現型の解析と解釈が妨げられています。出生前に死亡した変異マウスのコルチ器官を培養することで、in vitroでの発達やさまざまな因子に対する応答を解析することができます。さらに、特定の遺伝子をダウンレギュレートまたは過剰発現し、それらの潜在的な内因性機能を分析し、特定の遺伝子産物が哺乳類の蝸牛の発生に影響を与えるために特定の状況で必要または十分であるかどうかをテストするために使用できる、胚性蝸牛外植片をex vivoでエレクトロポレーションする技術について説明します^1-8。

概要

コルチの哺乳類器官は、2種類の機械感覚有毛細胞と少なくとも4種類の非感覚支持細胞を含む特殊な細胞型のモザイクで構成されており、増殖、運命指定、分化、パターニングなどの正常な細胞プロセスを研究するための理想的なモデルシステムとなっています。さらに、これらの異なる細胞タイプの正常な発達は、正常な聴覚機能に不可欠です。したがって、それらの発生を調節する分子的および細胞的要因を理解することが重要です。しかし、マウスの蝸牛のサイズが小さいことや、そのアクセスのしやすさが、遺伝子発現研究において特に課題となっています。さらに、細胞の運命指定とパターン化イベントのほとんどは、胚の期間中に発生し、ほとんどが出生前に完了します。したがって、胚期のシグナル伝達イベントの同定と特性評価は、蝸牛の形態形成の分子基盤についての洞察を得るために不可欠です。

ここでは、胚マウスの内耳から無傷の蝸牛をin vitroで培養する方法を実演します。この技術を使用する根拠は、培養された蝸牛がその分子的および形態学的特性を維持し、それによって潜在的な候補遺伝子を調査し、蝸牛の形態形成に関与するメカニズムを調査するための貴重なモデルを提供するということです。トランスジェニックマウスは遺伝子発現研究に使用できますが、特定の遺伝子機能のモニタリングにはin vitroシステムが必要になることがよくあります。さらに、トランスジェニックマウス胚から蝸牛培養を確立することができるため、それらのin vitro発生およびさまざまな可溶性因子およびアンタゴニストに対する応答を研究することができます。このプロトコルでは13日目(E13)の胚が使用されますが、E12またはE14から出生後初期の内耳までの培養でも同様の結果が得られる可能性があります。

私たちはまた、矩形波エレクトロポレーションを用いた培養胚性蝸牛外植片における遺伝子導入技術も紹介します。蝸牛外植片の単離後、エレクトロポレーションを使用して、蝸牛管内の個々の細胞で目的の遺伝子のDNAプラスミドを発現させることができます。この手法は、トランスジェニックマウスを用いた研究を補完するアプローチとして、細胞表現型の根底にある分子経路についての洞察を得ることができます。この遺伝子導入法を用いて、胚性蝸牛内のさまざまな種類の上皮細胞をトランスフェクションすることで、シングルセルレベルでの機能喪失および機能獲得の解析が可能になります。さらに、電気生理学的研究は、蝸牛外植片培養でも実施することができる⁸。このin vitroエレクトロポレーションの方法は比較的単純で単純であり、組織への損傷が最小限に抑えられているため、この技術が急速に拡大しています。

プロトコル

注：生きた動物を使用するすべてのプロトコルを見直し、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、実験動物の管理と使用のために公式に承認された方法に従わなければなりませんしなければなりません。すべての解剖清浄な層流ベンチで滅菌技術を使用して行われるべきである。手袋とマスクは、必要に応じて、この手順の間に着用してください。

マウス胎児インナーイヤー1.解剖

1. コルチ植片培養のオルガンのためのセットアップ：
   1. 約30分間、UV光をオンにすることによって、層流組織培養フードを滅菌し、使用前に70％エタノールで表面を消毒する。また、オートクレーブを介して、または、使用前に少なくとも20分間、70％エタノールに浸漬することによって、胚の解剖のための細かい解剖ツールとシルガードコーティングされた料理など、すべての解剖器具を滅菌する。 70％エタノールをオフに注ぎ、料理や楽器がきれいな層流CLEAで空気乾燥することができますn個のベンチ使用前。
   2. 準備無菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）/（4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸）、HEPES 10×HBSSおよび0.5％の10％を添加し、約7.2にpHを調整し、フィルター滅菌することにより（HEPES）混合4℃での最終溶液とストア。より良い作業中は組織を維持するために冷やしたHBSS / HEPES溶液中のすべての解剖を行ってください。
   3. 基底膜マトリックスで被覆ガラスボトムディッシュの滅菌15mlのポリプロピレンチューブ中の基底膜マトリックスの300μlのアリコートを冷（4℃）滅菌ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を5ml加えることによって。内容をボルテックスで混合し、それは皿の中央にも存在する全体の文化を覆うように、各培養皿の中心に基底膜マトリックス-DMEM混合物の150μlを添加する。使用前に少なくとも45分間37℃のインキュベーター中で料理や店舗をカバーしています。
   4. 目にHBSSを冷やし4〜5ミリリットルを注ぐREE無菌ポリスチレンペトリ皿やフード内に閉じたまま。
   5. DMEMの9ミリリットル、N2サプリメント100μlの、10グラム/ mlのシプロとFBSの1ミリリットルを追加することにより、滅菌15ミリリットルポリプロピレンチューブに培養液を準備します。
2. 胚の単離：
   注：胚のマウスから蝸牛外植体を培養するこの手順では、収穫内耳日胚（E）から13頭骨E1 ⁹として検討されて受精後の日と。プロトコルは、E12からE18に始まる胚性マウス内耳と一緒に使用することができる。
   1. 頸椎脱臼または適切な承認されたプロトコルによってCO ₂と犠牲動物と時限妊娠マウスを安楽死させる。組織培養室で、無菌性を維持するために、離れた層流の組織培養フードから安楽死を実施する。
   2. 上に向けて腹部をペーパータオルに安楽死させたマウスを置き、70％エタノールで腹部を消毒する。
   3. 皮膚をつかんによって腹腔を開き別の手を使用してハサミで正中線に沿って湾曲した一方の手で鉗子とカット表皮と筋肉と。両側の2つの垂直なカットを作成し、慎重に子宮を引き出す鉗子で二国間の子宮角を持ち上げて、ハサミを使って結合組織の下からそれを切り離す。
   4. チルド解剖溶液（HBSS / HEPESの混合物）と層流クリーンベンチへの転送を含むペトリ皿に胚チェーンを配置します。
   5. 胎盤から慎重に胚を取り出し、解剖液を含む滅菌ペトリ皿の1にそれらを配置します。解が血まみれになった場合、新たなペトリ皿に移動します。
      注：この時点で、胚はタイラーステージングガイドを使用して上演することができます。
   6. 清潔な鉗子やハサミで首領域でつまんで胚を斬首し、チルド解剖溶液を含む新鮮なペトリ皿に頭を置く。
3. 内耳の解剖：
   1. 置きO冷たい解剖を含む滅菌シルガード皿の中のNE胚ヘッド
   2. ソリューション。 〜1.6倍の倍率で解剖顕微鏡の下で働く、Minutienの周りにピンまたは眼の領域（ 図1A）に近くに配置することによって、胚の頭部を固定する。
   3. 滅菌ピンセット二組を使用すると、慎重に皮膚を除去し、正中線（ 図1B）に沿って背側の頭蓋骨を開く。頭蓋腔から脳を取り出し、側頭骨内にある内側の耳は、この段階で識別することができます（ 図1C、D）。通常、内側の耳の周りに存在する血管のライニングは、この段階（ 図1D）で内耳を識別するための目印として使用することができる。
   4. 組織の下に鉗子を配置し、冷解剖溶液を含む新しい皿に頭蓋骨転送のベースから内耳を単離することによって側頭骨から内耳を分析（ 図1E、F）。

オルガンコルチ植片の培養の2世代

注：開発のこの段階では、組織は軟骨であり、容易に鉗子を用いて解剖することができる。

1. オリエント内耳腹側は、（ 図2A）を上に向け、静かに内耳（ 図2B）の前庭部分を通ってMinutienピンの鋭い端を挿入することにより、内耳の安定化されるように。
2. 超微細鉗子を使用すると、楕円形の窓の近くに鉗子の一端を使用して切開を行うことによって、上にある軟骨を開き、カットし、慎重に蝸牛（ 図2C）から軟骨を取り除く。
   注：これは、その上の軟骨が、時にはそれが下にこすることによって、基礎となる蝸牛管から軟骨を解放するために、閉じた鉗子を使用すると便利である場合には、蝸牛管と融合されているように鉗子が軟骨にあまりにも深く挿入されていないことを確認することが重要ですS軟骨のurface。開発のこの段階では、蝸牛のらせんの長さは、ターンの唯一の四分の三である。
3. 次に、ベースまたは非常に頂点のいずれかで、蝸牛管の好ましい領域で鉗子を配置することによって感覚上皮を公開、そして優しく蝸牛（ 図2D）の屋根を引き出す。
   注：それは分析を妨害感覚上皮をマスクすることができるように蝸牛の屋根が完全に除去しなければならない。
   注：それは感覚上皮を引き裂くことは容易であるように、この手順を静かに行う必要があります。
4. 蝸牛外植片のベースが一様に平らになるように、最後のステップとして、慎重にさらさ感覚上皮から下にある結合組織を除去。
5. ピンセットを用いて、内耳の前庭部分から解剖蝸牛を分離します。これは、（ 図2E）の前またはステップ2.4の後に行うことができる。
6. 地下membraに解剖蝸牛感覚上皮を転送よく1.5ミリメートル無菌すくう（ 図2F）を使用して、NEマトリックスでコーティングされた文化。
7. オリエントは、上皮の内腔表面を持つ蝸牛外植片が上に向け、慎重に組織をフラット化し、静かに皿に追加することによって、新鮮な培養培地150μlでそれを置き換えるために基底膜マトリックス-DMEM溶液を吸引。注意が各植片がコーティングされたガラスカバースリップによく付着し、培養液中に浮遊していないことを確認するために注意する必要があります。蝸牛外植片の損傷を防ぐために、ガラスウェルに貼付しながら、鉗子の先端がアップ指摘されていることを確認してください。
8. 穏やかに所望の期間、 インビトロでの 、通常3-6日間（DIV）、5％CO _2、37℃で組織培養インキュベーター中で無菌の150mm培養皿、所定の位置に培養皿に移す。 1 DIVの後、蝸牛外植片を培養皿によく付着していることを確認するために解剖顕微鏡下での文化を調べます。
9. イン後時間の所望の長さのために、in vitroで cubationは、培養物を免疫組織化学のために処理される。
   注：植片培養は通常の発達段階、P0と同等である6 DIVインキュベートする。 インビトロでのインキュベーション後、培養物を、in situハイブリダイゼーション 、および/ ​​またはウェスタンブロットにおいて 、免疫組織化学（ 図3B）、RT-PCRのような更なる下流の適用のために処理することができる。

3.エレクトロ媒介遺伝子導入

1. エレクトロポレーションのためのセットアップ：
   1. 約20分間、70％エタノール中でオートクレーブ処理または浸漬ずつ100ミリメートルのSylgard被覆ガラス皿を滅菌し、使用前にクリーンベンチ内で空気乾燥させ。
   2. 適切な最大またはミディプレップキットを使用して、選択した発現ベクターからDNAを準備します。このプロトコルで使用される発現ベクターは、たpIRES2-Atoh1.EGFPとpCLIG-NeuroD1.EGFPです。 DNAの最終濃度は、無菌のDNA中に少なくともを1μg/μlのあるべき/RNaseフリー水。
2. 胚性蝸牛外植片にDNAをエレクトロポレーション：
   1. 新鮮な100ミリメートルのシルガードコートディッシュにプラスミドDNA溶液10μlを加え、DNA溶液に（ステップ2.5から得た）完全に解剖蝸牛外植片を移す。
   2. それは皿の面に垂直だように、上向きに上皮の管腔表面では、わずかに蝸牛を傾ける。
   3. 感覚上皮と蝸牛のベースに隣接して配置された正パドル（アノード）に向かって負のパドル（カソード）との蝸牛の両側に電極パドルを置きます。
      注：DNAが負に帯電しているので、それが負から正極に、感覚上皮に隣接するプローブのカソード端を配置することによって移行し、 DNAは、主に感覚上皮の表面を通過します。
   4. エレクトロを使用して、トンで24 mVでの9~10パルス、フットペダルスイッチと30ミリ秒のパルス持続時間を提供彼エレクトロ、その後にエレクトロ蝸牛に暖かい培養培地100μlを追加。
   5. 繰り返しますが、すべての蝸牛外植のために、目的のすべての遺伝子のDNAに対する3.2.1-4ステップと、（ステップ2.7）をめっきするための基底膜マトリックスコートディッシュにエレクトロポ蝸牛を移す。その後、免疫細胞化学のために処理される時間の所望の長さのために37℃、5％CO ₂の加湿インキュベーター中で培養すべてのエレクトロポ蝸牛。
      注：CD1マウス（約8〜12匹）の全体のごみから蝸牛は、孤立顕微解剖、エレクトロポレーションおよび<4時間でめっきすることができる。

4.分析蝸牛外植片の文化

注：培養物は、通常の発達段階、P0と同等である6 DIVインキュベートする。 インビトロでのインキュベーション後、培養物を固定し、免疫細胞化学のために処理した。

1. 株式会社の所望の長さの後にubation、培地を除去し、すぐにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の蝸牛外植片をすすぎ、室温で15分間（PBS中で調製）を4％パラホルムアルデヒド中でインキュベートする。
2. PBSを加えることによって固定液を洗浄し、15分間PBSで3回リンス。
3. 10％ヤギ血清を含むPBS-Tでブロッキングする前に、30分間、PBS-T（PBS + 0.5％のTween）を用いて透過性。
4. 4℃で一晩、1％ヤギ血清を含むPBS-T中で一次抗体を含む一次抗体溶液中でインキュベートする。
5. 適切なアレクサ結合二次抗体を加える前に、各PBS-Tの15分を使用して室温で蝸牛を3回洗浄します。
6. 蝸牛外植片、ガラスカバースリップ上で培養しているので、それは皿からカバースリップを分離し、スライド上に取り付けることにより、個別に処理することができます。これは、室温で少なくとも1時間OS30溶媒中​​で培養皿を浸漬することによって達成することができる。無菌のカミソリの刃を使用して、dからカバースリップを切り離すISHとスライド上にマウントし、蛍光顕微鏡下で可視化する。

結果

胚の内耳から蝸牛を分離し、感覚上皮を露出させるためのマイクロ解剖の方法を説明します。解剖後、無傷の蝸牛管としてプレーティングおよび培養し(図3)、免疫組織化学によって分析することができます。培養された蝸牛外植片は、さまざまな可溶性因子や薬理学的薬物が蝸牛の発生に及ぼす影響を調べるための有用なアッセイを提供します。蝸牛外植片の解剖後、エレクトロポレーション技術を使用して、目的の遺伝子を誤って発現させ、それらが蝸牛の形態形成に及ぼす影響を調べることができます。本研究の結果は、E13内耳から樹立された培養蝸牛外植片に塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス(bHLH)転写因子Atoh1を強制発現させることで、異所性有毛細胞の形成につながることを示しています。対照的に、別のbHLH転写因子であるNeuroD1がGER内の前感覚細胞および非感覚上皮細胞に強制発現すると、異所性ニューロンが形成されます。

ディスカッション

、感覚非感覚と螺旋神経節ニューロンを含むマウス内耳の膜迷路内のすべての細胞はすべてE8 ^10-14の周りに、外胚葉の後脳に隣接して位置placodally由来の耳胞に由来している。 E11で、耳胞の腹側領域は蝸牛管を形成するように延びており、開発が進むにつれて、となる蝸牛内の上皮細胞、ならびに内耳胞の他の領域群は、その後に生じさせるprosensoryパッチとして指定機械感覚有毛細胞および非感覚支持細胞の異なるタイプ。現像蝸牛内、内有毛細胞および外有毛細胞の3つの行の一つの行にE15.5の周り及びE17により同定することができる、パターニング内有毛細胞、柱細胞および外有毛細胞の3つの行の単一の列を有する本質的に完了する。蝸牛管は、最初E17を通してDIFのすべてを成長を開始E11からまたがる時間の期間ではferent細胞運命決定とパターニングは有毛細胞と支持細胞の正常な補数との印象的な携帯パターンを生成するために開発上皮内で発生する。有毛細胞および/または支持細胞の損失は、聴覚障害の主要な原因である。これらの細胞型は、胚発生の間に、かなりコンパクトな期間中にのみ生成されるので、再生戦略に重要な洞察をもたらすはずで...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
ダルベッコ'S Modified Medium	Gibco	12430-054
Fetal wevine serum	Gibco	10082
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
Ciprofloxacin hydrochloride	Cellgro	61-277-RF
Glass Dish 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Glass Dish 100 mm	Kimble Chase	23064-10015/23062-10015
Minutienピン	ファインサイエンスツール	26002-15
デュモン#5鉗子	ファインサイエンスツール	11251-10
パルス発生器	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
ガラス底培養皿	MatTek	P35G-0-10-C
マトリゲル基底	BD バイオサイエンス	356237
培養皿、60 x 15 mm	ベクトン・ディキンソン	353037
組織培養皿	Greiner Bio-one	639160
リン酸緩衝生理食塩水	Gibco	10010-023
OS-30	ダウ・コーニング	4021768
フルオロマウント	・サザン・バイオテック	0100-01
コニカルチューブ、15 ml	Greiner Bio-one	188261
Myosin 6	Proteus Biosciences Inc	25-6791
Myosin 7a	Proteus Biosciences Inc	25-6790
TuJ1	Σ	T2200