Method Article

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

DOI:

10.3791/52281

⸱

January 22nd, 2015

 ,  ,  , 
1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。

Abstract

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ジャイアント層小胞（GUVs）は膜結合現象を研究するための人気のある生体模倣システムです。しかし、GUVsを成長させる一般的に使用されるプロトコルは、機能的な膜貫通タンパク質を含むGUVsを形成するために修正されなければならない。電鋳とゲル支援腫脹 - - 電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを形成するために、この記事では、2脱水 - 再水和の方法について説明します。両方の方法では、タンパク質含有小単層小胞の溶液を再水和緩衝液中で膨潤させた膜のスタックを形成するために部分的に脱水される。 AC電界は、フィルム再水和の間に適用することができるようにエレクトロフォーメーション法では、フィルムは、白金電極上に堆積される。対照的に、ゲルアシスト膨潤法は、フィルム再水和を向上させるためにアガロースゲル基質を使用する。どちらの方法も、低い（ 例えば5mm）でGUVsおよび生理学的（ 例えば、100 mM）の塩濃度を生成することができます。得られGUVs蛍光顕微鏡、及びインサイドアウトパッチクランプ構成を使用して測定された再構成されチャネルの機能を介して特徴付けられる。交番電界（電鋳）の存在下で膨潤が無欠陥GUVsの高収率を与え、一方、ゲルアシスト膨潤法は、より均一なタンパク質分布を生成し、特殊な装置を必要としない。

Introduction

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生体系を支配する物理的原理を研究する際に、ボトムアップアプローチは、実験者は、システム構成および容易に細胞ベースのシステム1で操作されていない他のパラメータを制御することを可能にする。 10 -彼らは顕微鏡研究とマイクロマニピュレーション8に非常に適しているとして7 -膜ベースのプロセス、ジャイアントの単層ベシクル（GUVs、直径〜1-100μm）のために非常に有用な生体模倣システム2であることが証明された。 GUVsを生成するために、多くの異なるプロトコルが存在するが、大部分は2つのカテゴリーに分類さ- 16 -ベースのエマルジ ​​ョンは、脂質膜13を再水和に基づいて、11,12および技法に近づく。エマルジョンベースの方法では、GUV膜の内側と外側のリーフレットは、水/油界面での脂質単層から順に組み立てられる。このアプローチは、との可溶性タンパク質をカプセル化するための理想的ですGUVsで、非対称リーフレット脂質組成物を用いたGUVsを形成するため。しかし、エマルジ ​​ョンから形成GUVs、膜の機械的特性17を変更する微量の溶媒を保持することができ、そしてアプローチは、特に膜貫通タンパク質の再構成に適していない。

フィルム再水和法は、（脱水）を乾燥して膜の多層のスタックを形成....

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Protocol

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1.溶液の調製

  1. 5のKCl、1 mMのHEPES（pH7.4）を、トリス（pHは7.5）、および2 mMのトレハロースを含む「SUVバッファー」の5ミリリットルを準備します。 0.2μmシリンジフィルターでバッファをフィルタリングし、-20℃で保存することができる1mlアリコートに分ける。
    注：試薬および楽器のための追加の詳細は、資料のリストに記載されている。
  2. フィルム再水和の間にGUV内部を記入しますGUVの成長バッファー」の40ミリリットルを準備します。 「低塩」成長のために、5のKCl、1 mMのHEPES（pHは7.4）または1 mMのトリス（pHは7.5）、および〜400のスクロースを兼ね備えています。 「生理的な塩の成長のために、100のKCl、5mMのHEPES（pHは7.4）または5 mMのトリス（pHは7.5）、および〜200 mMのショ糖を結合する。
  3. 100のKCl、5mMのHEPES（pHは7.4）または5 mMのトリス（pHは7.5）、および〜200 mMグルコースを組み合わせることにより、実験室で外液のための「観測バッファー」の40ミリリットルを準備します。
    注：これらのバッファは、唯一のエクサですmples。他の実験のためのバッファを適応させるために説明を参照してください。
  4. 浸透圧計で成長し、観測バッファの浸透圧を測定します。 GUVsが溶解や観察室に成長室から転送時に崩壊しないように、1％以内にそれら....

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Results

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GUVsの成長を迅速に顕微鏡下で成長チャンバを調べることによって評価することができる。電鋳のために、GUVs、 図4に示すように、白金線に沿って房に成長する傾向がある。ゲルアシスト膨潤時に、GUVsは急速に成長し（ 図5）融着球状構造として現れる。

欠陥のないGUVsは、より容易に識別され、観察室に転送した後に評価されます。較正測定は、厳密にGUV品質を評価するために必要とされ、体系的定量化は、以前に28公表されている。しかし、経験的な指針として、「良い」GUVsを分離する必要があります（ つまり、クラスタ内）、シングル、なめらかな、球状の外膜を持って、内部にはオブジェクト（ すなわち、チューブ、ネストされた小胞など ） を含んでいない、と「標準」脂質蛍光レベルを有する（明るいオブジェクトは、典型的には、二環式または多あるラメラ）。 図6は、等浸透圧グルコース溶液への転送後に「欠陥のない.......

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Discussion

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バイオミメティックモデル系は、タンパク質および膜の特性との相互作用を研究するための重要なツールである。 BLMSまたはサポートされている脂質膜、GUVベースのシステムかなりの膜組成、張力および形状の制御、ならびに真オイルフリーであることを含む本いくつかの機会のような他の再構成されたシステムと比較して。しかし、GUVsに、そのようなKvAPなどの膜貫通タンパク質を、組み込むことは、脂質のみGUVsための従来のプロトコルの重要な適応を必要とします。ここに提示エレクトロフォーメーションプロトコルは以前に特徴付けられ、湾曲した膜2,4,35に膜タンパク質の分布とダイナミクスの生物物理学的な原理を研究するために使用した。この作品はGUVs中のタンパク質の再構成のためのメソッドのセットへの追加、新しいゲル支援腫脹プロト​​コルを示しています。両方のプロトコルはKvAPの高い密度を含む欠陥のないGUVsを生成することができ、そしてインサイドアウトパッチの測定があることを確認SE GUVsは機能的なカリウム選択、電位依存性チャネルが含まれている。

2つのアプローチは異なる長.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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アガロース膨潤によるタンパク質の再構成の可能性について議論してくださったSusanne Fenz氏、現在の測定についてFeng Ching Tsai氏、そしてBassereauグループの現在および過去のメンバーの支援と援助に感謝します。このプロジェクトは、Agence Nationale de la Recherche(助成金BLAN-0057-01)、欧州委員会(NoE SoftComp)、ピエール・エ・マリー・キュリー大学(FED21、Dynamique des Systèmes Complexesからの助成金)から資金提供を受けました。M.G.は、Institut Curie International PhD Fellowship, S.A.、Fondation pour la Recherche Médicaleからのフェローシップ、G.E.S.T.、欧州委員会のMarie Curie Incoming International Fellowship、ピエール・エ・マリー・キュリー大学からの助成金の支援を受けました。掲載料はLabexの「CelTisPhyBio」(ANR-11-LABX0038)が負担しました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DPhPC (1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)Avanti Polar Lipids 850356P
卵PC L-&α;-ホスファチジルコリン(卵・鶏肉) アバンティポーラー脂質 840051P
卵 PA L-&α;-ホスファチジン酸 (卵、鶏肉)Avanti Polar Lipids 840101P
18:1 (&デルタ;9-cis) PC (DOPC) 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンAvanti Polar Lipids 850375P
コレステロール(ヒツジウール、>98%) アバンティポーラー脂質 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MP標識脂質
BPTR-セラミドInvirtogenD-7540 標識脂質
CholoroformVWR22711.290AnalaR Normapur
アセトンVWR20066.296AnalaR Normapur
エタノールVWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
ハミルトン注射器 ハミルトンボナドゥーズAG多様な
琥珀色のバイアルとテフロンカップシグマSU860083とSU860076
パラフィルム
マイクロ遠心チューブエッペンドルフ多様な
アガローユーロメックスLM3(1670-B、Tg 25.7C、TM 64C)
ショ糖シグマ84097-1kg
グルコース シグマG8270-1kg
トレハロースシグマT9531-25G
KClシグマP9333-1kg
ヘペスシグマH3375-100G
トリスユーロメックスEU0011-A
浸透圧計ウェスコールVapro
pHメーターショット機器Lab850
ソニケーターElmasonicS 180 H
シリンジフィルター0.2µmザルトリウス シュタイムMinisart 16532
機能発電機TTiTG315
プラチナ線GoodfellowLS41307499.99+%, d = 0.5 mm
ポリテトラフルオロエチレンGoodfellow
ダウ コーニング '高真空グリース'VWR1597418
シーリング ペーストVitrex medical A/S, デンマークREF 140014Sigillum ワックス
カバー スライド 22 x 40 mm No1.5VWR631-0136
カバー スライド 22 x 22 mm No1.5VWR 631-0125
プラズマクリーナーHarrickPDC-32Gエアプラズマ、「高」
ペトリ皿Falcon BDREF 3530013.5 cm x 1 cm
パッチクランプアンプAxon instrumentsMulticlamp700B
DAQ カードNational InstrumentsPCI-6221
LabviewNational Instrumentsバージョン8.6
ガラスピペットホウケイ酸OD 1 mm内径0.58 mmハーバード・デバイスGC100-15
電極ホルダーワーナー・インスツルメンツ Q45W-T10P
マイクロマニピュレーターサッター MP-285
ピペットプーラーサッター P-2000 
カメラProSilica GC1380
ツァイス顕微鏡ツァイスアクシオーバート 135
対物レンズツァイス40倍 長作動距離、位相コントラスト
対物レンズ ツァイス100X プランアポクロマート NA 1.3
フィルターセット GFP (Alexa-488用)堀場XF100-3
フィルターセット Cy3 (テキサスレッド用)堀場XF101-2
ベータカゼインシグマ C6905-1G
共焦点顕微鏡Nikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 共焦点ヘッド
対物レンズNikonPlan Fluor 100X NA 1.3
MatlabMathworks画像処理と電流トレースの分析
VWR291-1214スの設定

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
  2. Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).

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Giant Unilamellar VesiclesVoltage gated Ion ChannelKvAP ReconstitutionElectroformation MethodGel assisted SwellingFluorescence MicroscopyPatch Clamp StudiesLipid Protein FilmDehydration RehydrationMembrane Protein Incorporation

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