マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

サマリー

このビデオは、in vitroマウスの結腸直腸神経製剤で単繊維電気生理学的記録を行うためのプロトコルを示しています。

要約

このビデオでは、詳細に、マウスの大腸-神経準備を用いたin vitroの単繊維電気生理学的記録プロトコルを示しています。アプローチは公平な識別と個々の大腸求心性の機能解析を可能にします。 1または少数の求心性から生じる伝播し活動電位（APS）の細胞外記録は（ すなわち、単一ファイバ）大腸内受容野（RFS）はからかわ神経線維線維束から作られています。大腸は、骨盤（PN）または腰椎内臓（LSN）神経取り付けられており、縦方向に開いたのいずれかで削除されます。組織は、記録チャンバーに入れ、平らに固定し、酸素化クレブス溶液で灌流される。フォーカル電気刺激は、機能的に5 mechanosensiに求心性神経を分類するために、さらに三つの異なる機械的刺激によってテストされている大腸求心性終末を、（プロービング、粘膜なでると周ストレッチを鈍ら）を見つけるために使用されます電性のクラス。これらの機械的刺激のいずれにも応答エンディングは、機械的に小文字を区別しない求心性（MIA​​s）に分類される。機械受容およびMIAs両方は、化学物質へのRFの局所露光部（ 例えば、炎症性スープ（IS）、カプサイシン、アデノシン三リン酸（ATP））によって（ すなわち、強化された応答を低減閾値、および/ ​​または機械的感受性の取得）感作のために評価することができる。私たちは、機器や結腸直腸-神経録音の準備、添付のPNまたはLSNと大腸の収穫、大腸内のRFの識別、神経線維束から単心記録、およびRFへの化学物質のローカライズされたアプリケーションを記述する。また、標準化された機械的な刺激の準備とアプリケーションの課題も議論されている。

概要

疼痛および過敏症が明らかに病理学的原因または組織損傷の非存在下で存在する過敏性腸症候群（IBS）を含む機能性胃腸障害に罹患している患者の主な不満である。例えば、IBS患者は、体の紹介（腹部の触診に、すなわち、圧痛^）1の直腸バルーン膨満への応答を高め、正常な腸機能の間に感受性の増加、ならびに過敏を含む過敏症を呈する。大腸求心性神経を標的にすること（局所麻酔薬^2,3の例、直腸内点滴注入、グアニル酸シクラーゼ-Cアゴニストリナクロチド^4-6の経口摂取）をIBS患者の痛みや過敏症を緩和するのに有効であることが証明されているため、理解の向上大腸の求心性神経支配が重要です。

大腸求心性神経を含む内臓求心性神経、化学/ nutrient-および熱モダリティ（ 例えば^、7-9）に応答することができる。機械的な刺激（ 例えば、管腔膨満、ストレッチ）は、一般的に不快感や痛み^10-16含め意識的な感覚、を生じさせるものであるので、機械的刺激（ すなわち、機械受容求心性神経）への対応内臓求心性神経は、最も徹底的に研究されている。また、内臓はまた、一般的に、機械的に区別しない求心性（MIAs）によって神経支配サイレントまたは眠っ侵害受容器¹⁷と呼ばれ^ている。正常な生理的条件下では、MIAsは機械的な刺激に応答したり、持っていない非常に高い応答が^18をしきい値が、アクティブになり、病態生理学的状態において機械的感受性を取得し、過敏症に寄与することができる。

ここに記載のインビトロ調製およびプロトコルを使用して、我々は、海に電気刺激戦略を開発し、採用大腸¹⁹の両方の機械受容とMIA終末の公平な識別を可能に受容語尾のためRCH。結腸直腸の神経支配は腰部内臓（LSN）および骨盤神経（PN）経路に由来し、5機械受容クラス（漿膜、粘膜、筋肉、筋肉、粘膜、腸間膜）と一つMIAクラス²⁰に分類することができる直腸求心性線維を含む。このインビトロ準備を使用して、我々は大腸MIAs獲得した機械的感受性がLSN経路においてPN経路におけるMIAsの71％とMIAsの23％増感炎症スープ（IS）、への受容野の簡単な露出以下（感作）ことがわかった^19。また、（ザイモサン²¹または2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸^（TNBS）22で結腸内処置を受けたマウス、すなわち、）長期間持続する行動内臓過敏の文脈でMIAsの（28日まで）の長期感作を文書化。

機械受容求心性神経のうちjove_content ">、筋肉と筋肉の粘膜求心性は持続的に大腸の周ストレッチをエンコード（ すなわち、ストレッチと小文字が区別されます）と有害な結腸直腸拡張^23,24のエンコーディングを補助する唯一のクラスである。コンピュータ制御を使用して、フォースアクチュエータは、均質で、基準を適用し、かつ再現性が平坦化された大腸組織とさらに分類ストレッチセンシティブ求心低閾値および高閾値²³の周方向に伸縮性を上げ、また、伸縮性の感作の時間経過を結腸内ザイモサン²¹またはTNBS ²²治療後の感受性求心性内臓痛および過敏でストレッチに敏感な大腸求心性神経の役割を示唆し、行動内臓過敏の発症、持続性、および/ ​​または回復に対応している。

プロトコル

注：このプロトコルを見直し、ピッツバーグ大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された。

修正クレブス溶液と試験薬品アリコートの調製

1. 117.9のNaCl、4.7のKCl、25のNaHCO _3、1.3のNaH ₂ PO _4、1.2をMgSO _4、2.5のCaCl _2、11.1 D-グルコース、2酪酸ナトリウム、20酢酸ナトリウム（単位はmM）を含有する改変クレブス液を6 Lを作る0.004ニフェジピン（自発的な筋収縮をブロックする）、及び0.003インドメタシン（内因性プロスタグランジンの合成をブロックする）。それぞれ、組織切開とシングルファイバー記録に氷のように冷たいと暖かいクレブスのソリューションを使用してください。
2. 任意の化学溶液を調製する（ 例えば、IS、カプサイシン、ATP）は、所望の濃度の分量で。

結腸直腸-神経組織の2解剖

1. 中（30グラム - - 8週齢、20 6）雄マウスを麻酔し、安楽死させるマウスは、胸部の動きの欠如によって示されるように、完全に呼吸が止まるまで、毎分チャンバ容積の30％ - 10を変位させる流量でCO ₂室。
2. 直ちに、胸部室切開右心房を穿孔し、氷冷したクレブスの十分な体積（〜500ml）中でのマウスカーカスを浸漬することにより安楽死、放血させると、以下の（4°C）溶液カルボゲン（95％O ₂でバブリング、5％CO _2）。
3. 慎重にすべての内臓が、コロンと骨盤臓器を取り除く。少し横隔膜より上T12脊髄分節全体の半分にマウスを横断すると氷の寒さを含む解剖室に尾側半分を転送し、クレブス溶液を泡立て。
4. 実体顕微鏡下では、尿道への接合部で離断によって膀胱と生殖器官を削除し、それが総腸骨動脈に分岐するまで下行/腹部大動脈を削除します。 PNまたはそれらのsurroundinからLSNを解放鈍的切開によるグラム組織および（PN用）L6とS1脊柱または（LSN用）T13とL1脊柱へのその腹側のエントリポイントまでの腸骨稜の外から神経に従ってください。
5. 恥骨結合と左右の寛骨臼関節を切断し、腸骨を取り除く。神経が脊柱に入る場所まで、大腸に近いから添付の筋肉や結合組織からのPNまたはLSNのどちらかを慎重無料。
6. 慎重に遠位大腸を露出するように腸骨を切除。連続で添付PNまたはLSNと遠位大腸を解剖。
7. 組織室の浴コンパートメントに装着神経と直腸を転送します。さらに切開により過度の結合組織を外し、抗腸間膜の国境に沿って縦方向に大腸を開きます。
8. 上に向け粘膜側では、chambeのシリコーンベースに記録コンパートメントに隣接した結腸直腸腸間膜エッジをピンrおよび力アクチュエータに接続されたフックのレーキに大腸のantimesenteric長さを取り付け（ 図1に示され、 図2Aで撮影）。
9. マウスの穴とゲートで風呂コンパートメントに接続されている記録をコンパートメントの中にPNまたはLSNを拡張します。静かに神経接着させるための親水性表面を提供記録コンパートメント、小さなガラスミラーに神経幹を置く。暖かいと一緒にお風呂コンパートメントSuperfuse（30から32°C）を、Krebs溶液を酸素化し、鉱物油との記録コンパートメントを埋める。

3.シングルファイバーの記録と受容野の局在

1. 慎重に高倍率（ - 60X 50）での実体顕微鏡下でPNまたはLSNから神経上膜（神経鞘）をバックはがします。 〜100μmの厚さの8神経束 - 細かい鉗子を使用して、5に神経幹をいじめる。
2. 白金 - イリジウムリファレンスを置き組織チャンバ内のクレブス溶液と接触する電極。順次同一の材料からなる記録電極上に個々の神経束を置く。
3. 穏やかになでることで大腸表面下大腸求心性神経からのAPを呼び起こすために柔らかいペイントブラシを使用してください。検出可能なAP（活動電位）の録音を通じてコロンを支配する神経束（s）を見つけます。
   注：PNとLSNも膀胱や他の骨盤内の臓器を支配する。
4. さらに〜10μmの厚さの細い束のフ​​ィラメントに神経束を分割し、記録電極上に個々のフィラメントを配置するために30 G針先端のペアを使用してください。
5. 電気的に現在のスプレッドの〜2mmの半径を生成閾値上の刺激強度（10ミリアンペアの大きさ、0.3 Hzの@ 0.5ミリ秒の持続時間）、での求心性終末を励起するために粘膜表面に垂直なラウンドが先端に付いた同心円状の電極を配置します。体系的に電極を移動（〜1.5ミリメートルステップ）受容語尾をローカライズする扁平な大腸の長さと幅に沿って。
6. 求心性エンディングが励起されると、最小刺激強度（刺激しきい値）を必要とする活性化（受容野、RF）のサイトを特定するための電極位置を調整します。 > 3ミリアンペア¹⁹刺激閾値と語尾を破棄。
7. 刺激アーチファクトと活動電位の開始との間の受容野（RF）での刺激電極と記録部位および2）伝導遅延（ 例えば、 図2B）との間の距離）1から伝導速度（CV）を計算する。
   CV（10m /秒）=距離（mm）/伝導遅延（ミリ秒）。

機械受容大腸求心性神経の4機能分類

1. 電気刺激によってRFを見つけた後、RFに、次の3つの機械的刺激を適用します。
   1. Calibraでの先端を押して、プロービング刺激を実施テッド·フォン·フレイのようなナイロンモノフィラメント（0.4および1グラム力）垂直に平坦化された大腸上のRF向けた。
   2. 穏やかRF小さな表面せん断応力を生成するために細かいナイロンフィラメントストランド（10 mgの力）で大腸粘膜をなでることでなでる刺激を行う。
   3. ステップ2.8に記載されてフックのレーキを介して大腸の抗腸間膜縁に沿って円周方向に（ -は5mN /秒で170 MN 0）傾斜伸縮力を提供し、コンピュータ制御の力アクチュエータを用いて円周ストレッチを行う。
2. 漿膜として、粘膜を（プロービング平滑末端にのみ反応する）求心性神経を分類筋肉（周ストレッチに対応し、プロービング平滑）筋肉/粘膜を（周ストレッチ、粘膜なでるに対応し、プロービング平滑）、または、（なでる粘膜およびプロービング平滑末端に反応する） MIA（三機械的刺激のいずれかに応答しない）。
3. だけで（腸間膜求心性神経のために、電気刺激によって選択的に活性化する腸間膜のプロービング/機械的なストロークによってそれらの受容語尾を見つけることが困難なLSNの神経支配）。
4. ストレッチに敏感な求心性（筋肉と筋肉の粘膜）の場合は、傾斜のストレッチ中に最初のAPを呼び起こす力として定義されている応答閾値を決定する。
5. 漿膜求心性神経のために、コンピュータ制御力アクチュエータで駆動される受容野のプロービング点状のレベルを昇順に彼らの応答を記録。

5.化学アプリケーション/受容性終末のモジュレーション

1. 機械的な刺激に対するベースライン応答を記録（ すなわち、傾斜ストレッチ、プロービング点状、または粘膜ストロークへの応答）。
2. コートチューブの一片（真鍮やステンレス鋼、10ミリメートル、高と4×4ミリメートル²正方形または4〜5ミリメートルの直径）の下端ワセリンとし、大腸に受容野の上に置きます。
3. 削除するチューブ内部のクレブス溶液、および3の受容エンディングさらす - 試験される化学物質（単数または複数）を含む溶液の170μlに5分。
4. 化学アプリケーションの間の求心性の応答を監視します（一部の求心性神経は、化学感受性である）。
5. 化学物質の作用を終了させる薬液とチューブを外します。 4内 - 6分、ベースライン応答と同様に機械的刺激への求心性応答をテストします。
6. ウォッシュアウト（> 15分）の十分な期間の後に再び機械的刺激を再適用します。

6.録音および識別APスパイク

1. 20 kHzで軸索から記録された電気信号をデジタル化し、コンピュータにデータを保存します。オーディオモニターにより、オンラインの信号を監視します。
2. オフラインAPスパイクを分析し、個々のスパイク波形²⁵の主成分分析に基づいて、単一のユニットを区別する。
   注：Oneレコードがこれ以上目を含める必要があります2簡単に識別可能なアクティブユニット。

結果

セットアップは、 図1に示されている。これは、シリコーン裏打ち浴区画と隣接する鉱物油が充填されたコンパートメントで取り付け神経における大腸を収容するカスタムメイドの組織チャンバを含む。二区画室は、CNC機によるアクリルプラスチックの固体ブロックから機械加工された。両方の区画の底部は、その後の結腸直腸組織の下に簡単にピンを許可するようにしっかりとシリコンが並んでました。いじめ神経線維束から外APは高コモンモード除去比（CMRR〜60デシベル）で低ノイズ、バッテリ駆動の差動増幅器を使用して記録されている。増幅器の利得は0.3〜10 kHzでx10,000バンドフィルタの範囲に設定されている。結腸直腸の電気刺激は、結腸直腸粘膜に接触して同心円状の電極を介して定電流モードで光学的に結合された刺激装置によって送達される。機械的刺激（大腸ストレッチと点状のプロービング）は交流によって配信されるomputer制御力アクチュエータ。 AD変換器および適切なソフトウェアは、機械的および電気的刺激、ならびに記録を開始するために、電圧指令の出力を送信し、差動増幅器から外AP信号をデジタル化することによって、両方の刺激および記...

ディスカッション

ここに記載のインビトロ結腸直腸神経準備がうまく内臓感覚ニューロン上の他の非機能的アプローチ（ 例えば 、細胞、分子、および組織学的研究）を補完する個々の結腸直腸求心性の神経エンコーディング機能（研究するための強力なアプローチであることが証明され）詳細についてはレビュー^27を参照してください。痛覚および長期直腸過敏症に寄与神経メカニズムが明らかにされている薬理学的操作は、内臓痛を軽減する可能性の目標を明らかにしたことが行われている。この準備の実装を成功に関連した以下のキーポイントは、以下で説明されています。電気的ノイズの1）削減、信号検出では2）の増加、および求心性エンコーディングの変化を評価するための標準化された刺激の3）選択。また、この技術のいくつかの制限について検討した。

活動電位（APS）propagati130 mVの - 神経軸索に沿って細胞内にngの通常100の膜電位を持っている。しかし、軸索の膜の小さな特定の容量に、この比較的大きな脱分極は、簡単に電気インピーダンスはかなり低く持って周囲の細胞外組織/間質液（に...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ライカMZ16実体顕微鏡	ライカマイクロシステムズ株式会社
ライカ IC D カメラ	ライカマイクロシステムズ株式会社
アンプ	・ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ株式会社	SYS-DAM80	低ノイズ差動増幅器
2コンパートメントティッシュチャンバー	カスタムメイド
Power1401	Cambridge Electronic Design Limited	Power1401	データ収集、アナログ信号入出力
Spike2 v5.02	Cambridge Electronic Design Limited		Power1401
オーディオモニター	Natus	Amと連携するソフトウェアパッケージ
方形パルス刺激装置	Natus	S48	電気刺激を与える
光電絶縁ユニット	Natus	PSIU6	ノイズを低減する刺激絶縁
同心円状バイポーラ微小電極	FHC Inc.	CBFFG75	電気刺激を届ける
デュアルモードレバーシステム	オーロラサイエンティフィック株式会社	シリーズ300C	、機械的な刺激を与えるために
鉗子	ファインサイエンスツール	11252-00	細かい先端を持つ鉗子