方法論記事

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

DOI：

10.3791/52266

⸱

2015年1月28日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society

この記事について

サマリー

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細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。

要約

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タンパク質の安定性は、生物学の多くの側面に影響を与える、タンパク質のクリアランス速度を測定することは、生物学的システムへの重要な洞察を提供することができる。 FDAP実験では、生物内のタンパク質のクリアランスを測定することができる。目的のタンパク質は、photoconvertible蛍光タンパク質でタグ付けされ、インビボで発現され、photoconverted、経時photoconvertedシグナルの減少がモニターされる。データは、その後、タンパク質の半減期を決定するための適切なクリアランスモデルが取り付けられている。重要なのは、生物の異なる区画におけるタンパク質の集団のクリアランス動態コンパートメントマスクを適用することによって、別々に検査することができる。このアプローチは、ゼブラフィッシュの開発中に分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞内および細胞外の半減期を決定するために使用されてきた。ここでは、ゼブラフィッシュ胚におけるFDAP実験のためのプロトコルについて説明します。それのクリアランス速度を決定するFDAPを使用することが可能であるべきであるすべての光学的にアクセス可能な生物内の任意のタグ付けタンパク質。

概要

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細胞および生物中のタンパク質のレベルは、製造及びクリアランス形成速度によって決定される。タンパク質半減期は数分から数日1-4の範囲とすることができる。多くの生物学的システムでは、重要なタンパク質の安定化またはクリアランスは、細胞活性に重要な影響を有している。細胞内のタンパク質の安定性の調節は、細胞周期の進行5,6、発達シグナリング7-9、アポトーシス10、および正常な機能およびニューロン11,12の維持に必要である。細胞外タンパク質の安定性は、組織内のモルフォゲン13,14、などの分泌タンパク質の分布と可用性に影響を与えます。

過去数十年にわたって、タンパク質の安定性は、主に放射パルス標識またはシクロヘキシミドチェイス実験15を使用して、細胞培養において評価されている。このようなパルスチェイス実験において、細胞を一過放射性アミノ酸の「パルス」に露出されている新たに合成されたタンパク質に組み込まれているか、又はそれらは、タンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド、にさらされている酸前駆体。培養された細胞は、その後の異なる時点で、そしていずれかの免疫沈降は、（放射パルスチェイス実験において）、続いてオートラジオグラフィーまたはウェスタンブロッティング（シクロヘキシミド実験で）収集され、経時的タンパク質のクリアランスを定量化するため....

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プロトコル

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1. Photoconvertible融合構築し、ジェクトする絨毛膜を​​除去ゼブラフィッシュ胚の生成

  1. ミュラーらのように、融合タンパク質をコードするキャップされたmRNAを生成するために、インビトロ転写を使用し、その後、（説明を参照）緑色〜赤色photoconvertibleタンパク質に融合された関心対象のタンパク質を含有する機能性構築物を生成する。、2012 19。
  2. 1細胞期で約30ゼブラフィッシュ胚から絨毛膜を除去するためのプロナーゼを使用してください。あるいは、手動で鉗子28を使用して胚をdechorionate。
    注：胚は、その後の画像化のために絨毛膜を除去する必要があります。所望ならば、胚は、撮像直前に、後で絨毛膜を通して注入及び絨毛膜を除去することができる。
    1. 標準のゼブラフィッシュ胚培地19中でストレプトミセス·グリセウスからプロナーゼの5mg / mlのストック溶液を作る。プロテアーゼを溶解させるために室温で10分間静かに解決策を揺する。アリコート2メートル-20℃でマイクロチューブにLと凍結。
    2. 〜8ミリリットル胚培地を含む直径5cmのガラスまたはアガロースでコーティングされたプラスチック製のペトリ皿に移し1細胞期胚。皿に解凍した....

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結果

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FDAPはゼブラフィッシュ胚19における細胞外シグナル伝達タンパク質の半減期を決定するために使用されてきた。これらのタンパク質のいずれか、スクイントは、胚形成34中胚葉遺伝子の発現を誘導する。目を細め-Dendra2は定量RT-PCRによっておよびin situハイブリダイゼーションアッセイ19 で示したように 、タグの付いていない目を細め同様のレベルで中内の遺伝子の発現を活性化する。胚のAlexa488デキストランおよびmRNAはスクイント-Dendra2をコードするとFDAPアッセイに供と共に同時注入した。経時的な細胞外photoconvertedシグナル強度の減少が明らかである（ 図4A）。 23の胚からの細胞外強度プロファイルはPyFDAPを使用して生成された。得られたデータは、一次クリアランス動態をPyFDAPに装着し、そして116分間の平均半減期τに ​​対応する1.00×10 -4 /秒の平均クリアランス速度定数kは 、決定された.......

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ディスカッション

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FDAP実験の成功は、機能的なphotoconvertible融合タンパク質の生成に依存している。タンパク質をタグ付けすると、その局在性、溶解性、および安定性36-41を含む、その生物学的活性および/ ​​または生物物理学的特性に影響を与えることができる。アクティブなものを見つけるために、いくつかの異なる融合構築物の活性を試験するために調製すること。本発明者らは、目的のタンパク質にphotoconvertibleタンパク質の位置を変更したり、より長いリンカーを用いて（ 例えば 、アミノ酸配列LGDPPVAT 19を使用して）融合タンパク質の活性を増強することができる。シグナル伝達タンパク質の場合には、融合タンパク質の活性は、標的遺伝子の19の発現を誘導する能力を試験することにより決定することができる。定量RT-PCR、またはin situハイブリダイゼーションは、標的遺伝子の発現19の良好な読み出しを提供する。ここで説明するプロトコルは、タンパク質の安定性を決定するために設計されていることに注意.......

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開示事項

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著者らは、開示する競合がない。

謝辞

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著者は、原稿上のコメントジェフリー·ファレル、ジェームズガニオン、そしてジェニファーバーグマンに感謝したいと思います。 KWRはFDAPアッセイの開発中に国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによってサポートされていました。この作品は、AFSへとPMにドイツ研究財団（エミー·ネータープログラム）、マックス·プランク協会、とヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム（キャリア開発賞）からの補助金によってNIHからの助成金によってサポートされていました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
PyFDAP(次のサイトからダウンロードします webサイト:http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)PyFDAPのWebサイトに記載されている指示を使用してインストールおよび操作します。PyFDAPは、Linux、Mac、およびWindowsオペレーティングシステムと互換性があります。
mMessage mMachine Sp6 転写キットLife TechnologiesAM1340胚への注入用キャップ付きmRNAの生成
Alexa488-デキストランコンジュゲート、3 kDaLife TechnologiesD34682mRNAとの共注入により、細胞内および細胞外マスクを作成
6ウェルプラスチックディッシュBD Falconガロースコーティングされたウェルで胚をインキュベート 胚培地のマウント準備が整うまで
250 mg / Lインスタントオーシャンソルト、1 NaHCO3ProteaseでpH 7に調整した逆浸透水中のmg / Lメチレンブルー
Streptomyces griseusSigmaP5147mg / mlストックを作成し、1 で使用します。mg/ml 1細胞期の胚をデコリオネートする
直径5cmのガラス製ペトリ皿胚のデコレーション用
200ml ガラスビーカー胚のデコレーション用
マイクロインジェクション装置1細胞期の胚にmRNAと色素を注入するため
ステレオマイクロスコープ胚
の注入とマウント用1x Danieau's medium低融点アガロースを希釈し、この培地でイメージングを行います。レシピ: 58 mM NaCl、0.7 mM KCl、0.4 mM MgSO4、0.3 mM CaCl2、5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure 低融点アガロースInvitrogen16520-100胚のマウント用; ダニオー培地で 1% の濃度で使用: 200 mg を 20 ml ダニオー培地に加え、マイクロ波で溶解するまで加熱し、1 mlを微量遠心チューブに入れます。アリコートは4°Cで保存できます。C、70°Cで再溶解。°C、および40–に冷却。42度;C 使用する準備ができたとき
ガラスパスツールピペットキンブルチェイス (フィッシャー経由)63A53WT胚の取り付け用; ギザギザのエッジが胚を傷つけるのを防ぐために先端を炎で覆ってください
金属プローブ取り付け中に胚を位置決めするため
ガラス底皿MatTekP35G-1.5-14-C目的に適したカバーガラスの厚さを使用してください。ここに記載されている部品番号はカバーガラスNo.1.5用です
~5 mlの胚培地BDファルコンパスツールピペットからの残留アガロースをすすぐため
倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡水銀アークランプ、488 nmレーザー、543nmレーザー、および適切なフィルターセットが必要です
加熱ステージ胚を28°Cの最適温度に維持するには;実験中のC
タイムラプスイメージング複数の位置を定義し、定義された間隔で自動的に画像化できる必要があります 
25Xまたは40X水対物レンズイメージング用対物レンズ
10X空気対物レンズ光変換用対物レンズ
浸漬油水と同じ屈折率の浸漬油
ア 5 で満たされた15 mlチューブ が可能な共焦点ソフトウェア

参考文献

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  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Ce....

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