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方法論記事

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

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DOI:

10.3791/52281

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2015年1月22日

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1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

この記事について

サマリー

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。

要約

ジャイアント層小胞（GUVs）は膜結合現象を研究するための人気のある生体模倣システムです。しかし、GUVsを成長させる一般的に使用されるプロトコルは、機能的な膜貫通タンパク質を含むGUVsを形成するために修正されなければならない。電鋳とゲル支援腫脹 - - 電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを形成するために、この記事では、2脱水 - 再水和の方法について説明します。両方の方法では、タンパク質含有小単層小胞の溶液を再水和緩衝液中で膨潤させた膜のスタックを形成するために部分的に脱水される。 AC電界は、フィルム再水和の間に適用することができるようにエレクトロフォーメーション法では、フィルムは、白金電極上に堆積される。対照的に、ゲルアシスト膨潤法は、フィルム再水和を向上させるためにアガロースゲル基質を使用する。どちらの方法も、低い（ 例えば5mm）でGUVsおよび生理学的（ 例えば、100 mM）の塩濃度を生成することができます。得られGUVs蛍光顕微鏡、及びインサイドアウトパッチクランプ構成を使用して測定された再構成されチャネルの機能を介して特徴付けられる。交番電界（電鋳）の存在下で膨潤が無欠陥GUVsの高収率を与え、一方、ゲルアシスト膨潤法は、より均一なタンパク質分布を生成し、特殊な装置を必要としない。

概要

生体系を支配する物理的原理を研究する際に、ボトムアップアプローチは、実験者は、システム構成および容易に細胞ベースのシステム1で操作されていない他のパラメータを制御することを可能にする。 10 -彼らは顕微鏡研究とマイクロマニピュレーション8に非常に適しているとして7 -膜ベースのプロセス、ジャイアントの単層ベシクル（GUVs、直径〜1-100μm）のために非常に有用な生体模倣システム2であることが証明された。 GUVsを生成するために、多くの異なるプロトコルが存在するが、大部分は2つのカテゴリーに分類さ- 16 -ベースのエマルジ ​​ョンは、脂質膜13を再水和に基づいて、11,12および技法に近づく。エマルジョンベースの方法では、GUV膜の内側と外側のリーフレットは、水/油界面での脂質単層から順に組み立てられる。このアプローチは、との可溶性タンパク質をカプセル化するための理想的ですGUVsで、非対称リーフレット脂質組成物を用いたGUVsを形成するため。しかし、エマルジ ​​ョンから形成GUVs、膜の機械的特性17を変更する微量の溶媒を保持することができ、そしてアプローチは、特に膜貫通タンパク質の再構成に適していない。

フィルム再水和法は、（脱水）を乾燥して膜の多層のスタックを形成する多くの脂質混合物を生じるという事実に依存している。このスタックは、その後水性緩衝液と接触させて配置されている場合は、スタック内の膜は、それらの間に、スタックの表面のような溶媒の流れを離れて移動し、個々の膜はGUVs 13,18（同様の真の動物園を形成するために取り外すことができる他の脂質のオブジェクト）。しかし、最適な緩衝液及び脂質組成物のために、この古典的な「自発膨潤」方法は、欠陥のないGUVs比較的低い収率を有する。無欠陥GUVsの収率を高めるために1つの広く使用されている方法は、「電鋳である交流電流（AC）フィールドは、フィルム再水和の間に適用される221 ;,。メカニズムはよくわかっていないままであるが、「電鋳「壮大なGUVの収量を与えることができます（>有利な状況では90％）、低塩濃度バッファー用（<5mm）を14,19、さらには（〜100 mM）の生理的緩衝液中で作業することができます使用して高い周波数（10 Hzの対500 Hz）の交流電界と白金電極15。無欠陥GUVsの収率を高めるための別のアプローチは、「ゲル支援膨潤」、脂質溶液はなく、古典的な「自発腫脹で使用される受動的な（ 例えば 、ガラス、PTFE）基板より高分子ゲル基材上に堆積されている"。結果として得られる脂質/ゲルフィルムを再水和されると、GUVsは急速にも生理的なバッファ16,20のために形成することができる。

これら全ての方法は、次のような膜結合現象を研究するために使用することができる脂質のみGUVsを生成することができ可溶性タンパク質および膜との相互作用。しかし、GUVsに膜貫通タンパク質を組み込むために、重要な改変は、タンパク質が再構成手順の間、機能状態に留まることを確実にするために必要とされる。有機溶媒（ 例えば、クロロホルム、シクロヘキサン）中の脂質溶液は脂質膜を製造するための理想的であるが、それらの疎水性膜貫通ドメインが脂質二重層に埋め込 ​​まれた、または界面活性剤ミセルにより囲まれている場合に、膜貫通タンパク質は、（典型的にのみ安定している例えば、タンパク質精製の ​​間に）。したがって、再構成のための出発材料は、典型的には界面活性剤の除去によって形成されたネイティブの膜、洗剤溶液中で精製されたタンパク質、または小さな単層のタンパク質含有小胞（プロテオのSUV）および/またはマルチラメラ小胞（MLVはプロテオ）である脂質の存在。 GUVs、これらの膜タンパク質を組み込むために、ほとんどの方法は、3つのカテゴリーに分類される。

ダイレクトInsertionは洗剤に懸濁トランスメンブレンタンパク質は、予め形成された、脂質のみ、穏やか洗剤可溶化GUVsと混合し、界面活性剤は、次にバイオビーズ21を用いて除去される。概念的には簡単ながら、この方法は、高すぎる界面活性剤濃度は、濃度が、タンパク質がアンフォールディングまたは凝集する可能性が低すぎる一方GUVsを溶解することができるように、界面活性剤濃度の正確な制御を必要とする。

GUV /プロテオSUV融合：プロテオSUVの中のタンパク質は、予め形成され、脂質専用GUVsと合わせ、融合は、特殊な膜融合性ペプチド22または洗剤21で促進される。通常、融合の程度は低タンパク質密度でGUVsにつながる制限されている。

脱水/再水和：タンパク質含有脂質膜を部分的プロテオSUVの脱水（またはプロテオMLV）溶液GUVsによって形成され、その後、純粋な脂質膜として成長させる。明白な課題は、部分的なdehydrati間にタンパク質を保護することです25 -ステップ23が、この方法で正常にGUVs 7,23にそのようなバクテリオロドプシン、カルシウムATPアーゼ、インテグリンとVDACとして膜貫通タンパク質を再構成するために使用されています。

この記事では、Hyper-好熱性古細菌、Aeropyrumのペルニクスから、電位依存性カリウムチャネル、KvAPを含むGUVsを作るために、脱水/再水和プロトコルについて説明します。KvAPは、真核生物の電圧依存性カリウムチャンネル26と既知の結晶構造27に高度の相同性を有している、それ電圧ゲーティングのメカニズムを研究するための優れたモデルとなっています。プロテオのSUVの生産は以前に詳細に記載し、このチュートリアル26,28,29の一部ではありませんされています。重要なことには、KvAPのプロテオSUVは、それらが長期間（> 1年）のために-80℃で小さい（ 例えば、10μl）を一定分量で保存することができるように、各GUV調製のために生成する必要はない。電鋳またはゲル補助膨張はその後KvAPのプロテオのSUV（またはプロテオたMLV）からGUVsを成長させるために使用することができる。

電鋳プロトコルの重要なステップは、 図1に示されている。タンパク質を含有するSUVの溶液の液滴の白金線（ 図2に示す）上に堆積される。 SUV懸濁液の部分的脱水のSUVの融合による脂質タンパク質フィルムの形成をもたらす。再水和の間に、交流電界を離層とGUVsを形成するための脂質層を支援するために電極に印加される。 「低塩」を使用するときに10Hzのフィールドはうまく機能（<5 mM）の再水和緩衝液28とGUVsは数時間かかるが成長する。対照的に、生理的なバッファ（〜100mMの塩を含む）より低い電圧、500 HzのAC場でうまく動作しますが、長期（〜12時間）を必要とする期間15膨潤 。このメソッドは、ITOが24スライドが、カスタム室続きを使用して使用して、以前のプロトコルに基づいています図2に示すように、（単純な、即興室のための設計の詳細や提案のための議論を参照）は、2つの白金線をaining。

図3は、ゲル支援膨潤法を例示する。プロトコルは、生理的塩濃度の緩衝液を用いてうまく迅速で、より均一なタンパク質分布をGUVsを生成する。しかし、単離された、明らかに欠陥のないGUVsの収率は（ すなわち、GUV膜は、光学長さスケールで均一であり、任意のオブジェクトを囲むされません）は、パッチクランプとマイクロマニピュレーションの実験のために十分な数を提供していますが、低く、 。この方法は、脂質のみGUVs 16を生成するために、アガロースゲルを用いたプロトコルに基づいており、エレクトロフォーメーション法よりも少ない特殊な装置を必要とした。

蛍光顕微鏡によるGUVsの特徴について説明したが、同様に、標準的なパッチクランプセットアップを用いて、手順「インサイドアウト」にKvAP活性を測定は、膜パッチを切除し。

成長タンパク質含有GUVsは脂質のみGUVsよりも困難であることができる。具体的には、最終的なGUV収率はSUV溶液が膜スタックを形成するために堆積され、脱水された方法を正確に敏感に依存することができる。 GUVsと以前の経験のない人のために、第一の膜の膜は、有機溶媒から脂質を堆積することによって形成される従来のプロトコル15,16以下の脂質のみGUVsを成長させることが有用であろう。従来のプロトコルがうまく機能すると、SUVの堆積と部分脱水は、新しい脂質組成のためのプロトコルを調整する際にも非常に有用である脂質専用のSUVを、使用して習得することができます。 GUVs脂質のみのSUVから確実に成長する場合には、プロテオのSUVからのタンパク質含有GUVsを生成するためにわずかなステップがある。

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プロトコル

1.溶液の調製

  1. 5のKCl、1 mMのHEPES（pH7.4）を、トリス（pHは7.5）、および2 mMのトレハロースを含む「SUVバッファー」の5ミリリットルを準備します。 0.2μmシリンジフィルターでバッファをフィルタリングし、-20℃で保存することができる1mlアリコートに分ける。
    注：試薬および楽器のための追加の詳細は、資料のリストに記載されている。
  2. フィルム再水和の間にGUV内部を記入しますGUVの成長バッファー」の40ミリリットルを準備します。 「低塩」成長のために、5のKCl、1 mMのHEPES（pHは7.4）または1 mMのトリス（pHは7.5）、および〜400のスクロースを兼ね備えています。 「生理的な塩の成長のために、100のKCl、5mMのHEPES（pHは7.4）または5 mMのトリス（pHは7.5）、および〜200 mMのショ糖を結合する。
  3. 100のKCl、5mMのHEPES（pHは7.4）または5 mMのトリス（pHは7.5）、および〜200 mMグルコースを組み合わせることにより、実験室で外液のための「観測バッファー」の40ミリリットルを準備します。
    注：これらのバッファは、唯一のエクサですmples。他の実験のためのバッファを適応させるために説明を参照してください。
  4. 浸透圧計で成長し、観測バッファの浸透圧を測定します。 GUVsが溶解や観察室に成長室から転送時に崩壊しないように、1％以内にそれらを一致させるために、スクロースまたはグルコースの顆粒を追加します。
    注：この濃度範囲では、ショ糖の1 mMの追加（13.7 40ミリリットル当たりミリグラム）またはグルコース（40ミリリットルあたり7.2 mg）を〜1オスモルによって浸透圧を増加します。
  5. 0.2μmのフィルターで成長し、観察緩衝液を濾過し、細菌の増殖を阻害するために4℃で保管します。
  6. GUVsは、スティック広がり、バーストしないように、実験室の表面を不動態化するために必要な5 mg / mlのβ-カゼイン溶液を形成するために、20mMのTRIS（pH7.5）を緩衝液10ml中にβ-カゼインを50mg溶解する。 β-カゼインが完全に0.5ミリリットルのアリコートに、フィルター（0.2μm）をそれ（4℃で数時間まで）に溶解した後、フラッシュ凍結し、保存することができる後で使用するために-20℃で（4℃で保存し解凍したアリコート典型的に1週間までのために使用することができる）。

2. SUVの準備

  1. 準備し、以前に公開された詳細なプロトコール28以下のプロテオのSUVのアリコートを凍結する。 KvAP蛍光（質量比）1：10の脂質比タンパク質でDPhPCのSUVに再構成のAlexa-488マレイミド（10 mg / mlの）で標識された使用。
    注：野生型KvAPは細胞内C末端（アミノ酸247）の近くにあるモノマーあたり1システインが含まれています。
  2. 蛍光灯、脂質のみのSUV：
    注：ニトリル手袋、安全メガネを着用してヒュームフードの下でクロロホルムを処理します。クロロホルムなどの任意のプラスチックの使用は、それらを溶解することができないようにしてください。クロロホルム溶液をテフロンキャップでアンバーガラスバイアル中に保存し、ガラスシリンジを使用して転送することができる。前と脂質をペッティングした後、クロロホルムで少なくとも5から10回すべてのガラス器をすすぐように注意してください。
    1. 100μlのを準備しますテキサスレッドDHPE溶液を8.2μlの（1 mg / mlのにDPhPC溶液100μl（クロロホルム中10mg / ml）を混合することにより、赤色蛍光脂質、テキサスレッドDHPE、0​​.5モル％を含有する10mg / mlのDPhPC SUVの1.5ミリリットルアンバーガラスバイアル中）のメタノール。
    2. バイアルを回転させながら、化学フード内で窒素気流下で脂質をドライダウン。フィルムが乾燥して表示されたら、任意の残留溶媒を除去するために3時間真空下で脂質を置く。
    3. 脂質にSUV緩衝液100μlを追加し、ボルテックス、激しくない脂質は、バイアルの壁に付着したままなくなるまで、溶液が均一に乳白色である。
    4. SUV車を形成するための脂質溶液を超音波処理。超音波は、バイアル内部のほとんどの動きと流れを起こすまで、バイアル位置を調整し、不必要なソリューションを加熱しないように注意してください。溶液が半透明になるまで超音波処理を続行するか、可能な場合は、透明（風呂超音波処理のために〜20分先端超音波処理のための2-5分、）。
    5. AliquoトンのSUV（ 例えば、10μlあるいは20μl）を、凍結（-20℃）のために後に使用する。
      注：脂質、特に不飽和脂質、でき​​る簡単内訳。アルゴン下で20℃（または80℃）での店舗脂質溶液と6ヶ月以内に使用します。脂質分解生成物は、薄層クロマトグラフィーを用いて検出することができる。

電鋳3. GUV成長

  1. エレクトロフォーメーション室を準備します。
    1. 室が洗浄されていない場合は、ウィンドウを削除するすべてのシーラントやグリースを拭き取って、ワイヤーを抽出し、すすぎ水と交互にエタノール（≥70％）を用いて組織を有するチャンバをスクラブ。
    2. 、うまく配線をこするアセトンにワイヤーやチャンバーを水没し、5分間超音波処理する。再びアセトンを用いて組織ですべてを拭きます。 5分間のエタノールおよび超音波処理中にチャンバーを置く。
    3. 穴を通してワイヤーを挿入することにより、チャンバを組み立て、そして回転させ、彼らはarを確認するために電線を拭く電子クリーン。蒸留水にチャンバーを入れ、5分間超音波処理し、窒素または空気の流れと、チャンバを乾燥。
  2. SUV·バッファ内の3 mg / mlのSUV懸濁液の30μlのを準備します。 、タンパク質含有GUVsを形成するプロテオのSUVの8μL（DPhPC 10 mg / mlのKvAP 1:10）、蛍光のSUVの2μL（10 mg / mlのDPhPC、0.5モル％テキサスレッド-DHPE）とSUVの20μlのを結合するには12.5と0.1モル％テキサスレッド-DHPE：1の最終脂質へのタンパク質（質量）比1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内のバッファ。溶液を激しく混ぜる。
    1. また、脂質​​専用のSUVとのプロトコルを実践するために、単純に20μlのSUVバッファーで蛍光のSUVの10μL（10 mg / mlのDPhPCと0.5モル％テキサスレッド-DHPE）を組み合わせる。
  3. SUVソリューションを堆積させる。
    1. ワイヤ上のSUV液の小さい（<0.2μL）の液滴を堆積させるために2μlのピペットまたは5μlのガラスシリンジを使用してください。溶液の約1μlを沿って液滴の列を形成するために必要とされる線から1cm。滴が十分に小さいと、彼らが触れたり、ヒューズないことを十分に離れて間隔を置いていることを確認してください。
    2. 堆積したSUV車はオープンエアで〜30分間乾燥させます。すべての滴が定住している場合には脂質沈着を顕微鏡で観察するのが容易であるように、ワイヤーを回転させる。
      NOTE：SUV車が十分に乾燥させない場合の成長バッファが追加されたときに過度に乾燥して、タンパク質を損傷することができるが、彼らは、ワイヤを洗い流すことができる。空気湿度は、乾燥速度 ​​、乾燥時間、および/ ​​または空気湿度に影響を与えるため、最適な結果を30に調整することができる。ワイヤ上の脂質フィルムを顕微鏡で見えるはずです。
  4. チャンバーを組み立てます。
    1. チャンバ底部をシール：3つのウェルの周りのチャンバの底部に真空グリースを適用し、それが隙間なく付着するようにチャンバ底部をシールするために、それに対して優しく40ミリメートル×22 mmのカバースリップを押すように注射器を使用してください。チャンバーの側面（ワイヤー出口）とをシールペーストを封止する。 3つのウェルを概説室の上に真空グリースを適用します。
    2. 各ウェルを先頭に充填されるまでゆっくりと成長バッファを追加します。これは、電極から脂質フィルムを除去することができますように、ウェル中の溶液の急激な動きは避けてください。
    3. ボトムカバースリップを取り除くしないように注意しながら、グリースの上に静かに、トップカバースライドを押して、チャンバーを閉じます。トップカバースリップのエッジでバッファのいずれかの水滴を除去するための組織を使用してください。
      注：これは脂質膜は、ワイヤ上に残っていることを確認するために顕微鏡下室を調べるのに良い時期です。
  5. 2ワニ口クリップを使用して配線に信号発生器を接続してください。低/高塩緩衝用の正方形（Vrmsの）を意味する周波数（低/高塩緩衝用の10ヘルツ/ 500 Hzの正弦波）を設定し、測定し、0.7 / 0.35 Vルートへの配線の両端の電圧を調整するためにマルチメーターを使用しています。光から蛍光団を保護するためにアルミホイルでチャンバーを覆う。 Tのままに彼はGUVs低塩緩衝液のための2から3時間、および高塩緩衝液のための12時間またはO / Nのために成長する。
  6. 発電機からチャンバを外し、慎重にGUVの成長を評価するために倒立顕微鏡上に置きます。途中で電線からGUVsを切り離すことウェル中でゆっくり、着実な動きや流体の流れを使用してください。
    注：どこでも電線の下半分にGUVsは落射蛍光で見ることができる一方、ワイヤの端にGUVsは、位相コントラスト（40X長作動距離対物レンズ）には、通常表示されます。何GUVsが表示されていない場合、上面を見て、ワイヤを回転させてみてください。 GUVs数日間成長チャンバー中で4℃で保存することができる。

ジェル支援膨潤4. GUV成長

  1. 純水10mlのアガロース100mgを混合して1％アガロース溶液10mlを調製する。それは〜20秒間480 Wのマイクロ波に置くことで沸騰するまで加熱する。アガロースが完全に溶解されていることを確認しかき混ぜる。
    注：ソリューション4°Cで保存し、必要なときに再加熱することができる。
  2. プラズマクリーン（空気プラズマ）1分間カバースライドアガロース溶液は、その上にうまく広がっていくようにする。プラズマ洗浄の効果がすぐに切れるように、次の15分以内にカバースライドを使用してください。
  3. 表面全体を濡らすソリューションように、各22×22 mm 2のスライドに温かいアガロース溶液200μlを適用します。縦にスライドを傾け、過剰な液体を除去し、スライド上のアガロースのちょうど薄い平滑な層を残すように、組織に下縁部をタッチします。
  4. 60℃のホットプレートやオーブンのスライドを置き、少なくとも30分間乾燥それを残す。アガロースフィルムは、目でほとんど見えないです。スライドはすぐにそれらを使用し、RTに冷却し、又は4℃で密閉容器中で最大1週間保管した後。
  5. 標準の3.5センチメートルシャーレにアガロースでコーティングされたカバースリップを置きます。
  6. 3.2節のようにSUV溶液を調製し、適用〜SUV溶液（3 mg / mlの脂質）で15μlの穏やかアガロース表面上〜30微小液滴。あまりにも多くのアガロース層を歪めないように注意してください。
  7. 約10〜15分間窒素の穏やかな流れの下でスライドを置き、液滴が乾燥するように目でバッファの蒸発をたどる。
  8. できるだけ早くのSUVが乾燥しているように、スライド面を覆うように成長バッファを追加する。バッファの〜1ミリリットル小さな3.5センチメートルペトリ皿で​​使用するために。
  9. 〜30分間進行し、その後、位相差や微分干渉コントラスト（DIC）と倒立顕微鏡を用いてチャンバー内GUVsの成長を調べるために、膨潤可能にする。
    注記：落射蛍光観察によりゲル、アガロースの自己蛍光の蛍光団の強いバックグラウンドのために困難である。

5.収穫と観測GUVs

  1. 観測室（ 例えば、小さなペトリ皿またはカバーガラス）GUVsが付着しないように、拡散し、チャンバ底部にバーストを不動態化する。チャムカバーβ-カゼイン溶液と下部ファイバ、5分間インキュベートし、空気または窒素流で乾燥した純水でカゼイン溶液を洗い流し、最後に観察バッファ（小ペトリ皿のために、例えば、3〜5 mmの深さ）を追加する。
  2. GUVsを収穫。開口部が大きいので（〜2ミリメートルの直径）100μlのピペットチップの先端をカットし、ピペッティングのせん断応力としてゆっくり熱望することは簡単にGUVsを破壊することができます。
    1. 電気形成されたGUVsの場合は、優しくトップカバースリップを除去することにより、成長チャンバを開きます。 GUVsを切り離すワイヤに沿ってピペットチップを移動させながら、〜各ワイヤと吸引の真上に50μlのピペットチップを置きます。
      注：これは、線の「反対側」にGUVsを収集するために、ワイヤを回転させるのに役立ち得る。
    2. 「ゲル支援腫脹」GUVsの場合、最初のGUVsはカバーガラス表面から切り離す助けるために数回ペトリ皿の側面をタップします。 Pしばらく50μlのちょうどカバースリップと吸引の上にピペットチップを置き裏面上の先端をulling。直接1週間まで4℃で1.5 mlマイクロチューブに観測室、またはストアに収穫さGUVsを転送する。
  3. 倒立顕微鏡で観察室を置き、観察室にGUVsを追加し、チャンバ底部に沈降するGUVsための数分待って。
  4. すばやく滑らかな、球状（ '欠陥のない'） "GUV候補」を見つけるために、位相コントラストやDICを有するチャンバを調査。内側にネストされたすべての含む小さいリポソームを除外するために、落射蛍光の各「GUV候補」を調べます。最後に、脂質蛍光強度が均一で（ すなわち、単層）単一の膜と互換性があることを確認してください。
    注：これらは、位相コントラストやDIC画像内の単層見えるようにいくつかのbilamellar（またはマルチラメラ）小胞では、膜が解決されるために一緒に接近しすぎている。しかし、これらのオブジェクトは、実際のunilameから区別することができる2倍（またはそれ以上）の明るい彼らの脂質蛍光によるリャルGUVs。

6.パッチクランプGUVs

  1. ピペットプラーにお勧めのプログラムを使用して、標準的なホウケイ酸キャピラリーガラスから1-2μmの先端径でパッチピペットを行います。
    注：このようなファイヤーポリッシュなどの特殊な治療が必要ではなく、それらは密閉箱に保管されている場合、それらが引き出された後、ピペットを数日間使用することができる。
  2. GUVsは、付着チャンバ表面上に広げ、破裂しないことを保証するために、β-カゼイン溶液（5mg / ml）とインキュベートすることによって、チャンバを不動態化する。 5分後にカゼインを洗い流してください。
  3. 接地電極を挿入し、観察緩衝液でチャンバーを埋める、ステップ5.2と5.3で説明したようにGUV懸濁液10μlを転送し、底に沈降するGUVsための数分待って。
  4. 溶液（観察バッファまたは他の等張溶液）で新鮮なパッチピペットを記入し、パッチクランプアンプヘッドステージにマウント。
  5. チャンバを通る検索は、セクション5.4で説明したように「欠陥のない」GUVを見つけて、それが蛍光タンパク質が含まれていることを確認します。
  6. 一定の正圧適用する（> 100 Paで、またはおよそ1センチメートルマノメータでH 2 O）クリーンな内部パッチピペットを維持し、チャンバ内にパッチピペットを挿入する。視野にパッチピペットを持参、/測定ピペット電圧オフセットと抵抗を補償し、先端が汚れていないことを確認するために、蛍光灯照明下でピペットを調べるためにテストパルスを適用する。
  7. GUVの方にパッチピペットを持参し、必要に応じて、同時に「逃げる」GUVをしないパッチピペットから外側へ流れように正の圧力を低下させる。パッチピペットは、GUVに近い場合、パッチピペットに対してGUVをプルする（5センチメートルH 2 Oまで）負圧を適用する。としての抵抗を監視」、GUV膜の舌は「パッチピペットとギガシールフォームを入力する。
  8. ギガシールが形成されなかった場合は、チャンバーからパッチピペットを削除し、6.4のステップに戻ります。膜パッチをギガシールを形成したが、GUVピペットに付着したままの場合、GUVから引き離し破裂GUVをチャンバ底に対して、または簡単に溶液からピペットを移動してパッチを切り出す。
  9. インサイドアウト膜パッチをGUVから切り出し、ギガシールが安定した場合には、試験パルスをオフにし、このような図13に示すような電圧プロトコルを適用する。
    メモ： 図13は 、パッチ電極に流れ込む電流で、インサイドアウトパッチのための標準的な電気生理学的慣習が「ポジティブ」、およびV = V 風呂で、次の- V ピペット 。ステップ（10ながら、休止状態に〜30秒の場所のための負電位（ 例えば、V = -100 MV）でパッチKvAPの開催より正の電位（ 例えば、V = 100 MV）が、次に実施する（ すなわち、オープン）アクティブ状態にそれを駆動することができ、5秒0ミリ秒）。
  10. 膜パッチの測定が終了した後、ザップまたは圧力パルスでパッチを破るとパッチ電極の電圧オフセットがドリフトしていないことを確認してください。チャンバーからパッチピペットを外し、6.4のステップに戻ります。

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結果

GUVsの成長を迅速に顕微鏡下で成長チャンバを調べることによって評価することができる。電鋳のために、GUVs、 図4に示すように、白金線に沿って房に成長する傾向がある。ゲルアシスト膨潤時に、GUVsは急速に成長し（ 図5）融着球状構造として現れる。

欠陥のないGUVsは、より容易に識別され、観察室に転送した後に評価されます。較正測定は、厳密にGUV品質を評価するために必要とされ、体系的定量化は、以前に28公表されている。しかし、経験的な指針として、「良い」GUVsを分離する必要があります（ つまり、クラスタ内）、シングル、なめらかな、球状の外膜を持って、内部にはオブジェクト（ すなわち、チューブ、ネストされた小胞など ） を含んでいない、と「標準」脂質蛍光レベルを有する（明るいオブジェクトは、典型的には、二環式または多あるラメラ）。 図6は、等浸透圧グルコース溶液への転送後に「欠陥のない...

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ディスカッション

バイオミメティックモデル系は、タンパク質および膜の特性との相互作用を研究するための重要なツールである。 BLMSまたはサポートされている脂質膜、GUVベースのシステムかなりの膜組成、張力および形状の制御、ならびに真オイルフリーであることを含む本いくつかの機会のような他の再構成されたシステムと比較して。しかし、GUVsに、そのようなKvAPなどの膜貫通タンパク質を、組み込むことは、脂質のみGUVsための従来のプロトコルの重要な適応を必要とします。ここに提示エレクトロフォーメーションプロトコルは以前に特徴付けられ、湾曲した膜2,4,35に膜タンパク質の分布とダイナミクスの生物物理学的な原理を研究するために使用した。この作品はGUVs中のタンパク質の再構成のためのメソッドのセットへの追加、新しいゲル支援腫脹プロト​​コルを示しています。両方のプロトコルはKvAPの高い密度を含む欠陥のないGUVsを生成することができ、そしてインサイドアウトパッチの測定があることを確認SE GUVsは機能的なカリウム選択、電位依存性チャネルが含まれている。

2つのアプローチは異なる長...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

アガロース膨潤によるタンパク質の再構成の可能性について議論してくださったSusanne Fenz氏、現在の測定についてFeng Ching Tsai氏、そしてBassereauグループの現在および過去のメンバーの支援と援助に感謝します。このプロジェクトは、Agence Nationale de la Recherche(助成金BLAN-0057-01)、欧州委員会(NoE SoftComp)、ピエール・エ・マリー・キュリー大学(FED21、Dynamique des Systèmes Complexesからの助成金)から資金提供を受けました。M.G.は、Institut Curie International PhD Fellowship, S.A.、Fondation pour la Recherche Médicaleからのフェローシップ、G.E.S.T.、欧州委員会のMarie Curie Incoming International Fellowship、ピエール・エ・マリー・キュリー大学からの助成金の支援を受けました。掲載料はLabexの「CelTisPhyBio」(ANR-11-LABX0038)が負担しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DPhPC (1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)Avanti Polar Lipids 850356P
卵PC L-&α;-ホスファチジルコリン(卵・鶏肉) アバンティポーラー脂質 840051P
卵 PA L-&α;-ホスファチジン酸 (卵、鶏肉)Avanti Polar Lipids 840101P
18:1 (&デルタ;9-cis) PC (DOPC) 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリンAvanti Polar Lipids 850375P
コレステロール(ヒツジウール、>98%) アバンティポーラー脂質 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MP標識脂質
BPTR-セラミドInvirtogenD-7540 標識脂質
CholoroformVWR22711.290AnalaR Normapur
アセトンVWR20066.296AnalaR Normapur
エタノールVWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
ハミルトン注射器 ハミルトンボナドゥーズAG多様な
琥珀色のバイアルとテフロンカップシグマSU860083とSU860076
パラフィルム
マイクロ遠心チューブエッペンドルフ多様な
アガローユーロメックスLM3(1670-B、Tg 25.7C、TM 64C)
ショ糖シグマ84097-1kg
グルコース シグマG8270-1kg
トレハロースシグマT9531-25G
KClシグマP9333-1kg
ヘペスシグマH3375-100G
トリスユーロメックスEU0011-A
浸透圧計ウェスコールVapro
pHメーターショット機器Lab850
ソニケーターElmasonicS 180 H
シリンジフィルター0.2µmザルトリウス シュタイムMinisart 16532
機能発電機TTiTG315
プラチナ線GoodfellowLS41307499.99+%, d = 0.5 mm
ポリテトラフルオロエチレンGoodfellow
ダウ コーニング '高真空グリース'VWR1597418
シーリング ペーストVitrex medical A/S, デンマークREF 140014Sigillum ワックス
カバー スライド 22 x 40 mm No1.5VWR631-0136
カバー スライド 22 x 22 mm No1.5VWR 631-0125
プラズマクリーナーHarrickPDC-32Gエアプラズマ、「高」
ペトリ皿Falcon BDREF 3530013.5 cm x 1 cm
パッチクランプアンプAxon instrumentsMulticlamp700B
DAQ カードNational InstrumentsPCI-6221
LabviewNational Instrumentsバージョン8.6
ガラスピペットホウケイ酸OD 1 mm内径0.58 mmハーバード・デバイスGC100-15
電極ホルダーワーナー・インスツルメンツ Q45W-T10P
マイクロマニピュレーターサッター MP-285
ピペットプーラーサッター P-2000 
カメラProSilica GC1380
ツァイス顕微鏡ツァイスアクシオーバート 135
対物レンズツァイス40倍 長作動距離、位相コントラスト
対物レンズ ツァイス100X プランアポクロマート NA 1.3
フィルターセット GFP (Alexa-488用)堀場XF100-3
フィルターセット Cy3 (テキサスレッド用)堀場XF101-2
ベータカゼインシグマ C6905-1G
共焦点顕微鏡Nikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 共焦点ヘッド
対物レンズNikonPlan Fluor 100X NA 1.3
MatlabMathworks画像処理と電流トレースの分析
VWR291-1214スの設定

参考文献

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KvAPの再構成エレクトロフォーメーション法ゲル介在性膨潤蛍光顕微鏡脂質タンパク質膜脱水再水和膜タンパク質の組み込み
膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、
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