代償肺の成長のマウス肺モデル

サマリー

マウス肺摘出術は、一般的に採用されている代償性肺成長モデルです。この手順は、系統追跡またはトランスジェニックマウスモデルと組み合わせて使用 し、根本的なメカニズムを解明することができます。

要約

人間では、損傷した肺の修復とリモデリングが乱れると、多くの急性および慢性の肺障害を引き起こし、最終的には障害や死につながる可能性があります。肺の修復と再生の損傷ベースの動物モデルは、損傷特異的な応答によって制限されているため、損傷反応と損傷の解決に関連する変化を肺修復と肺再生に関連する変化と区別することは困難です。しかし、これらの修復および再生シグナル伝達経路を特定するための動物モデルの使用は、肺損傷後の肺機能の改善を目的とした新しい治療法の開発にとって重要です。マウス肺切除モデルは、代償性肺の成長を利用して、これらの修復および再生シグナルを分離し、肺胞再敗血症のメカニズムをより明確に定義します。ここでは、マウス肺摘出術と偽肺摘出術の手技についてご説明します。この技術は、系統追跡または他のトランスジェニックマウスモデルと組み合わせて使用 され、肺の修復および再生の分子的および細胞的メカニズムを定義することができます。

概要

肺の主な機能は、生物と大気の酸素と二酸化炭素の交換を提供することである。ヒトでは、先天性および後天条件のホストが損なわれた肺機能をもたらす減少、肺の表面積をも​​たらす。 すなわち、肺-そのような吸入コルチコステロイド、気管支拡張薬、酸素補給、および慢性の機械的換気などの治療のホストが損なわれた肺機能^1-3の影響を緩和するために使用されているが、これらの状態のための理想的な治療は、機能的な肺組織の再生を促進する再生。

哺乳動物の組織再生は十分に立証されている。アフリカのトゲマウスは瘢痕形成⁴なく、皮膚の大部分を再生することができる。ヒトでの末節骨は、以下の傷害または切断^5-7を再生成することができます。以下の肺（PNX）、代償肺の成長が行い^、9ラット、マウス⁸で発生gsは^10、およびヒト^11。定義により、代償肺の成長は既存の空域の拡大が、関連した微小循環¹²の拡大にこれらの拡大空域の再隔壁形成だけではないが含まれます。遺伝子発現解析は、このモデルが肺の発達¹³のシグナル伝達事象の多くを再現することを示した。四週間マウスPNXた後、肺胞の表面積は、偽手術動物¹⁴と同等である。本稿では、我々は、マウスPNXおよび偽PNX手順を説明します。

プロトコル

注：動物use文：本研究におけるすべての手順を承認し、シンシナティ小児病院での動物実験使用とケア委員会（IACUC）のガイドラインに従って行った。 8週齢のC57BL / 6J雄マウスをジャクソン·ラボラトリーズ（バーハーバー、ME）から入手し、使用前に一週間順応させた。手術まで、動物を、無病原体バリア施設で飼育し、オートクレーブした食餌及びろ過水広告libdiumを与えた。各マウスのケージは、専用の空気と水を供給し、客室は、12時間の昼夜サイクルで維持した。手術からの回復に続いて、マウスは、濾過トップとのケージに維持し、オートクレーブ処理飼料適宜該ギプスを提供し、水のボトルからの水を濾過して設けられた。

楽器の調製

1. ペーパークリップやピンを使用して6スキンリトラクターを作る。ツイストがl、紙·ピンのシャンク上のペーパークリップを伸ばした一端の5センチメートルストレート鋼線を庇ワイヤの端部にフック状の単0.5センチメートル "U"を作る。
2. プラスチック製のラップを使用して、いくつかの15×15四方の手術用ドレープを作る。マウス当たり1ドレッシングを準備します。各ラップの間に紙塔を置く。
3. 12×12インチのコル​​クタイル、ガーゼ、および綿棒のスタックと一緒にすべての手術器具を滅菌する。

2.マウスの準備

1. 2％イソフルランで麻酔を誘導する。動物を計量。
2. 専用の外科準備領域では、電気シェーバーと左胸部と首の領域を剃る。
3. マウスの目に人工涙軟膏の低下を適用します。
4. クロルヘキシジン、イソプロピルアルコールで首と左胸部を除染。さらに2回繰り返します。

3.マウスオロ気管挿管および機械的人工換気

1. 予め温めておいた手術領域における非滅菌外科技術者の場所でマウス仰臥位を持っている。
2. 足のピンチに応答がないことを文書化することにより、麻酔の深さを確認してください。
3. 手を洗うと手術衣装、マスク、帽子を着用した後、無菌手術用手袋を着用。
4. ドレープと無菌技術を使用した後、喉頭を露出させ、前方半ば首オーバー1センチメートル垂直切開する。軽く湾曲し、鋸歯状の10cmの鉗子でストラップの筋肉を撤回し、ストレートハサミの先端でストラップの筋肉を広げることによって喉頭と気管を公開。
5. 経口半ば気管（ 図1A）に22 G鈍先端の血管カテーテルを挿入し、視覚的に配置します（ 図1B）を確認します。麻酔を維持し、げっ歯類の人工呼吸器を介して1〜3％イソフルランを使用して換気（;毎分200ストークスストロークあたり225μL）。 15cmのH ₂ Oの圧力限界を採用

4.マウスの肺

1. マウスの背中を向けた状態で、右側臥位でマウスを置き演算子（左側上）。無菌ドレープのように自己シールプラスチックラップを使用してください。ドレープを切断、4 ^番目と5 ^番目の肋間で肋骨に2cmの長さのカット並列を作るために鈍い傾いて湾曲したハサミを使用しています。鈍先端湾曲したハサミを挿入し、根底にある肋骨と肋間筋から離れて皮膚を解剖。
2. 正方形の1.5×1.5センチメートル外科ウィンドウ（ 図2A）を露出するために4つのリトラクターで皮膚を撤回。コルクボードにリトラクターを固定します。
3. 湾曲した鉗子を用いてリブまで細かく分析し、胸腔を入力するように湾曲した鉗子の1チップを使用しています。
4. 丸い先端マイクロはさみを使用して、胸腔を入力するように下刃を使用しています。反対方向にリブを繰り返し間で0.5cmの切開を行います。
5. 残りの2つのリトラクターを使用して、前後軸に胸部を開き、コルクボード（ 図2B）に開創を確保。
6. 左肺をつかみ、左肺動脈と気管支が（ 図3A、B）が露出するまで開胸を通って横方向及び下方に左肺の上部を変位、左手に湾曲した鈍先端が鉗子を使用。
7. 手のひらでアプリケーターとパーム（ 図3C）からポインティング曲がった先端の本体と右手にロードされたチタン血管をマイクロアプリケーターを持ち、左の後面の曲率に沿って胸部にアプリケータ先端部をスライドさせ左気管支及び肺動脈（ 図3D）の肺およびクリップ。
8. アプリケーターを取り外しますが後退し左肺を保つ。右手で鈍先端マイクロハサミを握り、クリップに気管支及び肺動脈遠位をカットし、左肺（ 図3E）を削除。
9. リブリトラクターを削除します。
10. incisiに劣る皮膚から1cmを挟まないように湾曲した鈍鉗子を使用してくださいではなく、振動板のレベルを超えて、皮膚を通して、左胸腔（ 図4A、B）への24のG血管カテーテルを挿入します。
11. 胸腔を閉じるには、4 ^番目と5 ^番目の肋骨の周りに2結節縫合を配置する5-0プロレン縫合糸を使用してください。
12. 肌のリトラクターを削除します。切開の長さに沿って皮膚を近似し、肌が閉じ接着する鉗子の二組を使用してください。
13. 血管カテーテルに3ミリリットルルアーロックシリンジを接続し、穏やかな吸引を適用し、血管カテーテルを引き出すことにより、残留空気を除去する。
14. 首の切開が以前鉗子の二組を使用して閉じた接着。

5.マウスシャム肺全摘術

1. 「マウス肺」プロトコルに記載されているように左肺を公開します。左胸腔内に空気を可能にするために湾曲した鈍鉗子を用いて胸郭を持ち上げて（ 図5A、B）。
2. 左カントーに24のG血管カテーテルを配置左肺を傷つけないように注意しながら、上記のようにracic空洞。
3. 5-0プロレン縫合糸を使用し、肺（ 図5C）を穿刺しないように注意しながら、 ^第 3 / ^第 4に縫合材料の2つの長さと5 ^番目 / 6 ^番目の肋骨隙間（ 図5D）を配置。左肺ヘルニアのリスクを軽減するために抱き合わせ前に縫合材料の両方の長さを置きます。 2、中断ステッチ（ 図5E）を作るために縫合材料を結ぶ。
4. 胸部切開上の皮膚を接着、血管カテーテルで残留空気を除去し、上記のように首の切開を接着。

6.蘇生、鎮痛、および回復

1. イソフルランの電源を切り、ブプレノルフィンの0.1 mg / kgを投与し、生理食塩水を皮下の0.5ミリリットル。
2. 自発呼吸が再開すると、気管内チューブを取り外します。
3. それが再び歩行になるまでマウスを観察します。通常resumウォーキング気管内チューブを除去した後、数分、ES。
4. O / Nを回復するために27℃のインキュベーター（加湿され、25％の酸素）でマウスを置きます。
   注：我々は、手術後の最初の24時間、ケージの床に水で湿らせた固形飼料のいくつかのペレットを配置。
5. 手術後3日間、一日二回腹腔内注射によりブプレノルフィンの0.1 mg / kgをを管理します。動物を扱うときに手術部位をオープンしないように注意してください。

7.マウスの監視

1. 手術後1、3、5、および7日目にマウスを秤量する。

結果

。PNXと偽肺の両方のための100％ - PNXと偽手術マウスの体重のプロットを図6に提供されている我々の手では、生存率は一貫して95です。右肺がこのモデルと予想される時間経過に再成長する方法の詳細については、我々はギブニーら ¹⁵及びWang らの原稿を読者に参照してください^。14

いくつかの一般的な落とし穴が正常マウスPNXとマウス偽肺手順を実行するに避けなければならない。

気管内挿管 ：マウスPNXテクニックを学ぶ多くの研究者は、気管内挿管との難しさを持っている。マウスの喉頭を前方および気管内カテーテルが声帯を通過する必要がありますされると、カテーテルが食道に合格するために、それは簡単です。 図1Aに示したように、鈍い先端がカテーテルをCURVA以下のできるだけ前方ように傾斜する必要があります正中線に沿って舌のトゥーレ、その後静かに圧力...

ディスカッション

我々はこれまでに報告マウスPNXとマウス偽PNX手順のほとんどの詳細な説明を提供してきました。私たちは、手順を学ぶ研究者は、一般的に遭遇する、と​​我々はこれらの落とし穴を軽減するために私たちの研究室が開発したいくつかの技術を概説している共通の落とし穴のいくつかの読者は意識してきた。このモデルを利用する他の研究所は、他の技術の変更を開発したか、別の商品を利用している場合があります。テクニックの違いを評価する際に、個々の研究者らは、これらの違いが大幅に実験結果に影響を与えるかどうかを決定する必要があります。

代償性肺成長のマウスPNXモデルは、肺の修復および再生の他の動物モデルよりも多くの利点を有している。ほとんどの研究室¹⁶について達成標的遺伝子欠失実験のメイク系統のトレース、過剰発現遺伝子、および一般的なトランスジェニックマウスの多数が利用可能。第二に、MOR歯槽再成長を定量するためphometric技術は、上述した¹⁷である。第三に、このモデルを採用するコストは中程度である。これらの手順が必要とする唯一の特殊な装置は、血管クリップアプ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6インチ 血管クリップ アプリケーター	テレフレックス メディカル (WECK)	137062
ホライゾン スモール チタン レッド クリップ	テレフレックス メディカル (WECK)	1201
ナロー パターン 12 cm 湾曲した鉗子	ファイン サイエンス ツール	11003-12
湾曲した鋸歯状 10 cm グレーフ鉗子	ファイン サイエンス ツール	11052-10
カストロビエホ ニードルホルダー	ファインサイエンスツール	12565-14
9cm斜視ハサミ(鈍い先端)	ファインサイエンスツール	14075-09
8.5cm硬化ファインハサミ	ファインサイエンスツール	14090-09
ストレート、鈍い先端Cohan-Vannas春のはさみ	ファインサイエンスツール	15000-12
スキングル	ーグルチャー32046
22 G血管カテーテル
24 G 血管カテーテル
3 ml ルアーロックシリンジ
4 ショートリトラクター
2 ロングリトラクター
5-0 プロレン オン カーブ カッティング ニードル	エチコン	8698G
0.5 ml シリンジ 27 G ニードル
通常の生理食塩水
Buprenorphine
Press-n-Sealラップ	ッドプロダクツカンパニー12
x 12インチコルクボードスタック	オフィスデポ
70%エタノール
ベタジン
マウスベンチレーター	ヒューゴサックスElektronnik	Miniventタイプ845
イソフルラン気化器	オーメダ	エクセル210 SE
人工涙液軟膏	Puralube	NDC:17033-211-38

ストレートストレートグラ